Name: constitutive and inducible systems for genetic in vivo modification of mouse hepatocytes using hydrodynamic tail vein injection
Uploaded: 2018-02-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection at JoVE.com

Эта работа была поддержана Deutsche Krebshilfe, Германия (номер 111289 Грант для UE), Люсиль Паккард для здоровья детей (Эрнест и Амелия Галло наделены докторантура стипендий - CTSA номер гранта УЛ1 RR025744 для UE). Мы благодарим д-р Марк а. Кей для векторных конструкций и экспериментальной советы и д-р Жюльен Sage для мышей и экспериментальной поддержки.

Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами для ухода и использования лабораторных животных и были утверждены ответственные власти (Oberbayern фон Regierung, Мюнхен, Германия и Стэнфорд институциональный уход за животными и использовать Комитет, Стэнф?...

Трансфекция гепатоцитов с гидродинамическим хвост инъекции Вену стал установленным метод с момента ее введения более чем 15 лет назад6. Введенный объем превышает сердечного выброса и перетекает из нижней полой вены в синусоид печени7, ведущих к трансфекции око...

Хронические заболевания печени представляет основных медицинских бремя мира1. Исследования животных моделей являются важнейшими инструментами в исследовании болезни печени и помогли ответить на сложные вопросы в регенерации печени, печеночная воспаление и стеатоз, а также рака печени2. Значительное количество этих животных моделей полагаются на генетической модификации клеток печени. Таким образом эффективные инструменты для манипулирования экспрессии генов в гепатоцитах являются полезным3. Установленные методы селекции штаммов генетически модифицированные мыши или поколения вирусных векторов для гепатоцитов инфекции являются либо времени, гавань проблем безопасности, или дают бедным трансген выражение в гепатоциты в естественных условиях 4 , 5. инъекции Вену гидродинамических хвост (HTVI)-это альтернативный метод для в vivo трансфекции гепатоцитов, позволяя легко, быстро и экономически эффективных допрос функции гена в печени. Для HTVI вектор, перевозящих желаемой последовательности ДНК растворяется в объеме физраствора, соответствует 10% от массы тела животного вводят. Решение затем вводят в Вену хвост в течение 5-10 s6. Превышение сердечного выброса, солевой раствор вытекает из нижней полой вены в печени Вены, ведущих к расширению печени и гидродинамические трансфекции гепатоцитов7. Для достижения стабильного геномной интеграции, метод была объединена с transposon основе векторов, например Спящая красота -transposon системы. Эта систем опосредует рекомбинации целевой векторов с сайтов геномной рекомбинации, катализируемые Спящая красота -Транспозаза8,9. Для моделей фиброз печени или канцерогенеза желательно часто overexpress или молчание генов в определенные моменты времени модели болезни. Для этой цели, инструменты для экспрессии генов индуцибильный как LoxP/Cre системы или тетрациклин inducible gene выражение системы (тет-на) может быть используемые10.
Здесь мы описываем протокол в vivo трансфекции мышиных гепатоцитов, используя HTVI системы на базе transposon Спящая красавица . Помимо протокола для стабильного, учредительный выражение трансген под контролем печени конкретной промоутера, мы опишем более продвинутые векторная система, которая объединяет учредительный тамоксифен зависимых Cre рекомбиназа (CreER) выражение с индуцибельной выражение трансген или адаптированных микроРНК индуцируемый (мир индуцируемый), называется pTC тет системы11. В этой системе вектор в основу вектор с recombinational клонирования системы, что позволяет быстро и легко поколения новых векторов12клонируются индуцибельной трансгенов или мир процессируются тетрациклин зависимой выражения. Это видео на основе руководство охватывает подготовку подходящих векторов, инъекции и лечения мышей для достижения индуцибельной трансген/мир индуцируемый выражение и, наконец, подготовка ткани печени для анализа. Чтобы включить сочетание любых Cre/loxP при посредничестве системы мыши с выражением или нокдаун гена любого выбора, что делает его широко применяются системы исследований заболеваний печени был разработан метод, описанный в настоящем Протоколе.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>General Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#SM1331</td>
			<td>DNA ladder for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T.</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>embedding of cryo-sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biozym LE Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7637-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Saccharose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4621.1</td>
			<td>For sweetening of the doxycyline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0839,0010</td>
			<td>For selection of Amp-resistant clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar (Luria/Miller)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X969.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Luria/Miller)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. Medium</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1492,0001</td>
			<td>For selection of Gentamicin-resistant clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Histofix 4 %</td>
			<td>Fa. Roth</td>
			<td>P087.6</td>
			<td>para-formaldehyde solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix</td>
			<td>invitrogen/ThermoFisher</td>
			<td>11791-020</td>
			<td>contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB3.1 Competent Cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11782-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stbl3 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AscI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0558S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FseI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0588S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0156S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0133S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BfuAI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0701S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>For DNA Extraction from gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean Up</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740609.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond PC20</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740571</td>
			<td>Plasmid extraction (Mini prep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond PC500</td>
			<td>Macherey &#38; Nagel</td>
			<td>740574</td>
			<td>Plasmid extraction (Maxi prep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for Mouse Experiments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injekt Syringe F 1 ml</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9166017V</td>
			<td>For intraperitoneal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix Luer 3 ml</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4616025V</td>
			<td>For intravenous injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican Cannula 24G</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4657675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican Cannula 27G</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4657705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td>For CreER activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8267-500ML</td>
			<td>Carrier for tamoxifen injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2951,0025</td>
			<td>Activation of tetracycline-dependent expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injekt 10 ml Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur S 0.2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>831,826,001</td>
			<td>For filtration of doxycycline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0,9%</td>
			<td>Braun</td>
			<td>3200905</td>
			<td>Carrier for intravenous injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Conical Tube 50ml</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared Lamp</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For warming of mouse tail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>In vivo imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTC</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>Vector for constitutive gene expression, ref. 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEN_TTmcs</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #25755</td>
			<td>Entry vector for inducible gene expression, ref. 19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEN_TTGmiRc2</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #25753</td>
			<td>Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEN_TTmiRc2</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #25752</td>
			<td>Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTC ApoE-Tet</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #85578</td>
			<td>Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTC-CMV-Tet</td>
			<td></td>
			<td>Addgene #85577</td>
			<td>Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

