Name: constitutive and inducible systems for genetic in vivo modification of mouse hepatocytes using hydrodynamic tail vein injection
Uploaded: 2018-02-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection at JoVE.com

وأيد هذا العمل Deutsche كريبشيلفي، ألمانيا (رقم المنحة 111289 لرق)، ولوسيل باكارد لصحة الأطفال (إرنست واميليا جالو وهبت ما بعد الدكتوراه زمالة-كتسا المنحة رقم UL1 RR025744 لرق). ونشكر الدكتور مارك أ كاي لناقلات الأمراض بنيات ودعم المشورة التجريبية والدكتور جوليان حكيم للفئران والتجريبية.

جميع التجارب على الحيوانات وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، ووافقت عليها السلطات المسؤولة (ريجيرونج فون أوبيرباييرن، ميونيخ، ألمانيا وجامعة ستانفورد، الرعاية المؤسسية على الحيوان واستخدام اللجنة، ستانفورد، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). ?...

تعداء لخلايا الكبد مع حقن الوريد ذيل هيدرودينامية أصبح أسلوب المنشأة منذ إطلاقها منذ أكثر من 15 عاماً6. حجم حقن يتجاوز الناتج القلب ويتدفق من الأجوف فينا أقل شأنا في الجيوب من الكبد7، مما يؤدي إلى تعداء حوالي 10-20%، وفي بعض الحالات تصل إلى 40 في المائة من خلايا الكبد<sup...

