Name: constitutive and inducible systems for genetic in vivo modification of mouse hepatocytes using hydrodynamic tail vein injection
Uploaded: 2018-02-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Deutsche Krebshilfe, Tyskland (tilskud antal 111289 til UE), Lucile Packard Foundation for børns sundhed (Ernest og Amelia Gallo begavet postdoc stipendium - CTSA tilskud antal UL1 RR025744 til UE). Vi takker Dr. Mark A. Kay for vektor konstruktioner og eksperimenterende rådgivning og Dr Julien Sage til mus og eksperimentel støtte.

Alle dyreforsøg blev udført efter retningslinjerne for pleje og brug af forsøgsdyr og blev godkendt af myndighederne (Regierung von Oberbayern, München, Tyskland og Stanford institutionelle dyrs pleje og bruge udvalget, Stanford, CA, USA). En liste over alle plasmider for kloning (trin 1-4) er fastsat i supplerende tabel S1.
1. kloning af et transgen til konstituerende genekspression
<ol><li>Design primere for transgen forstærkning13,...

Transfektion af hepatocytter med Hydrodynamisk hale vene injektion er blevet en etableret metode siden introduktionen mere end 15 år siden6. Den injicerede volumen overstiger minutvolumen og løber fra den ringere vena cava i sinusoids af leveren7, fører til Transfektion af ca 10-20%, i nogle tilfælde op til 40% af hepatocytter25,26. Prædiktorer for en vellykket Transfektion er den injicerede volumen pr. injicer...

Kronisk leversygdom præsenterer en større sundhed byrde på verdensplan1. Dyreforskning modeller er uundværlige redskaber i studiet af leversygdom og har hjulpet med at besvare komplekse spørgsmål i leveren regenerering, hepatisk betændelse, og steatose samt leverkræft2. Et betydeligt antal af disse dyremodeller er afhængige af den genetiske modifikation af leverceller. Derfor, effektive værktøjer til at manipulere genekspression i hepatocytter er nyttigt3. Etablerede metoder såsom opdræt af gensplejsede mus stammer eller generation af virale vektorer for hepatocyt infektion er enten tidskrævende, harbor sikkerhedsproblemer, eller give fattige transgen udtryk i hepatocytter i vivo 4 , 5. hydrodynamiske hale vene injektion (HTVI) er en alternativ metode til i vivo Transfektion af hepatocytter giver mulighed for nem, hurtig og omkostningseffektiv forhør af genet fungerer i leveren. For HTVI opløses en vektor, bærer det ønskede DNA-sekvens i en mængde af saltvand svarende til 10% af kropsvægten af det injicerede dyr. Løsningen er derefter sprøjtet ind i halen vene inden for 5-10 s6. Overstiger minutvolumen, løber saltvand fra den ringere vena cava i leveren venerne, fører til udvidelse af leveren og Hydrodynamisk Transfektion af hepatocytter7. For at opnå stabil genomisk integration, har metoden været kombineret med transposon-baserede vektorer, som den sovende skønhed -transposon system. Denne systemer medierer rekombination af target vektorer med genomisk rekombination websteder katalyseret af en sovende skønhed -transposase8,9. Modeller af leverfibrose eller carcinogenese er det ofte ønskeligt at overexpress eller stilhed gener på visse tidspunkter af sygdom model. Til dette formål, værktøjer til inducerbar genekspression som Cre/LoxP-system eller tetracyklin-inducerbar gen expression system (Tet-On) kan være brugt10.
Her, beskriver vi en protokol for i vivo Transfektion af murine hepatocytter ved hjælp af HTVI af en sovende skønhed transposon-baseret system. Ud over en protokol for stabil, konstituerende udtryk for en transgen under kontrol af en lever-specifikke promotor, vi beskriver en mere avanceret vektorsystem, der kombinerer konstitutiv tamoxifen-afhængige Cre recombinase (CreER) udtryk med den inducerbar udtryk for en transgen eller mikroRNA-tilpasset shRNA (miR-shRNA), kaldet pTC TET-systemet11. I denne vektorsystem er inducerbar transgener eller miR-shRNAs for tetracyclin-afhængige udtryk klonet i rygraden vektor med en recombinational kloning ordning, tillade den hurtige og nem generation af nye vektorer12. Denne video-baserede vejledning omfatter udarbejdelsen af passende vektorer, injektion og behandling af musene at opnå inducerbar transgen/miR-shRNA udtryk, og endelig forberedelse af levervævet til analyse. De i denne protokol beskrevne metode var designet til at aktiverer kombinationen af enhver Cre/loxP medieret mus system med udtrykket eller knock-down af enhver gene af valg, hvilket gør det til et almindeligt gældende system i forskning af leversygdom.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>General Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#SM1331</td>
			<td>DNA ladder for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T.</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>embedding of cryo-sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biozym LE Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7637-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Saccharose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4621.1</td>
			<td>For sweetening of the doxycyline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0839,0010</td>
			<td>For selection of Amp-resistant clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar (Luria/Miller)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X969.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Luria/Miller)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. Medium</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1492,0001</td>
			<td>For selection of Gentamicin-resistant clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Histofix 4 %</td>
			<td>Fa. Roth</td>
			<td>P087.6</td>
			<td>para-formaldehyde solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix</td>
			<td>invitrogen/ThermoFisher</td>
			<td>11791-020</td>
			<td>contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB3.1 Competent Cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11782-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stbl3 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AscI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0558S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FseI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0588S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0156S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0133S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BfuAI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0701S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>For DNA Extraction from gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean Up</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740609.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond PC20</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740571</td>
			<td>Plasmid extraction (Mini prep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond PC500</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740574</td>
			<td>Plasmid extraction (Maxi prep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for Mouse Experiments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injekt Syringe F 1 ml</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9166017V</td>
			<td>For intraperitoneal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix Luer 3 ml</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4616025V</td>
			<td>For intravenous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican Cannula 24G</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4657675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican Cannula 27G</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4657705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td>For CreER activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8267-500ML</td>
			<td>Carrier for tamoxifen injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2951,0025</td>
			<td>Activation of tetracycline-dependent expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injekt 10 ml Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur S 0.2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>831,826,001</td>
			<td>For filtration of doxycycline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0,9%</td>
			<td>Braun</td>
			<td>3200905</td>
			<td>Carrier for intravenous injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Conical Tube 50ml</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared Lamp</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For warming of mouse tail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>In vivo imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTC</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>Vector for constitutive gene expression, ref. 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEN_TTmcs</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #25755</td>
			<td>Entry vector for inducible gene expression, ref. 19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEN_TTGmiRc2</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #25753</td>
			<td>Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEN_TTmiRc2</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #25752</td>
			<td>Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTC ApoE-Tet</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #85578</td>
			<td>Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTC-CMV-Tet</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #85577</td>
			<td>Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

