Name: constitutive and inducible systems for genetic in vivo modification of mouse hepatocytes using hydrodynamic tail vein injection
Uploaded: 2018-02-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela Deutsche Krebshilfe, Alemanha (número de concessão 111289 a UE), a Lucile Packard Foundation para a saúde das crianças (Ernest e Amelia Gallo dotado Postdoctoral Fellowship - número de concessão CTSA UL1 RR025744 a UE). Agradecemos o Dr Mark A. Kay para construções de vetor e suporte experimental conselhos e Dr Julien Sage para ratos e experimental.

Todas as experiências em animais foram realizadas de acordo com as orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório e foram aprovadas pelas autoridades responsáveis (Regierung von Oberbayern, Munique, Alemanha e Stanford cuidados institucionais do Animal e usar Comité, Stanford, CA, EUA). Uma lista de todos os plasmídeos de clonagem (passo 1 a 4) é fornecida na tabela complementar S1.
1. a clonagem de um Transgene para expressão gênica constitutiva
<ol><li>Desenho de pr...

Transfecção de hepatócitos com injeção de veia de cauda hidrodinâmica tornou-se um método estabelecido desde a sua introdução há mais de 15 anos6. O volume injetado excede o débito cardíaco e flui da veia cava inferior para os sinusoides do fígado7, levando a transfeccao de cerca de 10-20%, em alguns casos até 40% dos hepatócitos25,26. Preditores de um bem sucedida do transfection são o volume injeta...

Doença hepática crônica apresenta um fardo de saúde em todo o mundo1. Modelos de pesquisas com animais são ferramentas essenciais no estudo da doença hepática e ajudaram a responder questões complexas na regeneração hepática, inflamação hepática, esteatose hepática e câncer de fígado2. Um número substancial desses modelos animais depende da modificação genética das células do fígado. Portanto, ferramentas eficientes para manipular a expressão gênica em hepatócitos são úteis3. Estabelecidos métodos tais como a reprodução de linhagens geneticamente modificados do mouse ou a geração de vetores virais para a infecção do hepatócito são ou demorado, Porto preocupações de segurança, ou produzem expressão do transgene pobre em hepatócitos na vivo 4 , 5. injeção de veia de cauda hidrodinâmica (HTVI) é um método alternativo para transfeccao na vivo dos hepatócitos, permitindo a fácil, rápido e eficiente de interrogatório da função do gene no fígado. Para HTVI, um vetor carregando a sequência de DNA desejada é dissolvido em um volume de solução salina, correspondente a 10% do peso corporal do animal injetado. A solução então é injetada na veia da cauda dentro de 5-10 s6. Excedendo o débito cardíaco, o soro flui da veia cava inferior nas veias hepáticas, levando a expansão do fígado e transfection hidrodinâmico de hepatócitos7. Para conseguir a integração estável de genômica, o método foi combinado com transposon-com base em vetores, como o sistema de transposon dormir beleza. Este sistemas Medeia a recombinação de vetores de alvo com sites de recombinação genômica catalisadas por uma de8,de transposase dormir beleza -9. Para modelos de fibrose hepática ou carcinogênese, muitas vezes é desejável para genes overexpress ou silêncio em determinados pontos do tempo do modelo de doença. Para esta finalidade, ferramentas para expressão de gene inducible, tais como o sistema Cre/LoxP ou o sistema de expressão de gene tetraciclina-inducible (Tet-On) pode ser usado10.
Aqui, descrevemos um protocolo para transfeccao na vivo de hepatócitos murino usando HTVI de um sistema baseado em transposon bela adormecida . Além de um protocolo para a expressão estável, constitutiva de um transgene sob o controle de um promotor específico fígado, descrevemos um sistema mais avançado de vetor que combina expressão constitutiva da recombinase (CreER) do Cre tamoxifeno-dependente com o expressão inducible de um transgene ou microRNA-adaptado de shRNA (miR-shRNA), chamado o pTC TET-sistema11. Neste sistema de vetor, inducible transgenes ou miR-shRNAs para expressão dependente de tetraciclina são clonados no vetor coluna vertebral com um sistema de clonagem recombinational, permitindo a geração de novos vetores12rápida e fácil. Este guia em vídeo abrange a preparação de vetores apropriados, injeção e tratamento de ratos para alcançar expressão inducible do transgene/miR-shRNA e, finalmente, a preparação do tecido do fígado para análise. O método descrito neste protocolo foi projetado para permitir a combinação de qualquer sistema de rato Cre/loxP mediada com a expressão ou batida para baixo de qualquer gene de escolha, tornando-se um sistema amplamente aplicável na investigação de doença hepática.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>General Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#SM1331</td>
			<td>DNA ladder for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T.</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>embedding of cryo-sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biozym LE Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7637-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Saccharose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4621.1</td>
			<td>For sweetening of the doxycyline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0839,0010</td>
			<td>For selection of Amp-resistant clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar (Luria/Miller)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X969.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Luria/Miller)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. Medium</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1492,0001</td>
			<td>For selection of Gentamicin-resistant clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Histofix 4 %</td>
			<td>Fa. Roth</td>
			<td>P087.6</td>
			<td>para-formaldehyde solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix</td>
			<td>invitrogen/ThermoFisher</td>
			<td>11791-020</td>
			<td>contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB3.1 Competent Cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11782-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stbl3 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AscI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0558S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FseI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0588S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0156S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0133S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BfuAI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0701S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>For DNA Extraction from gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean Up</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740609.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond PC20</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740571</td>
			<td>Plasmid extraction (Mini prep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond PC500</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740574</td>
			<td>Plasmid extraction (Maxi prep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for Mouse Experiments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injekt Syringe F 1 ml</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9166017V</td>
			<td>For intraperitoneal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix Luer 3 ml</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4616025V</td>
			<td>For intravenous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican Cannula 24G</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4657675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican Cannula 27G</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4657705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td>For CreER activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8267-500ML</td>
			<td>Carrier for tamoxifen injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2951,0025</td>
			<td>Activation of tetracycline-dependent expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injekt 10 ml Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur S 0.2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>831,826,001</td>
			<td>For filtration of doxycycline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0,9%</td>
			<td>Braun</td>
			<td>3200905</td>
			<td>Carrier for intravenous injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Conical Tube 50ml</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared Lamp</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For warming of mouse tail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>In vivo imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTC</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>Vector for constitutive gene expression, ref. 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEN_TTmcs</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #25755</td>
			<td>Entry vector for inducible gene expression, ref. 19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEN_TTGmiRc2</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #25753</td>
			<td>Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEN_TTmiRc2</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #25752</td>
			<td>Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTC ApoE-Tet</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #85578</td>
			<td>Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTC-CMV-Tet</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #85577</td>
			<td>Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

