Name: constitutive and inducible systems for genetic in vivo modification of mouse hepatocytes using hydrodynamic tail vein injection
Uploaded: 2018-02-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de Deutsche Krebshilfe, Duitsland (subsidie getal 111289 UE), de Lucile Packard Foundation voor de gezondheid van kinderen (Ernest en Amelia Gallo begiftigd Postdoctoral Fellowship - CTSA subsidie nummer UL1 RR025744 UE). Wij danken Dr Mark A. Kay voor vector constructies en experimentele advies en Dr. Julien Sage voor muizen en experimentele ondersteuning.

Alle dierproeven zijn uitgevoerd volgens de richtsnoeren voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en goedgekeurd door de verantwoordelijke autoriteiten (Regierung von Oberbayern, München, Duitsland en Stanford institutionele dier zorg en gebruiken Comité, Stanford, CA, USA). Een lijst van alle plasmiden voor klonen (stap 1 t/m 4) vindt u in de aanvullende tabel S1.
1. het klonen van een transgenic voor constitutieve genexpressie
<ol><li>Inleidingen voor transgenic amplificatie<sup...

De transfectie van hepatocyten met hydrodynamische staart veneuze injectie is een gevestigde methode geworden sinds de invoering ervan meer dan 15 jaar geleden6. Het geïnjecteerde volume overschrijdt van de cardiale output en stroomt de sinusoïdes van de lever7, leiden tot de transfectie van ongeveer 10-20%, in sommige gevallen oplopen tot 40% van hepatocyten25,26van de vena cava inferior. Voorspellers van een suc...

Chronische leverziekte presenteert een belangrijke gezondheid last wereldwijd1. Dierlijk onderzoeksmodellen zijn essentiële instrumenten in de studie van de leverziekte en hebben geholpen om complexe vragen in lever regeneratie, hepatische ontsteking, en steatosis, alsmede leverkanker2te beantwoorden. Een aanzienlijk aantal van deze dierlijke modellen, is afhankelijk van de genetische modificatie van levercellen. Efficiënte tools voor het manipuleren van genexpressie in hepatocyten zijn daarom nuttig3. Gevestigde methodes zoals het kweken van genetisch gemanipuleerde muis stammen of het genereren van virale vectoren voor hepatocyte infectie zijn beide tijdrovend, haven bezorgdheid over de veiligheid, of oogst van arme transgenic expressie in hepatocyten in vivo 4 , 5. hydrodynamische staart veneuze injectie (HTVI) is een alternatieve methode voor in vivo transfectie van hepatocyten toestaan voor gemakkelijk, snel en kostenefficiënt ondervraging van de genfunctie in de lever. Voor HTVI, wordt een vector die de gewenste opeenvolging van DNA opgelost in een volume zoutoplossing overeenkomt met 10% van het lichaamsgewicht van het dier, ingespoten. De oplossing wordt vervolgens geïnjecteerd in de ader van de staart binnen 5-10 s6. Meer dan de cardiale output, mondt de zoutoplossing van de vena cava inferior uit in de lever aderen, wat leidt tot uitbreiding van de lever en hydrodynamische transfectie van hepatocyten7. Om te bereiken van stabiele genomic integratie, heeft de methode transposon gebaseerde vectoren, zoals het transposon sleeping beauty -systeem zijn samengevoegd. Deze systemen bemiddelt de recombinatie van doel vectoren met genomic recombinatie sites gekatalyseerd door een sleeping beauty -transposase8,9. Voor modellen van leverfibrose of carcinogenese is het vaak wenselijk aan overexpress of stilte genen op bepaalde tijdstippen van de ziekte-model. Voor dit doel, tools voor afleidbare genexpressie zoals het Cre/LoxP-systeem of het tetracycline-afleidbare gen expressie systeem (Tet-On) gebruikte10kan worden.
Hier beschrijven we een protocol voor in vivo transfectie van lymfkliertest hepatocyten met behulp van de HTVI van een schone slaapster transposon-gebaseerd systeem. Naast een protocol voor stabiele, constitutief uitdrukking van een transgenic onder de controle van een lever-specifieke promotor, beschrijven we een meer geavanceerde vector systeem dat constitutieve tamoxifen-afhankelijke Cre recombinase (CreER) expressie met combineert de afleidbare uitdrukking van een transgenic of microRNA-aangepast shRNA (miR-shRNA), genaamd de pTC TET-systeem11. In dit systeem vector zijn afleidbare transgenen of miR-shRNAs voor tetracycline-afhankelijke expressie gekloond in de ruggengraat vector met een recombinational klonen systeem, waardoor het snel en gemakkelijk generatie van nieuwe vectoren12. Deze gids videogebaseerd vindt de voorbereiding van geschikte vectoren, injectie en behandeling van muizen om afleidbare transgenic/miR-shRNA expressie, en ten slotte voorbereiding van leverweefsel voor analyse. De methode die wordt beschreven in dit protocol werd ontworpen om de combinatie van elk Cre/loxP gemedieerde muis systeem met de uitdrukking of knock-down van een gen van keuze, waardoor het een breed toepasbaar systeem in het onderzoek van de leverziekte.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>General Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#SM1331</td>
			<td>DNA ladder for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T.</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>embedding of cryo-sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biozym LE Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7637-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Saccharose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4621.1</td>
			<td>For sweetening of the doxycyline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0839,0010</td>
			<td>For selection of Amp-resistant clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar (Luria/Miller)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X969.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Luria/Miller)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. Medium</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1492,0001</td>
			<td>For selection of Gentamicin-resistant clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Histofix 4 %</td>
			<td>Fa. Roth</td>
			<td>P087.6</td>
			<td>para-formaldehyde solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix</td>
			<td>invitrogen/ThermoFisher</td>
			<td>11791-020</td>
			<td>contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB3.1 Competent Cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11782-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stbl3 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AscI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0558S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FseI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0588S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0156S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0133S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BfuAI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0701S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>For DNA Extraction from gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean Up</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740609.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond PC20</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740571</td>
			<td>Plasmid extraction (Mini prep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond PC500</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740574</td>
			<td>Plasmid extraction (Maxi prep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for Mouse Experiments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injekt Syringe F 1 ml</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9166017V</td>
			<td>For intraperitoneal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix Luer 3 ml</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4616025V</td>
			<td>For intravenous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican Cannula 24G</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4657675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican Cannula 27G</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4657705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td>For CreER activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8267-500ML</td>
			<td>Carrier for tamoxifen injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2951,0025</td>
			<td>Activation of tetracycline-dependent expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injekt 10 ml Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur S 0.2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>831,826,001</td>
			<td>For filtration of doxycycline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0,9%</td>
			<td>Braun</td>
			<td>3200905</td>
			<td>Carrier for intravenous injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Conical Tube 50ml</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared Lamp</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For warming of mouse tail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>In vivo imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTC</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>Vector for constitutive gene expression, ref. 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEN_TTmcs</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #25755</td>
			<td>Entry vector for inducible gene expression, ref. 19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEN_TTGmiRc2</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #25753</td>
			<td>Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEN_TTmiRc2</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #25752</td>
			<td>Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTC ApoE-Tet</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #85578</td>
			<td>Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTC-CMV-Tet</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #85577</td>
			<td>Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