constitutive and inducible systems for genetic in vivo modification of mouse hepatocytes using hydrodynamic tail vein injection

I forskning modeller af leverkræft, regenerering, inflammation og fibrose er fleksible systemer for i vivo genekspression og silencing meget nyttig. Hydrodynamisk hale vene injektion af transposon-baserede konstruktioner er en effektiv metode til genetisk manipulation af hepatocytter i voksen mus. Ud over konstitutiv transgen udtryk, kan dette system bruges til mere avancerede applikationer, såsom shRNA-medieret gen knock-down, konsekvenser af CRISPR/Cas9-systemet til at fremkalde genmutationer eller inducerbar systemer. Her, er kombinationen af konstituerende CreER udtryk sammen med inducerbar udtryk for en transgen eller miR-shRNA valg præsenteret som et eksempel på denne teknik. Vi dækker Multi-trins procedure fra udarbejdelsen af Tornerose-transposon konstruktioner, injektion eller behandling af mus, og forberedelse af levervævet til analyse af immunfarvning. Systemet præsenteret er en pålidelig og effektiv tilgang til at opnå komplekse genetiske manipulationer i hepatocytter. Det er specielt nyttig i kombination med Cre/loxP-baserede mus stammer og kan anvendes til en bred vifte af modeller i forskning af leversygdom.

Transfektion effekten af hydrodynamiske hale vene injektion: Procentdelen af murine hepatocytter, der er transfekteret hydrodynamically af en enkelt injektion er variabel og afhænger af flere parametre såsom Injektionsvolumen, injektion tid, mængde injiceret DNA, og størrelsen af den injicerede konstruere6, 22,23. Derudover er Transfektion effektivitet generelt lavere i stø...

Watch this Scientific Journal Video about Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection at JoVE.com

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Konstituerende og inducerbar systemer for genetiske In Vivo ændring af mus hepatocytter brug af hydrodynamiske hale vene injektion

Hydrodynamisk hale vene injektion af transposon-baseret integration vektorer giver stabil Transfektion af murine hepatocytter in vivo. Vi præsenterer her, en praktisk protokol til Transfektion systemer, der giver mulighed for den langsigtede konstitutiv udtryk for en enkelt transgen eller kombinerede konstitutiv og doxycyclin-inducerbar udtryk for en transgen eller miR-shRNA i leveren.

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetisk Manipulation af afgroedesygdomme<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; At studere Fungal Biology og Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-medieret målrettede Integration In Vivo ved hjælp af en homologi-medieret End at deltage-baseret strategi

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolation, karakterisering og mikroRNA-baseret genetisk modificering af menneskelige Dental follikel stamceller

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

Inducerbar og Reversible dominerende-negative (DN) Protein hæmning

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Kendetegner Histon posttranslationel modifikation ændringer i gær Neurodegenerative Proteinopathy modeller

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducerbar, celle Type-specifikke udtryk i Arabidopsis thaliana gennem LhGR-medieret Trans-aktivering

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In vivo funktionel undersøgelse af sygdoms associerede sjældne humane varianter ved hjælp af Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In vivo fremad genetisk skærm for at identificere nye neuroprotektive gener i Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Samlede CRISPR-baserede genetiske skærme i pattedyrsceller

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Tomatrod Transformation Efterfulgt af podning med Ralstonia Solanacearum for ligetil genetisk analyse af bakteriel visnesygdom

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...