Name: constitutive and inducible systems for genetic in vivo modification of mouse hepatocytes using hydrodynamic tail vein injection
Uploaded: 2018-02-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Krebshilfe, Tyskland (bevilgning nummer 111289 til UE), Lucile Packard Foundation for barns helse (Ernest og Amelia Gallo utstyrt postdoktorstipend - CTSA bevilgning nummer UL1 RR025744 til UE). Vi takker Dr. Mark A. Kay for vektor konstruksjoner og eksperimentelle råd og Dr Julien Sage for mus og eksperimentell støtte.

Alle dyreforsøk ble utført i henhold til retningslinjer og bruk av forsøksdyr og ble godkjent av ansvarlig myndigheter (Regierung von Oberbayern, München, Tyskland og Stanford institusjonelle dyr omsorg og bruke komiteen, Stanford, CA, USA). En liste over alle plasmider for kloning (trinn 1 til 4) angis i supplerende tabell S1.
1. kloning av et Transgene for grunnleggende genuttrykk
<ol><li>Utforme primere for transgene forsterkning13,...

Hva hepatocytes med etter halen blodåre injeksjon har blitt en etablert metode siden introduksjonen mer enn 15 år siden6. Injisert volumet overskrider blodsirkulasjon og munner fra de mindreverdige vena cava sinusoids av leveren7, fører til transfection på ca 10-20%, i noen tilfeller opp til 40% av hepatocytter25,26. Prediktorer for en vellykket hva er injisert volumet per injisert tid22<...

Kronisk leversykdom presenterer store helse byrden verden1. Forsøksdyrutvalget modeller er viktige verktøy i studiet av leversykdom og har bidratt til å svare på komplekse spørsmål i leveren gjenfødelse, hepatic betennelse, og Steatose samt leverkreft2. Et betydelig antall av disse dyremodeller avhengige genmodifisering av leverceller. Effektive verktøy for å manipulere byggkorn under hepatocytter er derfor nyttig3. Etablerte metoder som oppdrett av genmodifiserte musen stammer eller generering av viral vektorer for hepatocyte infeksjon er enten tidkrevende, havn sikkerhet bekymringer, eller gir dårlig transgene uttrykk i hepatocytter i vivo 4 , 5. etter halen blodåre injeksjon (HTVI) er en alternativ metode for i vivo transfection hepatocytes muliggjør enkel, rask og kostnadseffektiv avhør av gen funksjon i leveren. For HTVI oppløses en vektor bærer ønsket DNA sekvensen i et volum saltoppløsning tilsvarende 10% av kroppsvekten til injisert dyret. Løsningen er deretter sprøytes inn hale venen i 5-10 s6. Overstiger blodsirkulasjon, flyter saltkildene fra de mindreverdige vena cava i leveren vener, fører til utvidelse av leveren og etter transfection av hepatocytter7. For å oppnå stabil genomisk integrasjon, blitt metoden kombinert med transposon-baserte vektorer, slik som sove skjønnhet -transposon systemet. Denne systemer formidler rekombinasjon målet vektorer med genomisk rekombinasjon nettsteder katalysert av en sovende skjønnhet -transposase8,9. Modeller av leveren fibrosis eller kreft er det ofte ønskelig å overexpress eller stillhet gener på bestemte tidspunkt av sykdom modell. For dette formålet, verktøy for induserbart genuttrykk som grobunn/LoxP-systemet eller tetracyclin-induserbart gene expression systemet (Tet-på) kan være brukt10.
Her beskriver vi en protokoll for i vivo transfection murine hepatocytes bruker HTVI av en Tornerose transposon-basert system. I tillegg til en protokoll for stabil, konstituerende uttrykk for en transgene under kontroll av en lever-spesifikke promoter, beskriver vi en mer avansert vektor-system som kombinerer grunnleggende tamoxifen-avhengige grobunn recombinase (CreER) uttrykk med den induserbart uttrykk av transgene eller microRNA-tilpasset shRNA (miR-shRNA), kalt pTC TET-systemet11. I dette vektor systemet samsvarer induserbart effekter av transgener eller miR-shRNAs for tetracycline-avhengige uttrykket i av ryggrad vektor med en recombinational kloning system, gir rask og enkel generering av nye vektorer12. Denne video-basert veiledningen dekker forberedelse egnet vektorer, injeksjon og behandling av mus å oppnå induserbart transgene/miR-shRNA uttrykk, og endelig utarbeidelse av leveren vev for analyse. Metoden beskrevet i denne protokollen ble utformet slik at kombinasjonen av grobunn/loxP mediert musen system med uttrykket eller sammenleggbare av noen genet valgfrihet, noe som gjør det til et allment gjeldende system i forskning av leversykdom.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>General Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#SM1331</td>
			<td>DNA ladder for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T.</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>embedding of cryo-sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biozym LE Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7637-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Saccharose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4621.1</td>
			<td>For sweetening of the doxycyline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0839,0010</td>
			<td>For selection of Amp-resistant clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar (Luria/Miller)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X969.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Luria/Miller)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. Medium</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1492,0001</td>
			<td>For selection of Gentamicin-resistant clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Histofix 4 %</td>
			<td>Fa. Roth</td>
			<td>P087.6</td>
			<td>para-formaldehyde solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix</td>
			<td>invitrogen/ThermoFisher</td>
			<td>11791-020</td>
			<td>contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB3.1 Competent Cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11782-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stbl3 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AscI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0558S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FseI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0588S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0156S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0133S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BfuAI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0701S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>For DNA Extraction from gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean Up</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740609.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond PC20</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740571</td>
			<td>Plasmid extraction (Mini prep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond PC500</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740574</td>
			<td>Plasmid extraction (Maxi prep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for Mouse Experiments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injekt Syringe F 1 ml</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9166017V</td>
			<td>For intraperitoneal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix Luer 3 ml</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4616025V</td>
			<td>For intravenous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican Cannula 24G</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4657675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican Cannula 27G</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4657705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td>For CreER activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8267-500ML</td>
			<td>Carrier for tamoxifen injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2951,0025</td>
			<td>Activation of tetracycline-dependent expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injekt 10 ml Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur S 0.2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>831,826,001</td>
			<td>For filtration of doxycycline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0,9%</td>
			<td>Braun</td>
			<td>3200905</td>
			<td>Carrier for intravenous injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Conical Tube 50ml</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared Lamp</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For warming of mouse tail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>In vivo imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTC</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>Vector for constitutive gene expression, ref. 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEN_TTmcs</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #25755</td>
			<td>Entry vector for inducible gene expression, ref. 19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEN_TTGmiRc2</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #25753</td>
			<td>Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEN_TTmiRc2</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #25752</td>
			<td>Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTC ApoE-Tet</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #85578</td>
			<td>Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTC-CMV-Tet</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #85577</td>
			<td>Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