constitutive and inducible systems for genetic in vivo modification of mouse hepatocytes using hydrodynamic tail vein injection

In onderzoeksmodellen van leverkanker, regeneratie, ontsteking en fibrose zijn flexibele systemen voor in vivo genexpressie en zwijgen zeer nuttig. Hydrodynamische staart veneuze injectie van transposon gebaseerde constructies is een efficiënte methode voor genetische manipulatie van hepatocyten in volwassen muizen. Naast constitutieve transgenic expressie, kan dit systeem worden gebruikt voor meer geavanceerde toepassingen, zoals gene shRNA-gemedieerde knock-down, implicatie van het CRISPR/Cas9-systeem voor het opwekken van genmutaties, of afleidbare systemen. Hier, is de combinatie van constituerende CreER expressie samen met afleidbare uitdrukking van een transgenic of miR-shRNA van keuze gepresenteerd als een voorbeeld van deze techniek. We hebben betrekking op de procedure van de scriptingregel vanaf de voorbereiding van het Doornroosje-transposon construeert, aan de injectie en de behandeling van muizen, en de voorbereiding van leverweefsel voor analyse door immunokleuring. Het systeem gepresenteerd is een betrouwbare en efficiënte aanpak om te bereiken van complexe genetische manipulaties in hepatocyten. Het is bijzonder nuttig in combinatie met Cre/loxP gebaseerde muis stammen en kan worden toegepast op een verscheidenheid van modellen in het onderzoek van de leverziekte.

Transfectie werkzaamheid door hydrodynamische staart veneuze injectie: Het percentage van lymfkliertest hepatocyten die door een enkele injectie hydrodynamica zijn transfected is variabel en hangt af van meerdere parameters zoals het geïnjecteerde volume, de injectie tijd, de hoeveelheid ingespoten DNA, en de grootte van de geïnjecteerde construct6, 22,23. Bovendien, is de eff...

Watch this Scientific Journal Video about Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection at JoVE.com

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutieve en afleidbare systemen voor genetische In Vivo wijziging van muis hepatocyten gebruik hydrodynamische staart veneuze injectie

Hydrodynamische staart veneuze injectie van transposon gebaseerde integratie vectoren kan stabiele transfectie van lymfkliertest hepatocyten in vivo. Hier presenteren we een praktische protocol voor Transfectie systemen waarmee de langdurige constitutieve uitdrukking van een enkele transgenic of gecombineerde constitutieve en doxycycline-afleidbare expressie van een transgenic of miR-shRNA in de lever.

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetische Manipulatie van de Plant Pathogeen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Om Fungal Biology and Plant Microbe Interactions Studie

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-gemedieerde gerichte integratie In Vivo met behulp van een homologie-gemedieerde einde deelname aan gebaseerde strategie

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolatie, karakterisering en MicroRNA gebaseerde genetische modificatie van stamcellen van menselijke tandheelkundige follikel

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

Afleidbare en omkeerbare Dominant-negatief (DN) eiwit remming

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Karakterisering van Histone posttranslationele wijziging wijzigingen in gist neurodegeneratieve Proteinopathy modellen

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Afleidbare, cel Type-specifieke uiting in Arabidopsis thaliana via LhGR-gemedieerde Trans-activering

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In vivo functionele studie van ziekten-geassocieerde zeldzame menselijke varianten met behulp van Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In vivo genetisch scherm naar voren om nieuwe neuroprotectieve genen in Drosophila melanogaster te identificeren

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Gepoolde CRISPR-gebaseerde genetische schermen in zoogdiercellen

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Tomato Root Transformatie gevolgd door inenting met Ralstonia Solanacearum voor eenvoudige genetische analyse van bacteriële wilt ziekte

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...