Name: constitutive and inducible systems for genetic in vivo modification of mouse hepatocytes using hydrodynamic tail vein injection
Uploaded: 2018-02-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch die Deutsche Krebshilfe, Deutschland (Grant-Nummer 111289, UE), Lucile Packard Foundation für die Gesundheit von Kindern (Ernest und Amelia Gallo ausgestattet Postdoctoral Fellowship - CTSA Grant-Nummer UL1 RR025744, UE) unterstützt. Wir danken Dr. Mark A. Kay für Vektor-Konstrukte und experimentelle Beratung und Dr. Julien Sage für Mäuse und experimentelle Unterstützung.

Alle Tierversuche wurden nach den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und wurde vom zuständigen Behörden (Regierung von Oberbayern, München und Stanford institutionelle Tier Pflege und verwenden Ausschuss genehmigt Stanford, CA, USA). Eine Liste der alle Plasmide zum Klonen (Schritt 1 bis 4) ist in ergänzenden Tabelle S1 zur Verfügung gestellt.
1. Klonen ein Transgen konstitutive Genexpression
<ol><li>Design-Primer für Transgene Verstärkung<sup cla...

Transfektion von Hepatozyten mit hydrodynamischen Schweif Vene Injektion ist eine etablierte Methode seit seiner Einführung vor mehr als 15 Jahren geworden6. Das injizierte Volumen übersteigt das Herzzeitvolumen und der Sinusoide der Leber7, führt zur Transfektion von etwa 10-20 %, in einigen Fällen bis zu 40 % der Hepatozyten25,26von der minderwertigen Vena Cava mündet. Prädiktoren für eine erfolgreiche Tran...

Chronischer Lebererkrankung stellt eine große gesundheitliche Belastung weltweit1. Tierforschung Modelle sind wichtige Werkzeuge in der Studie von Lebererkrankungen und haben dazu beigetragen, die Leberregeneration, hepatischen Entzündung sowie Steatose und Leberkrebs2komplexe Fragen. Eine beträchtliche Anzahl von diesen Tiermodellen verlassen sich auf die gentechnische Veränderung von Leberzellen. Deshalb sind effiziente Werkzeuge zur Genexpression in Hepatozyten manipulieren hilfreich3. Bewährte Methoden wie die Zucht von gentechnisch veränderte Mausstämme oder die Erzeugung von viralen Vektoren für Hepatozyten Infektion sind entweder zeitaufwendig, Hafen Sicherheitsbedenken oder liefern schlechte Transgene Ausdruck in Hepatozyten in vivo 4 , 5. hydrodynamischen Schweif Vene Injektion (HTVI) ist eine alternative Methode zur in Vivo Transfektion von Hepatozyten ermöglicht einfach, schnell und kostengünstig Verhör der Genfunktion in der Leber. Für HTVI ist ein Vektor mit der gewünschten DNA-Sequenz in einem Volumen von Kochsalzlösung entspricht 10 % des Körpergewichts des injizierten Tieres aufgelöst. Die Lösung wird dann in die Rute Vene innerhalb von 5-10 s6injiziert. Herzzeitvolumen überschreiten, fließt die Kochsalzlösung aus der minderwertigen Vena Cava in die Leber Venen, führt zur Erweiterung der Leber und hydrodynamischen Transfektion von Hepatozyten7. Um stabile genomischen Integration zu erreichen, wurde die Methode mit Transposon-basierte Vektoren, wie die Schönheit -Transposon Schlafsystem kombiniert. Diese Systeme vermittelt die Rekombination von Ziel Vektoren mit genomischen Rekombination katalysiert durch ein schlafen Schönheit -Transposase8,9. Für Modelle der Leberfibrose oder Karzinogenese ist es oft wünschenswert, Overexpress oder Stille Gene zu bestimmten Zeitpunkten das Krankheitsmodell. Zu diesem Zweck Werkzeuge für induzierbaren Genexpression wie das Cre/LoxP-System oder Tetracyclin-induzierbaren gen Expressionssystems (Tet-On) können gebrauchte10sein.
Hier beschreiben wir ein Protokoll für in Vivo Transfektion von murinen Hepatozyten mit HTVI ein Dornröschen Transposon-basiertes System. Zusätzlich ein Protokoll für stabil, konstitutive Expression des Transgens unter der Kontrolle eines Leber-spezifischen Promotors, beschreiben wir eine erweiterte Vektorsystem, das konstitutive Tamoxifen-abhängige Cre-Rekombinase (CreER) Ausdruck mit vereint die induzierbaren Ausdruck eines Transgen oder MicroRNA angepasst ShRNA (MiR-ShRNA), genannt der pTC TET-System11. In dieses Vektorsystem werden induzierbaren transgene oder MiR-ShRNAs für Tetracyclin-abhängigen Ausdruck in den Backbone-Vektor mit einem recombinational Klonen-System ermöglicht die schnelle und einfache Generation neuen Vektoren12geklont. In diesem Video-basierte Führer werden Zubereitung von geeigneten Vektoren, Injektion und Behandlung von Mäusen, induzierbaren Transgen/MiR-ShRNA Ausdruck zu erreichen, und schließlich die Vorbereitung des Lebergewebes für die Analyse. In diesem Protokoll beschriebene Methode wurde entwickelt, um die Kombination eines Cre/LoxP vermittelte Maus Systems mit dem Ausdruck oder Knock-down-Wahl, so dass es ein allgemein einsetzbares System in der Forschung von Lebererkrankungen-gen zu aktivieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>General Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#SM1331</td>
			<td>DNA ladder for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T.</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>embedding of cryo-sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biozym LE Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7637-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Saccharose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4621.1</td>
			<td>For sweetening of the doxycyline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0839,0010</td>
			<td>For selection of Amp-resistant clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar (Luria/Miller)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X969.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Luria/Miller)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. Medium</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1492,0001</td>
			<td>For selection of Gentamicin-resistant clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Histofix 4 %</td>
			<td>Fa. Roth</td>
			<td>P087.6</td>
			<td>para-formaldehyde solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix</td>
			<td>invitrogen/ThermoFisher</td>
			<td>11791-020</td>
			<td>contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB3.1 Competent Cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11782-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stbl3 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AscI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0558S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FseI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0588S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0156S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0133S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BfuAI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0701S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>For DNA Extraction from gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean Up</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740609.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond PC20</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740571</td>
			<td>Plasmid extraction (Mini prep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond PC500</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740574</td>
			<td>Plasmid extraction (Maxi prep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for Mouse Experiments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injekt Syringe F 1 ml</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9166017V</td>
			<td>For intraperitoneal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix Luer 3 ml</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4616025V</td>
			<td>For intravenous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican Cannula 24G</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4657675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican Cannula 27G</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4657705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td>For CreER activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8267-500ML</td>
			<td>Carrier for tamoxifen injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2951,0025</td>
			<td>Activation of tetracycline-dependent expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injekt 10 ml Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur S 0.2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>831,826,001</td>
			<td>For filtration of doxycycline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0,9%</td>
			<td>Braun</td>
			<td>3200905</td>
			<td>Carrier for intravenous injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Conical Tube 50ml</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared Lamp</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For warming of mouse tail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>In vivo imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTC</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>Vector for constitutive gene expression, ref. 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEN_TTmcs</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #25755</td>
			<td>Entry vector for inducible gene expression, ref. 19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEN_TTGmiRc2</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #25753</td>
			<td>Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEN_TTmiRc2</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #25752</td>
			<td>Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTC ApoE-Tet</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #85578</td>
			<td>Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTC-CMV-Tet</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #85577</td>
			<td>Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

