Name: detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase
Uploaded: 2017-12-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase at JoVE.com

أيد هذا العمل AI099854 المعاهد الوطنية للصحة، و AI126742 إلى المفتاح.

1-الحث على بفف في التعبير في كولاي
<ol><li>
إضافة 1 ميكروليتر من بفف في التعبير بلازميد (10 نانوغرام/ميكروليتر) إلى 20 ميكروليتر من بليس BL21(DE3) كولاي (20 ميكروليتر قاسمة من الخلايا المتوفرة تجارياً قد > 2 × 106 ميكروغرام/زيمبابوي بلازميد) في أنبوب 1.5 مل. المزيج بلطف بالإصب?...

<ol>
	<li>Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+nuclease+contamination+during+purification+of+recombinant+prototype+foamy+virus+integrase.">Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase.</a> J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).</li><li>Senavirathne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+nuclease+contamination+in+commonly+used+oxygen-scavenging+systems.">Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems.</a> Nat Methods. 12 (10), 901-902 (2015).</li><li>Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orthogonal+single-molecule+experiment+reveals+multiple-attempt+dynamics+of+type+IA+topoisomerases.">An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases.</a> Nat Struct Mol Biol. 24 (5), 484-490 (2017).</li><li>Valkov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+characterization+of+the+integrase+from+the+prototype+foamy+virus.">Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).</li><li>Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Retroviruses. , (1997).</li><li>Li, M., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+viral+DNA+ends+channels+the+HIV-1+integration+reaction+to+concerted+integration.">Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration.</a> J Biol Chem. 280 (32), 29334-29339 (2005).</li><li>Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+DNA+integration:+reaction+pathway+and+critical+intermediates.">Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates.</a> EMBO J. 25 (6), 1295-1304 (2006).</li><li>Sinha, S., Grandgenett, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+exhibits+a+capacity+for+full-site+integration+in+vitro+that+is+comparable+to+that+of+purified+preintegration+complexes+from+virus-infected+cells.">Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells.</a> J Virol. 79 (13), 8208-8216 (2005).</li><li>Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerted+integration+of+retrovirus-like+DNA+by+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase.">Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase.</a> J Virol. 69 (10), 6090-6097 (1995).</li><li>Vora, A. C., Grandgenett, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+catalytic+properties+of+retrovirus+integrase-DNA+complexes+capable+of+efficiently+performing+concerted+integration.">Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration.</a> J Virol. 69 (12), 7483-7488 (1995).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nat Commun. 7, 11409 (2016).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li></ol>

المؤتلف البروتينات التي تتفاعل مع الحمض النووي، مثل إصلاح الحمض النووي البروتينات، الزبالين الأكسجين لتطبيقات الميكروسكوب جزيء واحد، أو إينتيجراسيس للفيروسات الرجعية، ينبغي أن تكون خالية من تلوث جرثومي نوكليسيس2،3. قد يسبب ارتباكا هذه الملوثات تفسير الن...