constitutive and inducible systems for genetic in vivo modification of mouse hepatocytes using hydrodynamic tail vein injection

В модели исследования рака печени, регенерации, воспаление и фиброз гибкие системы в vivo экспрессии генов и глушителей являются весьма полезными. Гидродинамические хвост инъекции Вену конструкций на основе transposon является эффективным методом для генетических манипуляций гепатоцитов в взрослых мышей. Помимо выражения учредительный трансген эта система может использоваться для более сложных приложений, таких как индуцируемый опосредованной генов нокдаун, последствия ТРИФОСФАТЫ/Cas9 системы, чтобы вызвать мутации гена, или индуцибельной систем. Здесь сочетание учредительный CreER выражения вместе с индуцибельной выражение трансген или мир индуцируемый выбора представлен как пример этой техники. Мы покрываем многоступенчатого процедуры, начиная от подготовки Спящая красавица-transposon конструкции, инъекции и лечении мышей и подготовка ткани печени для анализа на иммуноокрашивания. Представлена система-это надежный и эффективный подход к достижению сложных генетических манипуляций в гепатоцитах. Он специально полезна в сочетании с КРР/loxP основанный мыши штаммов и может применяться для различных моделей в исследовании болезни печени.

Эффективность трансфекции путем инъекции Вену гидродинамических хвост: Процент мышиных гепатоцитов, которые являются transfected эжекции путем однократной инъекции является переменной и зависит от нескольких параметров, таких как объем впрыска, время впрыска, к...

Watch this Scientific Journal Video about Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection at JoVE.com

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Учредительные и индуцибельной систем для генетических в естественных условиях изменения мыши гепатоцитов, используя инъекции Вену гидродинамических хвост

Гидродинамические хвост инъекции Вену векторов интеграции на основе transposon позволяет Трансфекция стабильная мышиных гепатоцитов в vivo. Здесь мы представляем практический протокол transfection систем, позволяющий долгосрочный учредительный выражение одного трансген или комбинированных учредительных и доксициклин индуцибельной выражение трансген или мир индуцируемый в печени.

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Генетическая Манипуляция растений Возбудитель<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; По изучению Грибковые биологии и растений микробных взаимодействий

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной целенаправленной интеграции в естественных условиях с помощью стратегию на основе присоединения гомологии опосредованной конец

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Изоляция, характеристика и микроРНК основе генетической модификации человека Стоматологическая фолликула стволовых клеток

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

Ингибирование белков индуцибельной и обратимым Доминант отрицательной (DN)

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Характеризуя гистона столб-поступательные изменения изменения в моделях Neurodegenerative Proteinopathy дрожжей

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Индуцибельной, выражение определенного типа клеток в Arabidopsis thaliana через LhGR-опосредованной транс-активация

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

В Vivo Функциональное исследование связанных с болезнями редких человеческих вариантов с использованием дрозофилы

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

В Vivo Вперед генетический экран для выявления новых нейропротекторных генов в Drosophila меланогастер

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Объединенные ГЕНЕТИЧЕСКИе экраны на основе CRISPR в клетках млекопитающих

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Томатный корень Преобразование После прививки с Ralstonia Solanacearum для straightforward генетического анализа бактериальной болезни Wilt

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...