constitutive and inducible systems for genetic in vivo modification of mouse hepatocytes using hydrodynamic tail vein injection

Modelos de pesquisa de câncer de fígado, regeneração, inflamação e fibrose, sistemas flexíveis para a expressão do gene na vivo e silenciamento são altamente úteis. Injeção de veia cauda hidrodinâmica de construções baseadas em transposon é um método eficiente para manipulação genética dos hepatócitos em ratos adultos. Além de expressão constitutiva do transgene, este sistema pode ser usado para aplicações mais avançadas, tais como implicação de knock-down, mediada por shRNA gene do sistema CRISPR/Cas9 para induzir mutações genéticas, ou sistemas inducible. Aqui, a combinação de expressão constitutiva de CreER juntamente com expressão inducible de um transgene ou miR-shRNA de escolha é apresentado como um exemplo dessa técnica. Cobrimos o processo de várias etapa, a partir da preparação da bela adormecida-transposon constrói, a injeção e o tratamento de ratos e a preparação do tecido do fígado para análise por imunocoloração. O sistema apresentado é uma abordagem eficiente e confiável para realizar manipulações genéticas complexas nos hepatócitos. É especialmente útil em combinação com cepas de rato Cre/loxP-baseado e pode ser aplicado a uma variedade de modelos na pesquisa de doença hepática.

Eficácia transfection por injeção de veia de cauda hidrodinâmica: A porcentagem de hepatócitos murino que são transfectadas direccionado por uma única injeção é variável e depende de vários parâmetros tais como o volume de injeção, tempo de injeção, quantidade de DNA injetado e tamanho da construção injetado6, 22,23. Além disso, a eficiência de transfeccao ?...

Watch this Scientific Journal Video about Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection at JoVE.com

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutivos e Inducible sistemas para modificação genética In Vivo dos hepatócitos de rato usando injeção de veia de cauda hidrodinâmica

Permite a injeção de veia cauda hidrodinâmica de vetores de integração baseada em transposon transfection estável de hepatócitos murino in vivo. Aqui, apresentamos um protocolo prático para sistemas de transfeccao que permite a longo prazo expressão constitutiva de um transgene único ou expressão constitutiva e doxiciclina-inducible combinada de um transgene ou miR-shRNA no fígado.

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Manipulação genética do patógeno de planta<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Estudar Biologia fúngicos e vegetais Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Genética

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Integração de alvo CRISPR/Cas9-mediada na Vivo usando uma estratégia de baseada em juntar-se mediada por homologia final

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolamento, caracterização e baseada em MicroRNA modificação genética de células-tronco humanas folículo Dental

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

Inibição de proteína inducible e reversível dominante-negativo (DN)

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Caracterizando a histona modificação pós-traducional alterações nos modelos de Neurodegenerative Proteinopathy de levedura

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, expressão de tipo específico de célula em Arabidopsis thaliana mediada através de LhGR Trans-ativação

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Estudo funcional in vivo de variantes humanas raras associadas à doença usando Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In vivo Forward genética Screen para identificar novos genes neuroprotetores em Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Telas genéticas com base em CRISPR agrupadas em células de mamíferos

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Transformação da Raiz do Tomate Seguida de Inoculação com Ralstonia Solanacearum para Análise Genética Direta da Doença de Wilt Bacteriano

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...