دراسات جزيء البيوكيميائية وواحد من تفاعلات البروتين مع الحمض النووي تتطلب البروتينات المؤتلف استثنائية نقية. تلوث نوكليسيس من البكتيريا يمكن أن تحجب نتائج هذه الاختبارات. تم العثور على نوكلاس تلويث في الأعمال التحضيرية للبروتينات المؤتلف الأكسجين الكاسح بروتوكاتيتشواتي-3 و 4-ديوكسيجيناسي (PCD) ونموذج مزبد الفيروس (فف) إينتيجراسي (في) المعزولة من الإشريكيّة القولونية (كولاي)1 , 2 , 3.
فحوصات التكامل للفيروس تعتمد على تحويل الحمض النووي سوبيركويليد للمنتجات رصدت أو الخطي كتدبير في النشاط4. خلال العدوى الخلوية ينضم في طرفي كدنا الفيروسية الكروماتين المضيف5. ويطلق على كل نهاية الانضمام إلى رد فعل نقل حبلا. فحوصات المؤتلف في النشاط قد ينضم إلى اثنين الحمض النووي ليغومرات محاكاة كدنا الفيروسية وينتهي إلى هدف الحمض النووي في تكامل منسقة رد فعل4،5،6،،من78. وبدلاً من ذلك قد المؤتلف في الانضمام إلى واحدة فقط من نهاية الحمض النووي في موقع نصف ذات صلة غير فسيولوجيا تكامل رد فعل9،10. عندما سوبيركويليد بلازميد الحمض النووي هو الهدف من التكامل، التكامل متضافرة منتجات خطيا الحمض النووي ومنتجات التكامل الموقع نصف الدوائر استرخاء. يتم تعريف هذه المنتجات رد فعل بقدرتهم النسبية على الحركة أثناء [اغروس] هلام التفريد1. إذا كان في المؤتلف تلويث نوكلاس، سيكون هناك دوائر استرخاء زائفة أو بلازميد ربما تطبق الخلط بين النتائج التجريبية. قد يكون المسمى ليغومرات الحمض النووي الفيروسي فلوريسسينتلي شكل قاطع تحديد المنتجات التكامل، بدلاً من المنتجات نوكلاس. ومع ذلك، في تفضل كثيرا سوبيركويليد الحمض النووي الأهداف؛ ويمكن أن تحرف أي خسارة في بلازميد سوبيركويليد إلى دوائر استرخاء أو الحمض النووي الخطي بتلويث نوكلاس النتائج وتفسير البيانات11. وبالتالي من الضروري إزالة nucleases البكتيرية من الفيروسات التراجعية في الأعمال التحضيرية.
في فف لها صلة مختلفة عن الهيبارين سيفاروسي مقارنة بال نوكلاس البكتيرية1. قد تكون مفصولة في فف ونوكلاس شطف تدرج خطي من الهيبارين سيفاروسي. عدم الكشف عن نوكلاس سهولة امتصاص الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) 280 نانومتر ذروة أو الصوديوم التحليلية دوديسيل كبريتات polyacrylamide هلام التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة). بدلاً من ذلك، يتم الكشف عن نوكلاس بمقايسة نشاط نوكلاس استخدام تحويل بلازميد سوبيركويليد إلى دوائر استرخاء أو المنتجات الخطية. يتم اختبار كل جزء بعد الهيبارين سيفاروسي اللوني لنشاط نوكلاس. في فف والملوث نوكلاس قد لا فرق في تقارب عن راتنج شاردة مونو-Q. هناك فرق صغيرة في تقارب عن الراتنج الموجبة مونو-S. ومع ذلك، لا يسمح القرار مونو-S نوكلاس البكتيرية وفي فف كفاءة فصل البروتينات. وفي نهاية المطاف، الهيبارين سيفاروسي انجذاب تطهير يقدم أفضل فصل نوكلاس البكتيرية من فف في وفي الاستفادة من حجم التحميل غير محدود.
اختبار لتلويث نوكلاس النشاط يمكن تكييفه مع غيرها من البروتينات. بروتين الفائدة من المحتمل أن يكون الخصائص تقارب البديلة مما في فف؛ ويجب تحديد الفرق في ربط خصائص البروتين الفائدة والملوث نوكلاس تجريبيا. قد تكون هذه المنهجية لتحديد التلوث nuclease تتكيف مع الراتنجات الأخرى بما في ذلك الموجبة مونو-S أو راتنجات تبادل شاردة مونو-Q. راتنجات التبادل الأيوني وتقارب قد توفر طريقة موثوقة لعزل بروتين المؤتلف من الفائدة من تلويث nucleases مع أي قيود على حجم البروتين خلال الفصل اللوني.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="682">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BL21/DE3 Rosetta E. coli</td>
			<td style="width:180px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">70956-4</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB broth</td>
			<td style="width:180px;">EMD biosciences</td>
			<td style="width:119px;">1.10285.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloramphenicol&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IPTG&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:119px;">CI8280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ZnCl2</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">208086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Ultra Pure</td>
			<td style="width:180px;">Gojira Fine Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">UTS1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:180px;">P212121</td>
			<td style="width:119px;">RP-S23020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PMSF&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imidazole&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DTT&#160;</td>
			<td style="width:180px;">P212121</td>
			<td style="width:119px;">SV-DTT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure EDTA</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen/Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:119px;">CA3510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">G37-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ni-NTA Superflow</td>
			<td style="width:180px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">30430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Heparin Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td style="width:180px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0998-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HRV14 3C protease&#160;</td>
			<td style="width:180px;">EMD Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">71493-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase

بروتين إينتيجراسي (في) لفي النموذج الفيروس مزبد (فف) إنزيم نموذج لدراسة إليه التكامل للفيروسات الرجعية. مقارنة من الفيروسات القهقرية الأخرى، في فف القابلة للذوبان أكثر وأكثر قابلية للمعالجة التجريبية. بالإضافة إلى ذلك، فإنه حساس لمثبطات في ذات الصلة سريرياً فيروس نقص المناعة البشرية (فيروس نقص المناعة البشرية-1)، مما يدل على أن الآلية الحفازة في فف مماثلة إلى أن من "تلبيتها،" فيروس نقص المناعة البشرية-1 يحفز التساهمية ضم الحمض النووي التكميلية الفيروسية (كدنا) للهدف ودعا الحمض النووي في عملية نقل حبلا. ويدخل هذا رد فعل نقل حبلا نيكس إلى الهدف الحمض النووي. يمكن مرتبك تحليل إدماج نواتج التفاعل بوجود نوكليسيس أن المثل نك الحمض النووي. لقد ثبت نوكلاس جرثومي لتنقية يشترك مع المؤتلف في فف المعرب عنها في الإشريكيّة القولونية (كولاي). هنا يصف لنا طريقة لعزل في فف من نوكلاس تلويث من الهيبارين التقارب اللوني. ويجري فرز الكسور بسهولة للتلوث نوكلياسي مع بلازميد سوبيركويليد و [اغروس] هلام التفريد. في بفف و nuclease تلويث عرض الانتماءات البديلة سيفاروسي الهيبارين مما يسمح إعداد خالية nuclease المؤتلف بفف في مناسبة لتحليل جزيء البيوكيميائية أو واحد الجزء الأكبر من التكامل.

المؤتلف فف في كثير من الأحيان ملوثة نوكلاس بكتيرية1. فحوصات التكامل البيوكيميائية تعتمد على كوانتيتيشن لتحويل سوبيركويليد بلازميد الحمض النووي للدوائر استرخاء ومنتجات الخطي. يمكن أن يؤدي وجود نوكلاس تلويث إلى كوانتيتيشن زائفة لهذه الاختبارات. التعبير في فف مع علامة هيكساهي...

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase at JoVE.com

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

هي غالباً ما تكون ملوثة البروتين integrase فيروس مزبد النموذج المؤتلف مع نوكلاس بكتيرية أثناء تنقية. هذا الأسلوب يعرف التلوث نوكلاس وإزالته من التحضير النهائي للانزيم.

كشف وإزالة التلوث Nuclease أثناء تنقية Integrase فيروس مزبد النموذج المؤتلف

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

توليد المؤتلف فيروسات الأنفلونزا من الحمض النووي البلازميد

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

الكشف عن الفيروسات المعدية التي جمعت من الحقل عن طريق البعوض فيرو خلية الفحص الثقافة

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

الإنتاجية العالية لطريقة الكشف عن فيروس الإنفلونزا

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

تنقية تقارب من المجمعات الأنفلونزا فيروس بروتين نووي ريبوزي من لونين من الخلايا المصابة

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

في الجسم الحي التصوير كشفها (IVIS) نظم لفيروس العصبية الغازية ملتهب الدماغ

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

الانقاذ من الفيروسات المؤتلف مرض نيوكاسل من [كدنا]

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

إنقاذ وتوصيف الفيروسات المؤتلف من عالم جديد زيكا الفيروسات استنساخ العدوى

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

الجمعية وتنقية من النموذج إينتاسوميس فيروس مزبد

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

استخراج سريعة وآمنة وبسيطة دليل السرير الحمض النووي للكشف عن الفيروس في عينات الدم كله

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

وأعرب عن تحديد الترميز وفئات الحمض النووي الريبي غير الترميز في الخنازير الدم كله

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...