constitutive and inducible systems for genetic in vivo modification of mouse hepatocytes using hydrodynamic tail vein injection

I forskning modeller av leverkreft, gjenfødelse, betennelse og fibrose er fleksibel systemer for i vivo genuttrykk og stanse svært nyttig. Etter halen blodåre injeksjon av transposon-baserte konstruksjoner er en effektiv metode for genetisk manipulering av hepatocytter som voksen mus. I tillegg til grunnleggende transgene uttrykk, kan dette systemet brukes til mer avanserte programmer, for eksempel shRNA-mediert genet sammenleggbare, Implikasjonen av CRISPR/Cas9 systemet å indusere genet mutasjoner eller induserbart systemer. Her er kombinasjonen av grunnleggende CreER uttrykk med induserbart uttrykk for en transgene eller miR-shRNA av valget presentert som et eksempel på denne teknikken. Vi dekker flere trinn prosedyren fra utarbeidelse av Tornerose-transposon konstruerer, injeksjon og behandling av mus og utarbeidelse av leveren vev for analyse av immunostaining. Systemet presentert er en pålitelig og effektiv tilnærming til å oppnå komplekse genetisk manipulasjon i hepatocytter. Det er spesielt nyttig i kombinasjon med grobunn/loxP-baserte musen stammer og kan brukes til en rekke modeller med forskning rundt leversykdom.

Hva effekten av etter halen blodåre injeksjon: Andelen murine hepatocytter som er transfekterte hydrodynamically av en enkelt injeksjon er variabel og avhenger av flere parametere som injeksjon volum, injeksjon tid, mengden injisert DNA og størrelsen på de injiserte konstruere6, 22,23. Dessuten er hva effektivitet generelt lavere i større dyrene, der en større vaskulær dia...

Watch this Scientific Journal Video about Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection at JoVE.com

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Grunnleggende og induserbart systemer for genetisk i Vivo endring av musen hepatocytter bruker etter halen blodåre injeksjon

Etter halen blodåre injeksjon av transposon-baserte integrering vektorer gjør stabil transfection murine hepatocytes i vivo. Her presenterer vi en praktisk protokoll for transfection systemer som gjør det muliggjør langsiktige grunnleggende uttrykk for en enkelt transgene eller kombinert konstituerende og doxycycline-induserbart uttrykk av transgene eller miR-shRNA i leveren.

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetisk manipulering av Plant Patogen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Å studere Fungal Biology and Plant mikrobe interaksjoner

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediert målrettet integrering i Vivo med en homologi-mediert slutten begynte-basert strategi

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolering og karakterisering MicroRNA-baserte genetisk modifisering av menneskelig Dental hårsekken stamceller

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

Induserbart og reversibel dominerende-negativ (DN) Protein hemming

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Karakterisere Histone post-translasjonell modifikasjon endringer i gjær nevrodegenerative Proteinopathy modeller

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Induserbart, celle Type-spesifikk uttrykk i Arabidopsis thaliana gjennom LhGR-mediert Trans-aktivisering

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In vivo funksjonell studie av sykdom-Associated sjeldne Human varianter bruke Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In vivo Forward genetisk Screen å identifisere Novel nervecellene gener i Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Samlede CRISPR-baserte genetiske skjermer i pattedyrceller

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Tomatrottransformasjon etterfulgt av inokulasjon med Ralstonia Solanacearum for enkel genetisk analyse av bakteriell wiltsykdom

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...