Name: detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase
Uploaded: 2017-12-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase at JoVE.com

Detta arbete stöds av NIH AI099854 och AI126742 till nyckel.

1. framkalla PFV i uttrycket i E. coli
<ol><li>
Tillsätt 1 μL i PFV i uttrycket plasmid (10 ng/μl) 20 μL av E. coli BL21(DE3) pLysS (20 μl alikvot av kommersiellt tillgängliga celler har > 2 x 106 CFU/μg plasmid) i en 1,5 mL tub. Blanda försiktigt genom finger tapping eller snärta röret. Inkubera i is 5 min.
	<ol>
<li>Värme chock för exakt 30 s i en 42 ˚C vatten bad och sedan omedelbart återgå till is i 2 min.</li>
		<li>Tillsätt 80 μl av ...

<ol>
	<li>Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+nuclease+contamination+during+purification+of+recombinant+prototype+foamy+virus+integrase.">Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase.</a> J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).</li><li>Senavirathne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+nuclease+contamination+in+commonly+used+oxygen-scavenging+systems.">Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems.</a> Nat Methods. 12 (10), 901-902 (2015).</li><li>Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orthogonal+single-molecule+experiment+reveals+multiple-attempt+dynamics+of+type+IA+topoisomerases.">An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases.</a> Nat Struct Mol Biol. 24 (5), 484-490 (2017).</li><li>Valkov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+characterization+of+the+integrase+from+the+prototype+foamy+virus.">Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).</li><li>Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Retroviruses. , (1997).</li><li>Li, M., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+viral+DNA+ends+channels+the+HIV-1+integration+reaction+to+concerted+integration.">Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration.</a> J Biol Chem. 280 (32), 29334-29339 (2005).</li><li>Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+DNA+integration:+reaction+pathway+and+critical+intermediates.">Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates.</a> EMBO J. 25 (6), 1295-1304 (2006).</li><li>Sinha, S., Grandgenett, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+exhibits+a+capacity+for+full-site+integration+in+vitro+that+is+comparable+to+that+of+purified+preintegration+complexes+from+virus-infected+cells.">Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells.</a> J Virol. 79 (13), 8208-8216 (2005).</li><li>Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerted+integration+of+retrovirus-like+DNA+by+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase.">Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase.</a> J Virol. 69 (10), 6090-6097 (1995).</li><li>Vora, A. C., Grandgenett, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+catalytic+properties+of+retrovirus+integrase-DNA+complexes+capable+of+efficiently+performing+concerted+integration.">Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration.</a> J Virol. 69 (12), 7483-7488 (1995).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nat Commun. 7, 11409 (2016).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li></ol>

Rekombinanta proteiner som samverkar med DNA, såsom DNA reparation proteiner, syre asätare enda molekyl mikroskopi program eller retrovirala integrases, ska vara fria från kontaminerande bakteriell nukleaser2,3. Dessa föroreningar kan förvirra tolkning av resultat under bulk biokemiska eller enda molekyl analyser.
Vi har funnit att en bakteriell nuclease ofta samtidig renar med PFV IN. PFV i visas dock en affinitet för heparin se...

