Name: constitutive and inducible systems for genetic in vivo modification of mouse hepatocytes using hydrodynamic tail vein injection
Uploaded: 2018-02-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי דויטשה Krebshilfe, גרמניה (מספר גרנט 111289 כדי UE), הקרן ולוסיל פקארד הבריאות של הילדים (ארנסט, אמיליה גאלו ניחן הבתר - CTSA מספר גרנט UL1 RR025744 מורה). אנו מודים ד ר מארק א קיי על וקטור בונה ותמיכה עצה ניסיוני ומרווה ג'וליאן ד ר עבור עכברים ו ניסיוני.

כל הניסויים בוצעו על פי ההנחיות עבור טיפול והשתמש של חיות מעבדה ואושרו על-ידי הרשויות אחראי (Regierung פון Oberbayern, מינכן, גרמניה, סטנפורד מוסדיים חיה טיפול, שימוש הוועדה, בסטנפורד, קליפורניה, ארה ב). רשימה של כל פלסמידים לקראת שיבוט (שלב 1 עד 4) מסופק בטבלה משלים S1.
1. שכפול של Transgene עבור ...

תרביות תאים של hepatocytes עם הזרקת וריד הזנב hydrodynamic הפכה שיטה הוקמה מאז השקתו לפני יותר מ- 15 שנה6. אמצעי האחסון מוזרק חורג תפוקת הלב, זורם מן הכלילי התחתון לתוך sinusoids של הכבד7, שמוביל תקנים של בערך 10-20%, במקרים מסוימים עד 40% של hepatocytes25,26. גורמ...

מחלת כבד כרונית מציג ברחבי העולם נטל1הבריאותיות העיקריים. מחקר בבעלי חיים מודלים כלים מהותיים בחקר מחלת כבד, סייעו לענות על שאלות מורכבות התחדשות כבד, דלקת הכבד, ו steatosis, כמו גם סרטן הכבד2. מספר ניכר של מודלים בבעלי חיים אלה מסתמכים על השינוי הגנטי של תאי כבד. לכן, כלים יעילים לתמרן ביטוי גנים ב hepatocytes הן מועילות3. הוקמה שיטות כגון הרבייה של זנים מהונדסים גנטית עכבר או הדור של וקטורים ויראלי לדלקת hepatocyte נמצאים גם הנמל זמן רב, חששות בטיחות, או תשואה transgene המסכן ביטוי hepatocytes ויוו 4 , 5. הזרקת וריד הזנב hydrodynamic (HTVI) היא שיטה חלופית עבור ויוו תקנים של hepatocytes המאפשר קל, מהיר ויעיל עלות חקירת פונקציה ג'ין בכבד. עבור HTVI, וקטור נושאת את רצף ה-DNA הרצוי הוא מומס נפח תמיסת המתאים ל-10% של משקל הגוף של החיה מוזרק. הפתרון אז מוזרק לווריד הזנב תוך 5-10 s6. העולה על תפוקת הלב, תמיסת המלח זורם מן הכלילי התחתון לתוך הורידים בכבד, המוביל אל הרחבה של הכבד, תרביות תאים hydrodynamic של hepatocytes7. כדי להשיג אינטגרציה הגנומי יציב, השיטה יש כבר בשילוב עם וקטורים מבוססי transposon, כגון מערכת שינה יופי -transposon. מערכות זו שמתווכת על רקומבינציה של וקטורים היעד עם רקומבינציה גנומית אתרים על ידי שינה יופי -transposase8,9. עבור מודלים של פיברוזיס בכבד או carcinogenesis, רצוי לעיתים קרובות כדי גנים overexpress או השתיקה בנקודות זמן מסוימות של מודל המחלה. למטרה זו, כלי ביטוי גנים inducible כגון Cre/LoxP-המערכת או מערכת ביטוי גנים inducible-טטרציקלין (ט-על) עשוי להיות בשימוש10.
כאן, אנו מתארים עבור ויוו תקנים של hepatocytes מאתר באמצעות HTVI של היפהפייה הנרדמת transposon מערכת מבוססת פרוטוקול. בנוסף פרוטוקול לביטוי יציב, המכונן של transgene תחת השליטה של מקדם מכירות ספציפי לכבד, נתאר מערכת וקטור מתקדמים יותר המשלבת ביטוי recombinase (CreER) Cre תלויי-טמוקסיפן מכוננת עם הביטוי inducible של transgene או הותאם-microRNA shRNA (מיר-shRNA), קרא על המנגל ט-מערכת11. במערכת זו וקטור, inducible transgenes או מיר-shRNAs תלויי-טטרציקלין ביטוי הם משובטים לתוך המבוססת על עמוד השדרה עם מערכת השכפול recombinational, המאפשר הדור קלה ומהירה של וקטורים חדש12. מדריך זה מבוסס וידאו מכסה את הכנת וקטורים מתאימים, הזרקת וטיפול של עכברים כדי להשיג את הביטוי transgene/מיר-shRNA inducible והכנת סוף סוף רקמת הכבד לניתוח. השיטה המתוארת ב פרוטוקול זה תוכנן כדי לאפשר השילוב של כל מערכת עכבר Cre/loxP משולבת עם ביטוי או דפיקה למטה של כל הגנים של בחירה, שהופך אותו מערכת החלים נרחב במחקר של מחלות כבד.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>General Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#SM1331</td>
			<td>DNA ladder for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T.</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>embedding of cryo-sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biozym LE Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7637-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Saccharose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4621.1</td>
			<td>For sweetening of the doxycyline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0839,0010</td>
			<td>For selection of Amp-resistant clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar (Luria/Miller)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X969.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Luria/Miller)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. Medium</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1492,0001</td>
			<td>For selection of Gentamicin-resistant clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Histofix 4 %</td>
			<td>Fa. Roth</td>
			<td>P087.6</td>
			<td>para-formaldehyde solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix</td>
			<td>invitrogen/ThermoFisher</td>
			<td>11791-020</td>
			<td>contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB3.1 Competent Cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11782-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stbl3 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AscI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0558S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FseI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0588S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0156S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0133S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BfuAI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0701S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>For DNA Extraction from gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean Up</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740609.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond PC20</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740571</td>
			<td>Plasmid extraction (Mini prep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond PC500</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740574</td>
			<td>Plasmid extraction (Maxi prep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for Mouse Experiments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injekt Syringe F 1 ml</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9166017V</td>
			<td>For intraperitoneal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix Luer 3 ml</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4616025V</td>
			<td>For intravenous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican Cannula 24G</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4657675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican Cannula 27G</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4657705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td>For CreER activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8267-500ML</td>
			<td>Carrier for tamoxifen injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2951,0025</td>
			<td>Activation of tetracycline-dependent expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injekt 10 ml Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur S 0.2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>831,826,001</td>
			<td>For filtration of doxycycline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0,9%</td>
			<td>Braun</td>
			<td>3200905</td>
			<td>Carrier for intravenous injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Conical Tube 50ml</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared Lamp</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For warming of mouse tail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>In vivo imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTC</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>Vector for constitutive gene expression, ref. 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEN_TTmcs</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #25755</td>
			<td>Entry vector for inducible gene expression, ref. 19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEN_TTGmiRc2</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #25753</td>
			<td>Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEN_TTmiRc2</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #25752</td>
			<td>Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTC ApoE-Tet</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #85578</td>
			<td>Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTC-CMV-Tet</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #85577</td>
			<td>Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