ويعرض أمراض الكبد المزمنة في العالم أعباء صحية رئيسية1. نماذج حيوانية للبحث هي أدوات لا غنى عنها في دراسة أمراض الكبد، وساعدت على الإجابة على أسئلة معقدة في تجديد الكبد، والتهاب الكبد، وذلك فضلا عن سرطان الكبد2. أن عددا كبيرا من هذه النماذج الحيوانية تعتمد على التحوير الوراثي لخلايا الكبد. ومن ثم، هي أدوات فعالة التعامل مع التعبير الجيني في خلايا الكبد مفيدة3. أساليب محددة مثل تربية السلالات المهندسة وراثيا الماوس أو توليد النواقل الفيروسية للإصابة تتمثل هي الميناء تستغرق وقتاً طويلاً، أما الشواغل المتعلقة بالسلامة، أو تسفر عن التعبير التحوير الفقراء في خلايا الكبد في فيفو 4 , 5. حقن الوريد هيدرودينامية الذيل (هتفي) أسلوب بديل تعداء في الجسم الحي من خلايا الكبد مما يسمح للاستجواب سهلة وسريعة وفعالة من حيث التكلفة من وظيفة الجينات في الكبد. هتفي، يحل ناقل يحمل تسلسل الحمض النووي المطلوب في مجلد من المقابلة إلى 10% وزن الجسم الحيوان حقن المحلول الملحي. الحل ثم حقن الوريد الذيل ضمن 5-10 ق6. تتجاوز الناتج القلب، تدفقات المياه المالحة من الأجوف فينا أقل شأنا في عروق الكبد، مما أدى إلى التوسع في الكبد وتعداء الهيدروديناميكي لخلايا الكبد7. لتحقيق التكامل الجينوم مستقرة، اقترن الأسلوب ناقلات القائم على ينقول، مثل نظام ينقول النوم الجمال. هذه النظم يتوسط جزئ من ناقلات الأمراض المستهدفة مع مواقع جزئ الجينوم تحفزها8،ترانسبوساسي النوم الجمال-9. لنماذج من تليف الكبد أو التسرطن، من المستصوب غالباً للجينات أوفيريكسبريس أو الصمت في بعض النقاط الزمنية لنموذج المرض. لهذا الغرض، وأدوات للتعبير الجيني إيندوسيبلي مثل Cre/لوكسب-النظام أو نظام التعبير الجيني التتراسيكلين إيندوسيبلي (تيت في) قد تكون تستخدم10.
هنا، نحن وصف بروتوكول في فيفو تعداء لخلايا الكبد مورين استخدام هتفي نظام قائم على أساس ينقول الجمال النائم . بالإضافة إلى وضع بروتوكول للتعبير مستقرة، والمكونة من التحوير تحت سيطرة أحد المروجين الخاصة بالكبد، يمكننا وصف نظام ناقل أكثر تقدما الذي يجمع بين تعتمد على تاموكسيفن التأسيسي لجنة المساواة العرقية recombinase (كرير) التعبير التعبير إيندوسيبلي للتحوير أو تكييفها microRNA شرنا (مير-شرنا)، دعا صوغ نظام تيت11. في هذا النظام متجه، يتم استنساخ المتسلسلات إيندوسيبلي أو مير-شرناس للتعبير تعتمد على التتراسكلين في ناقلات العمود الفقري مع وجود نظام استنساخ ريكومبيناشونال، يسمح لتوليد سريعة وسهلة ل ناقلات جديدة12. ويغطي هذا الدليل القائم على الفيديو إعداد متجهات مناسبة والحقن والعلاج من الفئران لتحقيق التعبير التحوير/مير-شرنا إيندوسيبلي، وأخيراً إعداد أنسجة الكبد للتحليل. الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول يهدف إلى تمكين المزيج من أي نظام الماوس Cre/لوكسب بوساطة مع التعبير أو تدق لأسفل أي الجينات في الاختيار، مما يجعل من نظام التطبيق على نطاق واسع في البحوث المتعلقة بأمراض الكبد.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>General Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#SM1331</td>
			<td>DNA ladder for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T.</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>embedding of cryo-sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biozym LE Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7637-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Saccharose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4621.1</td>
			<td>For sweetening of the doxycyline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0839,0010</td>
			<td>For selection of Amp-resistant clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar (Luria/Miller)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X969.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Luria/Miller)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. Medium</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1492,0001</td>
			<td>For selection of Gentamicin-resistant clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Histofix 4 %</td>
			<td>Fa. Roth</td>
			<td>P087.6</td>
			<td>para-formaldehyde solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix</td>
			<td>invitrogen/ThermoFisher</td>
			<td>11791-020</td>
			<td>contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB3.1 Competent Cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11782-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stbl3 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AscI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0558S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FseI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0588S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0156S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0133S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BfuAI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0701S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>For DNA Extraction from gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean Up</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740609.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond PC20</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740571</td>
			<td>Plasmid extraction (Mini prep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond PC500</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740574</td>
			<td>Plasmid extraction (Maxi prep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for Mouse Experiments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injekt Syringe F 1 ml</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9166017V</td>
			<td>For intraperitoneal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix Luer 3 ml</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4616025V</td>
			<td>For intravenous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican Cannula 24G</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4657675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican Cannula 27G</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4657705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td>For CreER activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8267-500ML</td>
			<td>Carrier for tamoxifen injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2951,0025</td>
			<td>Activation of tetracycline-dependent expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injekt 10 ml Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur S 0.2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>831,826,001</td>
			<td>For filtration of doxycycline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0,9%</td>
			<td>Braun</td>
			<td>3200905</td>
			<td>Carrier for intravenous injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Conical Tube 50ml</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared Lamp</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For warming of mouse tail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>In vivo imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTC</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>Vector for constitutive gene expression, ref. 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEN_TTmcs</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #25755</td>
			<td>Entry vector for inducible gene expression, ref. 19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEN_TTGmiRc2</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #25753</td>
			<td>Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEN_TTmiRc2</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #25752</td>
			<td>Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTC ApoE-Tet</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #85578</td>
			<td>Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTC-CMV-Tet</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #85577</td>
			<td>Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

constitutive and inducible systems for genetic in vivo modification of mouse hepatocytes using hydrodynamic tail vein injection

