Name: constitutive and inducible systems for genetic in vivo modification of mouse hepatocytes using hydrodynamic tail vein injection
Uploaded: 2018-02-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par la Deutsche Krebshilfe, Allemagne (numéro de licence 111289 à l’UE), le Lucile Packard Foundation pour la santé enfantile (Ernest et Amelia Gallo doué bourse de recherche postdoctorale - numéro de licence de CSTC UL1 RR025744 à l’UE). Nous remercions le Dr Mark A. Kay constructions vectorielles et conseils expérimentaux et Dr Julien Sage pour les souris et expérimentale.

Toutes les expériences animales ont été effectuées conformément aux lignes directrices pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par les autorités responsables (Regierung von Oberbayern, Munich, Allemagne et Stanford Institutional Animal Care et utiliser Comité, Stanford, CA, é.-u.). Une liste de tous les plasmides de clonage (étapes 1 à 4) est fournie dans une table supplémentaire S1.
1. clonage d’un transgène pour l’Expression des gène...

Transfection d’hépatocytes avec injection dans la veine queue hydrodynamique est devenu une méthode établie depuis son introduction il y a plus de 15 ans6. Le volume injecté dépasse le débit cardiaque et coule de la veine cave inférieure dans les sinusoïdes du foie7, conduisant à la transfection d’environ 10 à 20 %, dans certains cas jusqu'à 40 % des hépatocytes25,26. Facteurs prédictifs d’une tra...

Hépatopathie chronique présente un fardeau de majeurs pour la santé dans le monde1. Les modèles de recherche sur les animaux sont des outils essentiels dans l’étude des maladies du foie et ont aidé à répondre à des questions complexes dans la régénération du foie, inflammation hépatique et stéatose ainsi que le cancer du foie2. Un nombre important de ces modèles animaux reposent sur la modification génétique des cellules du foie. Par conséquent, des outils efficaces pour manipuler l’expression des gènes dans les hépatocytes sont utile3. Des méthodes reconnues telles que l’élevage de lignées de souris génétiquement modifiées ou la génération de vecteurs viraux pour infection hépatocytes sont soit harbor chronophage, problèmes de sécurité, ou rendement médiocre transgene expression dans les hépatocytes en vivo 4 , 5. injection dans la veine queue hydrodynamique (HTVI) est une méthode alternative pour la transfection de in vivo des hépatocytes permettant une interrogation simple, rapide et rentable de la fonction du gène dans le foie. Pour HTVI, un vecteur transportant la séquence d’ADN désirée est dissoute dans un volume de solution saline correspondant à 10 % du poids corporel de l’animal injecté. La solution est ensuite injectée dans la veine caudale dans 5-10 s6. Dépassant le débit cardiaque, la solution saline se jette de la veine cave inférieure dans les veines hépatiques, conduisant à l’élargissement du foie et de transfection hydrodynamique des hépatocytes7. Pour parvenir à une intégration génomique stable, la méthode a été combinée avec des vecteurs axée sur le transposon, tels que le système de transposon sleeping beauty. Ce système intervient dans la recombinaison des vecteurs de la cible avec les sites de recombinaison génomique catalysées par un sleeping beauty -transposase8,9. Pour les modèles de la fibrose du foie ou de la cancérogenèse, il est souvent souhaitable d’overexpress ou du silence des gènes à certains moments du modèle de la maladie. À cette fin, des outils pour l’expression des gènes inductibles tels que le Cre/LoxP-system ou le système d’expression de gène inductible par la tétracycline (Tet-On) peut être utilisé10.
Nous décrivons ici un protocole pour la transfection de in vivo des hépatocytes murins à l’aide de HTVI d’un système transposon belle au bois dormant . Outre un protocole pour l’expression stable, constitutive d’un transgène sous le contrôle d’un promoteur spécifique du foie, les auteurs décrivent un système de vecteur plus avancé qui combine l’expression constitutive tamoxifène dépendant Cre recombinase (CreER) avec la expression inductible d’un transgène ou adaptés microARN shARN (miR-shARN), appelé le pTC TET-système11. Dans ce système de vecteur, inductible transgènes ou miR-interférents pour expression dépendant de tétracycline sont clonés dans le vecteur de la colonne vertébrale avec un système de clonage de recombinaison, permettant la génération rapide et facile de nouveaux vecteurs12. Ce guide vidéo couvre la préparation de vecteurs appropriés, injection et le traitement de souris pour atteindre l’expression de transgènes/miR-shARN inductible et enfin la préparation du tissu hépatique pour l’analyse. La méthode décrite dans le présent protocole a été conçue pour permettre la combinaison de n’importe quel système de souris Cre/loxP médiée par l’expression ou la précipitation de n’importe quel gène de choix, ce qui en fait un système largement applicable dans la recherche d’une maladie du foie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>General Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#SM1331</td>
			<td>DNA ladder for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T.</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>embedding of cryo-sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biozym LE Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7637-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Saccharose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4621.1</td>
			<td>For sweetening of the doxycyline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0839,0010</td>
			<td>For selection of Amp-resistant clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar (Luria/Miller)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X969.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Luria/Miller)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. Medium</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1492,0001</td>
			<td>For selection of Gentamicin-resistant clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Histofix 4 %</td>
			<td>Fa. Roth</td>
			<td>P087.6</td>
			<td>para-formaldehyde solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix</td>
			<td>invitrogen/ThermoFisher</td>
			<td>11791-020</td>
			<td>contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB3.1 Competent Cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11782-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stbl3 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AscI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0558S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FseI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0588S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0156S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0133S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BfuAI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0701S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>For DNA Extraction from gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean Up</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740609.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond PC20</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740571</td>
			<td>Plasmid extraction (Mini prep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond PC500</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740574</td>
			<td>Plasmid extraction (Maxi prep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for Mouse Experiments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injekt Syringe F 1 ml</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9166017V</td>
			<td>For intraperitoneal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix Luer 3 ml</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4616025V</td>
			<td>For intravenous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican Cannula 24G</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4657675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican Cannula 27G</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4657705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td>For CreER activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8267-500ML</td>
			<td>Carrier for tamoxifen injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2951,0025</td>
			<td>Activation of tetracycline-dependent expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injekt 10 ml Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur S 0.2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>831,826,001</td>
			<td>For filtration of doxycycline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0,9%</td>
			<td>Braun</td>
			<td>3200905</td>
			<td>Carrier for intravenous injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Conical Tube 50ml</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared Lamp</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For warming of mouse tail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>In vivo imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTC</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>Vector for constitutive gene expression, ref. 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEN_TTmcs</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #25755</td>
			<td>Entry vector for inducible gene expression, ref. 19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEN_TTGmiRc2</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #25753</td>
			<td>Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEN_TTmiRc2</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #25752</td>
			<td>Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTC ApoE-Tet</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #85578</td>
			<td>Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTC-CMV-Tet</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #85577</td>
			<td>Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