Biokemiska och enda molekyl studier av proteininteraktioner med DNA kräver exceptionellt ren rekombinanta proteiner. Kontaminerande nukleaser från bakterier kan dölja resultaten av dessa analyser. En kontaminerande nuclease har hittats i förberedelserna av rekombinanta proteiner syre gatsopare protocatechuate-3,4-dioxygenas (PCD) och prototyp skummande virus (PFV) integras (IN) isolerade från Escherichia coli (E. coli)1 , 2 , 3.
Retrovirala integration analyser lita på omvandlingen av supercoiled DNA till nicked eller linjära produkter som ett mått på i aktivitet4. Under cellulära infektion går IN med de två ändarna av en viral cDNA till värd kromatin5. Varje ände att gå reaktion kallas strand överföring. Analyser av rekombinant i aktivitet kan gå med två DNA oligomerer härma den viral cDNA avslutar till en mål-DNA i ett samordnat integration reaktion4,5,6,7,8. Rekombinant IN kan alternativt gå med endast en DNA ände i en icke-fysiologiskt relevanta halv webbplats integration reaktion9,10. När supercoiled plasmid DNA är målet för integration, samordnade integration produkter är linearized DNA och halv webbplats integrationsprodukter är avslappnad cirklar. Dessa reaktionsprodukter är identifierade genom deras relativa rörlighet under agaros gelelektrofores1. Om rekombinant IN har en kontaminerande nuclease, blir det falska avslappnad cirklar eller en möjligen linearized plasmid förvirrande experimentella resultat. Virala DNA oligomerer kan märkas fluorescently för att entydigt identifiera integrationsprodukter, i motsats till nuclease produkter. Dock gynnar i hög grad supercoiled DNA mål; förlust av supercoiled plasmid avslappnad cirklar eller linjära DNA av kontaminerande nuclease kunde skeva resultat och tolkning av data11. Således är det absolut nödvändigt att ta bort bakteriella nukleaser från retrovirala i beredningar.
PFV IN har en olika affinitet för heparin sepharose jämfört med bakteriell nuclease1. PFV IN och nuclease kan avskiljas genom en linjär övertoning eluering från heparin sepharose. Nuclease identifieras inte lätt genom ett ultraviolett (UV) absorbans vid 280 nm topp eller analytiska sodium dodecyl sulfate polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE). I stället detekteras nuclease av en nuclease aktivitet assay anställa omvandlingen av en supercoiled plasmid till avslappnad cirklar eller linjära produkter. Varje fraktion efter heparin sepharose kromatografi är testad för nuclease aktivitet. PFV i och det främmande ämnet på nuclease har ingen skillnad i affinitet för Mono-Q anjonharts. I området i närheten finns det en liten skillnad i affinitet för Mono-S katjonharts. Mono-S resolution av bakteriell nuclease och PFV i skulle dock inte tillåta effektiv separation av proteiner. I slutändan heparin sepharose affinitet rening erbjuder bästa separation av bakteriell nuclease från PFV IN och har fördelen av obegränsad ladda volym.
Testning för kontaminerande nuclease aktivitet får anpassas till andra proteiner. Proteinet av intresse kommer troligen att ha alternativa affinitet egenskaper än PFV i; skillnaden i bindande egenskaper av proteinet av intresse och det främmande ämnet på nuclease måste bestämmas empiriskt. Denna metod för att identifiera nuclease kontaminering kan anpassas till andra hartser inklusive Mono-S katjon eller Mono-Q anjonbytarresiner. Affinitet och jonbyte hartser kan erbjuda en pålitlig metod för att isolera ett rekombinant protein av intresse från att förorena nukleaser med inga begränsningar på mängden protein under kromatografi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="682">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BL21/DE3 Rosetta E. coli</td>
			<td style="width:180px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">70956-4</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB broth</td>
			<td style="width:180px;">EMD biosciences</td>
			<td style="width:119px;">1.10285.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloramphenicol&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IPTG&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:119px;">CI8280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ZnCl2</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">208086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Ultra Pure</td>
			<td style="width:180px;">Gojira Fine Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">UTS1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:180px;">P212121</td>
			<td style="width:119px;">RP-S23020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PMSF&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imidazole&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DTT&#160;</td>
			<td style="width:180px;">P212121</td>
			<td style="width:119px;">SV-DTT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure EDTA</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen/Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:119px;">CA3510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">G37-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ni-NTA Superflow</td>
			<td style="width:180px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">30430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Heparin Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td style="width:180px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0998-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HRV14 3C protease&#160;</td>
			<td style="width:180px;">EMD Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">71493-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase

Integras (IN) proteinet av retrovirus prototyp skummande viruset (PFV) är ett enzym som modell för att studera mekanismen för retrovirala integration. PFV IN jämfört IN från andra retrovirus, och är mer lösliga och mer mottagliga för experimentell manipulation. Dessutom är det känsligt för kliniskt relevanta humant immunbristvirus (HIV-1) IN hämmare, tyder på att den katalytiska mekanismen av PFV i är liknande till att av HIV-1 IN. i katalyserar den kovalenta sammanfogningen av viral kompletterande DNA (cDNA) till mål DNA i en process som kallas strand överföring. Denna strand överföring reaktion introducerar nicks till mål-DNA. Analys av integration reaktionsprodukter kan förväxlas av närvaron av nukleaser som likaså nick DNA. En bakteriell nuclease har visats att samtidig rena med rekombinant PFV IN uttryckt i Escherichia coli (E. coli). Här beskriver vi en metod för att isolera PFV IN från det kontaminerande nuclease av heparin affinitetskromatografi. Fraktioner screenas enkelt för nuclease kontaminering med supercoiled plasmid och agaros gelelektrofores. PFV i och den kontaminerande nuclease visar alternativa tillhörigheter för heparin sepharose möjliggör en nuclease-fri beredning av rekombinant PFV i lämplig för biokemiska eller enda molekyl massanalys av integration.

Rekombinant PFV i är ofta förorenade med en bakteriell nuclease1. Biokemiska integration analyser beror på kvantitering av omvandlingen av supercoiled plasmid DNA till avslappnad cirklar och linjära produkter. Förekomsten av en kontaminerande nuclease kan leda till falska kvantitering av dessa analyser. Uttryck för PFV IN med en hexahistidine-tagg är inducerad i E. coli (figur 1) och först renas genom nickel affinitetskromatografi (<strong class="xfig...

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase at JoVE.com

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Rekombinant prototyp skummande virus integras protein är ofta förorenade med en bakteriell nuclease under reningen. Den här metoden identifierar nuclease kontaminering och bort från den slutliga beredningen av enzymet.

Upptäckt och borttagning Nuclease kontamination vid rening av rekombinant prototyp skummande Virus integras

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Generering av Rekombinant influensavirus från Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Detektion av infektiösa virus från Field-in Myggor av vero-cellodling analys

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detektion Metod för Influensa Virus-

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Affinitetsrening av ribonukleoprotein influensavirus komplex från kromatinet hos infekterade celler

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

In vivo Imaging Systems (IVIS) Detektering av en Neuro-invasiv encephalitic virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Räddning av rekombinant Newcastlevirus från cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Räddning och karaktärisering av rekombinant virus från en ny världsinfektiös klon från Zika Virus

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

Montering och rening av prototyp skummande Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Snabb, säker och enkel manuell sängkanten nukleinsyra extraktion för påvisande av Virus i helblod

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

Identifiering av kodning och icke-kodande RNA klasser uttryckta i svin helblod

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...