في نماذج أبحاث سرطان الكبد والتجدد، والالتهاب والتليف، نظم مرنة للتعبير الجيني في فيفو وإسكات مفيدة للغاية. حقن الوريد ذيل هيدرودينامية بني على أساس ينقول طريقة فعالة للتحوير الوراثي لخلايا الكبد في الفئران الكبار. وبالإضافة إلى التعبير التحوير التأسيسي، ويمكن استخدام هذا النظام لتطبيقات أكثر تقدما، مثل الجينات شرنا بوساطة تدق لأسفل، المترتبة على نظام كريسبر/Cas9 للحث على الطفرات الجينية، أو أنظمة إيندوسيبلي. هنا، يقدم مزيج التعبير كرير التأسيسي جنبا إلى جنب مع إيندوسيبلي التعبير التحوير أو مير-شرنا للاختيار كمثال لهذا الأسلوب. نحن تغطي إجراءات متعددة الخطوات بدءاً من إعداد الجمال النائم-يبني ينقول، إلى حقن وعلاج فئران، وإعداد أنسجة الكبد للتحليل قبل إيمونوستينينج. نظام عرض نهج موثوقة وفعالة لتحقيق معقدة التلاعب الجيني في خلايا الكبد. هي مفيدة على وجه الخصوص في تركيبة مع سلالات الماوس Cre/لوكسب-تعتمد ويمكن تطبيقها على مجموعة متنوعة من نماذج في البحوث المتعلقة بأمراض الكبد.

فعالية تعداء بحقن الوريد هيدرودينامية الذيل: النسبة المئوية لخلايا الكبد مورين التي هي ترانسفيكتيد هيدروديناميكالي بحقنه واحدة هو متغير ويعتمد على معلمات متعددة مثل حجم الحقن، حقن الوقت، كمية من حقن الحمض النووي، وحجم بناء حقن6، ،من <su...

Watch this Scientific Journal Video about Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection at JoVE.com

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

نظم التأسيسي وإيندوسيبلي للتعديل الوراثي في فيفو من خلايا الكبد الماوس باستخدام حقن الوريد ذيل هيدرودينامية

حقن الوريد ذيل هيدرودينامية نواقل التكامل على أساس ينقول تمكن تعداء مستقرة من خلايا الكبد مورين المجراة في. نقدم هنا، بروتوكول عملي لنظم تعداء تمكن التعبير التأسيسي طويل الأجل للتحوير مفردة أو مجتمعة التعبير التأسيسي والدوكسيسيكلين إيندوسيبلي للتحوير أو مير-شرنا في الكبد.

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

التلاعب الجيني للمسببات الأمراض النباتية<em&gt; السوادية الذروية</em&gt; لدراسة علم الأحياء الفطرية النباتية وميكروب التفاعلات

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

كريسبر/Cas9-بوساطة التكامل المستهدفة في فيفو استخدام استراتيجية تستند إلى الانضمام إلى التماثل بوساطة نهاية

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

عزل وتوصيف والمستندة إلى MicroRNA التحوير الوراثي للخلايا الجذعية البشرية جريب طب الأسنان

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

تثبيط البروتين إيندوسيبلي وعكسها المهيمنة سالب (DN)

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

يصف هستون تعديل بوستترانسلاشونال التعديلات في نماذج بروتينوباثي الأعصاب الخميرة

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

إيندوسيبلي، الخلية المحددة بنوع التعبير في نبات التمويل "عن طريق لحجر" بوساطة ترانس-التنشيط

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

في فيفو دراسة وظيفية من المتغيرات البشرية النادرة المرتبطة بالأمراض باستخدام دروسوفيلا

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

في فيفو إلى الأمام الشاشة الوراثية لتحديد الجينات العصبية الجديدة في دروسوفيلا melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

الشاشات الوراثية المجمعة المستندة إلى كريسبر في خلايا الثدييات

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

تحويل جذر الطماطم متبوعاً بالتلقيح مع Ralstonia Solanacearum للتحليل الوراثي المباشر لمرض الذبول البكتيري

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...