constitutive and inducible systems for genetic in vivo modification of mouse hepatocytes using hydrodynamic tail vein injection

Dans les modèles de recherche d’un cancer du foie, régénération, l’inflammation et la fibrose, systèmes flexibles pour in vivo l’expression des gènes et silencieux d’échappement sont très utiles. Injection dans la veine queue hydrodynamiques de constructions axée sur le transposon est une méthode efficace de manipulation génétique des hépatocytes chez la souris adulte. En plus de l’expression du transgène constitutive, ce système peut servir pour des applications plus avancées, telles que l’implication de précipitation, de gènes shARN du système CRISPR/Cas9 pour induire des mutations du gène, ou systèmes inductibles. Ici, la combinaison de l’expression constitutive de CreER avec expression inductible d’un transgène ou miR-shARN de choix est présenté comme un exemple de cette technique. Nous couvrons la procédure plusieurs étape à partir de la préparation de la belle au bois dormant-transposon constructions, à l’injection et le traitement de souris et la préparation des tissus hépatiques pour analyse par immunohistochimie. Le système proposé est une approche fiable et efficace pour réaliser des manipulations génétiques complexes dans les hépatocytes. Il est particulièrement utile en combinaison avec Cre/loxP-basée des souches de souris et peut être appliqué à une variété de modèles dans la recherche d’une maladie du foie.

Efficacité de transfection par injection dans la veine queue hydrodynamique : Le pourcentage des hépatocytes murins qui sont transfectées hydrodynamique en une seule injection est variable et dépend de plusieurs paramètres tels que le volume d’injection, le temps d’injection, la quantité d’ADN injecté et la taille de la construction injecté6, 22,23. En outre, l’...

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Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Systèmes inductibles et constitutives génétique In Vivo modification des hépatocytes de souris à l’aide d’Injection dans la veine queue hydrodynamique

Injection dans la veine des vecteurs d’intégration axée sur le transposon queue hydrodynamique permet une transfection stable d’hépatocytes murins in vivo. Nous présentons ici un protocole pratique pour les systèmes de transfection qui permet l’expression constitutive à long terme d’un transgène seule ou combinée expression constitutive et doxycycline-induisible d’un transgène ou miR-shARN dans le foie.

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

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