Name: detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase
Uploaded: 2017-12-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase at JoVE.com

Эта работа была поддержана низ AI099854 и AI126742 к ключу.

1. побудить PFV в выражении E. coli
<ol><li>
Добавить 1 мкл PFV в выражение плазмида (10 нг/мкл) 20 мкл pLysS E. coli BL21(DE3) (20 мкл Алиготе коммерчески доступных клеток имеет > 2 х 106 кое/мкг плазмида) в 1,5 мл. Смешайте нежно палец нажатие или стряхивая трубки. Инкубируйте на льду 5 ми?...

<ol>
	<li>Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+nuclease+contamination+during+purification+of+recombinant+prototype+foamy+virus+integrase.">Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase.</a> J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).</li><li>Senavirathne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+nuclease+contamination+in+commonly+used+oxygen-scavenging+systems.">Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems.</a> Nat Methods. 12 (10), 901-902 (2015).</li><li>Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orthogonal+single-molecule+experiment+reveals+multiple-attempt+dynamics+of+type+IA+topoisomerases.">An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases.</a> Nat Struct Mol Biol. 24 (5), 484-490 (2017).</li><li>Valkov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+characterization+of+the+integrase+from+the+prototype+foamy+virus.">Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).</li><li>Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Retroviruses. , (1997).</li><li>Li, M., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+viral+DNA+ends+channels+the+HIV-1+integration+reaction+to+concerted+integration.">Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration.</a> J Biol Chem. 280 (32), 29334-29339 (2005).</li><li>Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+DNA+integration:+reaction+pathway+and+critical+intermediates.">Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates.</a> EMBO J. 25 (6), 1295-1304 (2006).</li><li>Sinha, S., Grandgenett, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+exhibits+a+capacity+for+full-site+integration+in+vitro+that+is+comparable+to+that+of+purified+preintegration+complexes+from+virus-infected+cells.">Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells.</a> J Virol. 79 (13), 8208-8216 (2005).</li><li>Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerted+integration+of+retrovirus-like+DNA+by+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase.">Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase.</a> J Virol. 69 (10), 6090-6097 (1995).</li><li>Vora, A. C., Grandgenett, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+catalytic+properties+of+retrovirus+integrase-DNA+complexes+capable+of+efficiently+performing+concerted+integration.">Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration.</a> J Virol. 69 (12), 7483-7488 (1995).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nat Commun. 7, 11409 (2016).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li></ol>

Рекомбинатные протеины, которые взаимодействуют с ДНК, такие как ДНК ремонт белков, мусорщиков кислорода для одной молекулы микроскопии приложений, или антиретровирусного лечения integrases, должна быть свободна от заражения бактериальной nucleases2,3. Эти загря?...

Биохимические и одной молекулы исследования взаимодействий протеина с ДНК требуют исключительно чистым рекомбинантных белков. Заражение nucleases от бактерий может скрывать результаты этих анализов. Загрязняющие нуклеиназы были найдены в подготовке рекомбинантных белков кислород мусорщик protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) и прототип пенистый вирус (PFV) интегразы (IN) изолированы от Escherichia coli (E. coli)1 , 2 , 3.
Антиретровирусного лечения интеграции анализов полагаются на преобразование supercoiled ДНК одноцепочечным или линейные продукты как мера в деятельности4. Во время сотовой инфекции в присоединяется к два концы вирусный cDNA принимающей хроматина5. Каждый конец присоединения реакции называется стренги передачи. Анализы из рекомбинантных в деятельности могут вступать два ДНК олигомеров подражая вирусный cDNA заканчивается к целевому ДНК в согласованной интеграции реакции4,5,6,,7,8. В качестве альтернативы рекомбинантных в могут вступать только один конец ДНК в9,реакция-физиологически соответствующих половину сайта интеграции10. Когда supercoiled плазмида ДНК является целью интеграции, согласованной интеграции, которую продукты линеаризованных ДНК и половину сайта интеграции продукты расслабленной кругах. Эти продукты реакции идентифицируются по их относительной мобильностью во время электрофореза геля агарозы1. Если рекомбинантных в загрязняющих Нуклеаза, будет ложное расслабленной круги или возможно линеаризованного плазмида смешения экспериментальные результаты. Вирусной ДНК олигомеров может называться дневно окончательно определить интеграции продуктов, в отличие от нуклеиназы продуктов. Однако в значительной степени способствует supercoiled ДНК целей; любые потери supercoiled плазмиды расслабленной круги или линейной ДНК, загрязняющих нуклеиназы может исказить результаты и интерпретации данных11. Таким образом важно, чтобы удалить бактериальный nucleases из антиретровирусные препараты.
В PFV имеет различные сродство sepharose гепарина, по сравнению с бактериальным нуклеиназы1. PFV IN и нуклеиназы могут быть разделены линейного градиента элюирование с гепарином sepharose. Нуклеаза не обнаруживается легко ультрафиолетового (УФ) поглощения пика 280 Нм или аналитических натрия Додециловый сульфат электрофореза геля полиакриламида (SDS-PAGE). Вместо этого нуклеиназы обнаруживается нуклеиназы деятельности пробирного, используя преобразование supercoiled плазмид в расслабленной круги или линейные продукты. Каждая фракция после гепарина sepharose хроматографии проверяется на нуклеиназы деятельности. В PFV и загрязнителем нуклеиназы имеют никакой разницы в сродство для моно-Q анионообменных смол. Существует небольшая разница в сродство для моно-S катиона смолы. Однако моно-S резолюции бактериальных нуклеиназы и PFV в не позволит эффективное разделение белков. В конечном итоге очищение сродства sepharose гепарина предлагает лучшее разделение бактериальной нуклеиназы PFV в и имеет то преимущество, неограниченные загрузки тома.
Тестирование для загрязнения нуклеиназы активности могут быть адаптированы для других белков. Протеин интереса, вероятно, будет иметь альтернативные соответствия характеристик чем PFV IN; разница в обязательную силу характеристики протеина интереса и загрязняющими нуклеиназы должна определяться эмпирически. Эта методология для определения нуклеиназы загрязнения могут быть адаптированы к другим смолам, включая моно-S катион или моно-Q анионообменных смол. Аффинити и ионообменных смол может предложить надежный метод для изоляции рекомбинантных белков интересов от загрязнения nucleases без ограничений на объем белка во время хроматографии.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="682">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BL21/DE3 Rosetta E. coli</td>
			<td style="width:180px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">70956-4</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB broth</td>
			<td style="width:180px;">EMD biosciences</td>
			<td style="width:119px;">1.10285.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloramphenicol&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IPTG&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:119px;">CI8280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ZnCl2</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">208086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Ultra Pure</td>
			<td style="width:180px;">Gojira Fine Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">UTS1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:180px;">P212121</td>
			<td style="width:119px;">RP-S23020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PMSF&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imidazole&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DTT&#160;</td>
			<td style="width:180px;">P212121</td>
			<td style="width:119px;">SV-DTT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure EDTA</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen/Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:119px;">CA3510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">G37-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ni-NTA Superflow</td>
			<td style="width:180px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">30430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Heparin Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td style="width:180px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0998-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HRV14 3C protease&#160;</td>
			<td style="width:180px;">EMD Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">71493-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase

Интегразы (IN) белок ретровируса прототип пенистый вируса (PFV) является фермент модель для изучения механизма ретровирусной интеграции. По сравнению с в других ретровирусов, PFV в более растворимые и более пригодным для экспериментальных манипуляций. Дополнительно он чувствителен к ингибиторам в клинически значимых вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ-1), предполагая, что каталитического механизма в PFV похож на что из ВИЧ-1 дюйма в катализирует ковалентных присоединения вирусных комплементарной ДНК — (cDNA кДНК) целевой ДНК в процесс называется стренги передачи. Эта реакция передачи стренги вводит Никс ДНАО цели. Анализ интеграции продуктов реакции может быть confounded с присутствием nucleases, которые аналогичным образом Ник ДНК. Было показано, что бактериальные нуклеиназы совместно очищают с рекомбинантным PFV IN, выраженная в Escherichia coli (E. coli). Здесь мы описываем метод, чтобы изолировать в PFV от загрязняющих нуклеиназы хромотографией сродства гепарина. Фракций легко проверяются для нуклеиназы загрязнения с supercoiled плазмиды и электрофорез геля агарозы. PFV IN и загрязняющих нуклеиназы отображения альтернативных сходство для гепарина sepharose, позволяя нуклеиназы бесплатная подготовка рекомбинантных PFV в подходит для массового анализа биохимических или одной молекулы интеграции.

Рекомбинатные PFV в часто бывает загрязнена бактериальной нуклеиназы1. Интеграции биохимических анализов зависят от quantitation преобразование supercoiled плазмидной ДНК расслабленной круги и линейные продукты. Присутствие загрязняющих нуклеиназы может привести к ложным количест?...

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase at JoVE.com

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Рекомбинантных прототип пенистый вирус интеграза белок часто бывает загрязнена бактериальной нуклеиназы во время очистки. Этот метод определяет нуклеиназы загрязнения и удаляет его из окончательной подготовки фермента.

Обнаружение и удаление нуклеиназы загрязнения во время очистки рекомбинантных прототип пенистый вирус интеграза

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Генерация рекомбинантного вируса гриппа от ДНК плазмиды

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Выявление инфекционных Касперского с поля, собранные Комары от Vero Пробирной культуры клеток

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Высокая пропускная способность Метод обнаружения для вируса гриппа

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Affinity очистки вируса гриппа рибонуклеопротеидных комплексов с хроматина инфицированных клеток

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

В Vivo Imaging Systems (ИВИС) Обнаружение Нейро-инвазивная Вирус энцефалита

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Спасение рекомбинантный Ньюкасл вирусное заболевание из кДНК

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Спасение и характеристика рекомбинантного вируса из нового мира Инфекционный клон вируса Зика

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

Ассамблея и очистки прототип пенистый вирус Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Быстрый, безопасный и простой ручной прикроватные нуклеиновой кислоты извлечения для обнаружения вируса в пробах цельной крови

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

Идентификация и кодирования кодирование классы РНК выражена в свином цельной крови

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...