constitutive and inducible systems for genetic in vivo modification of mouse hepatocytes using hydrodynamic tail vein injection

במודלים המחקר של סרטן הכבד, התחדשות, דלקת, פיברוזיס, מערכות גמיש ויוו ביטוי גנים והשתקה שימושיות מאוד. הזרקת וריד הזנב hydrodynamic של המבנים מבוססי transposon היא שיטה יעילה עבור הנדסה גנטית של hepatocytes בעכברים בוגרים. בנוסף לביטוי transgene המכונן, מערכת זו יכול לשמש ליישומים מתקדמים יותר, כגון בתיווך shRNA גן במשתמע דפיקה למטה, את מערכת CRISPR/Cas9 כדי ליצור מוטציות או מערכות inducible. כאן, השילוב של הביטוי CreER מכוננת יחד עם ביטוי inducible של transgene או מיר-shRNA להתמקד מוצג בתור דוגמה של טכניקה זו. אנו מכסים את ההליך רב שלבי החל משלב הכנת היפהפיה הנרדמת-transposon בונה, הזרקה, וטיפול של עכברים, הכנת רקמת הכבד לניתוח על ידי immunostaining. מערכת הציג היא גישה אמין ויעיל להשגת שינויים גנטיים מורכבים ב hepatocytes. היא שימושית במיוחד בשילוב עם זנים העכבר מבוססות-Cre/loxP, ניתן להחיל על מגוון דגמים בחקר מחלת כבד.

תקנים היעילות באמצעות הזרקת וריד הזנב hydrodynamic: האחוז של hepatocytes מאתר זה הם transfected hydrodynamically על ידי זריקה אחת הוא משתנה ותלוי במספר פרמטרים כגון נפח הזרקה, הזרקת זמן, כמות ה-DNA מוזרק וגודל של הבונה מוזרק6, 22,23. בנוסף, ה?...

Watch this Scientific Journal Video about Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection at JoVE.com

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

מערכות מכוננת Inducible עבור שינוי גנטי In Vivo של העכבר Hepatocytes באמצעות הזרקת וריד הזנב Hydrodynamic

הזרקת וריד הזנב hydrodynamic של וקטורים אינטגרציה מבוססת-transposon מאפשרת יציבה תרביות תאים של hepatocytes מאתר ויוו. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מעשית למערכות תרביות תאים המאפשרת ביטוי מכוננת ארוכת טווח של transgene יחיד או ביטוי מכוננת ו דוקסיציקלין-inducible משולב של transgene או של מיר-shRNA בכבד.

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

מניפולציה גנטית של פתוגן הצמח<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; ללמוד ביולוגיה פטרייתי אינטראקציות חיידק צמח

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-מתווכת אינטגרציה יישוב In Vivo באמצעות אסטרטגיה מבוסס על הצטרפות סוף בתיווך הומולוגיה

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

בידוד, אפיון, ההנדסה הגנטית מבוסס-MicroRNA, בתאי גזע אנושיים זקיק שיניים

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

עיכוב חלבונים inducible והפיך דומיננטי שלילי (DN)

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

אפיון שינויים Post-translational שינוי היסטון במודלים ניווניות Proteinopathy שמרים

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, תאים ייחודיים לסוג ביטוי תודרנית לבנה בתיווך דרך LhGR טרנס-הפעלה

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

במחקר פונקציונלי Vivo של מחלות-הקשורים משתנים אנושיים נדירים באמצעות Drosophila ילה

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

ב Vivo Forward המסך הגנטי כדי לזהות גנים נוירוגינים הרומן ב Drosophila ילה melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

מסכי גנטי מבוססי CRISPR במאגר תאים ממיונקים

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

שורש עגבניות המרה ואחריו חיסונים עם Ralstonia Solanacearum ניתוח גנטי פשוט של מחלת וילט חיידקי

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...