constitutive and inducible systems for genetic in vivo modification of mouse hepatocytes using hydrodynamic tail vein injection

In Forschungsmodelle von Leberkrebs, Regeneration, Entzündung und Fibrose sind flexible Systeme für in Vivo Genexpression und zum Schweigen bringen sehr nützlich. Hydrodynamische Schweif Vene Injektion Transposon-basierte Konstrukte ist eine effiziente Methode für die genetische Manipulation von Hepatozyten bei Erwachsenen Mäusen. Neben der konstitutiven Transgene Ausdruck kann dieses System für erweiterte Anwendungen, z. B. ShRNA-mediated Gene Knock-down-Implikation der CRISPR/Cas9 System induzieren Genmutationen oder induzierbaren Systeme verwendet werden. Hier präsentiert sich die Kombination von konstitutiven CreER Ausdruck zusammen mit induzierbaren Ausdruck ein Transgen oder MiR-ShRNA Wahl als ein Beispiel für diese Technik. Wir decken das mehrstufige Verfahren ausgehend von der Vorbereitung der Dornröschen-Transposon konstruiert, um die Injektion und die Behandlung von Mäusen und die Vorbereitung des Lebergewebes zur Analyse von Immunostaining. Das vorgestellte System ist eine zuverlässige und effiziente Vorgehensweise zu komplexen genetischen Manipulationen in Hepatozyten. Es ist besonders nützlich in Kombination mit Cre/LoxP-basierte Mausstämme und kann auf eine Vielzahl von Modellen in der Erforschung von Lebererkrankungen angewendet werden.

Transfection Wirksamkeit durch hydrodynamische Schweif Vene Injektion: Der Anteil der murinen Hepatozyten, die von einer einzigen Injektion hydrodynamisch transfiziert sind ist variabel und hängt von mehrere Parameter wie Einspritzmenge, Einspritzzeit, Menge des injizierten DNA und Größe des injizierten Konstrukt6, 22,23. Darüber hinaus ist die Transfektion Effizienz bei gr?...

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Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Konstitutive und induzierbaren Systeme für genetische In Vivo Änderung der Maus Hepatozyten mit hydrodynamischen Tail Vene Injektion

Hydrodynamische Schweif Vene Injektion von Transposon-basierte Integration Vektoren ermöglicht stabile Transfektion von murinen Hepatozyten in-vivo. Hier präsentieren wir Ihnen eine praktische Protokoll für die Transfektion Systeme, die der langfristigen konstitutive Ausdruck von einem einzigen Transgen oder kombinierte konstitutiven und Doxycyclin-induzierbaren Ausdruck eines Transgen oder MiR-ShRNA in der Leber ermöglicht.

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetische Manipulation der Pflanze Pathogen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Zu Pilzbiologie und Pflanzen Mikroben-Interaktionen Studie

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Forschung

Genetik

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-vermittelten gezielte Integration In Vivo mit einer Homologie-vermittelte Ende verbinden-basierte Strategie

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolierung, Charakterisierung und RNA-basierte gentechnische Veränderung von menschlichen Dental follikelstimulierendes Stammzellen

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

Induzierbaren und Reversible Dominant-Negative (DN) Protein Hemmung

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Charakterisierung von Histon Post-translationale Modifikation Veränderungen in Hefe Neurodegenerative Proteinopathy Modelle

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

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Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

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There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

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Gepoolte CRISPR-basierte genetische Screens in Säugetierzellen

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

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Tomatenwurzeltransformation gefolgt von Impfung mit Ralstonia Solanacearum für einfache genetische Analyse der bakteriellen Wilt-Krankheit

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...