Name: improved 3d hydrogel cultures of primary glial cells for in vitro modelling of neuroinflammation
Uploaded: 2017-12-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation at JoVE.com

Forfatterne er taknemmelig for finansiel støtte fra NSERC, RFI, AIHS, Alberta sundhedstjenester og Davey Endowment for Brain Research.

Protokol til hjernen væv udvinding fra dag 1 Sprague Dawley rotte pups, aflivet ved halshugning, blev godkendt ved Animal Care og brug Udvalget på University of Alberta.
1. mikroglia og Astrocyte isolering67,68
Bemærk: Alle medier for isolation og cellekultur er forvarmet til 37 ° C i et vandbad. Hanks afbalanceret saltopløsning (HBSS) er 1% penicillin-streptomycin (PS). Alle Dulbecco ændrede Eagles medi...

Mod mål at skabe en 3D kultur system til model glial bioreactivity og glial ardannelse processen, har vi udviklet et system, der kan understøtte primære kulturperler mikroglia, astrocytter, og oligodendrocytes og giver mulighed for robust karakterisering af celle morfologi og celle-celle interaktioner. Fra micrographs vist, var morfologi af hver celletype udpræget anderledes med 2D, 3D-HAMA og 3D HAMA-Basal lamina blanding platforme. Morfologi var udpræget forudindtaget langs planet for overfladen i 2D-system, men i...

Betændelse i centralnervesystemet (CNS) har længe været betragtet som et adelsmærke for akut (fx, iskæmisk slagtilfælde, traumatisk hjerne og rygmarvsskade) og kronisk (f.eks Alzheimers, Parkinson's, og Huntingtons sygdomme) CNS skade, men er i stigende grad anerkendt som en kausal bidragyder til neurodegenerative og neuropsykiatriske lidelser. Vedvarende eller upassende betændelse kan forårsage neurale skade og demyelinering (f.eks. multipel sklerose), og negativt påvirker hjernens udvikling (f.eks., skizofreni, autisme) og stemning stater (f.eks., depression, angst bipolar lidelse). Yderligere, Roman terapeutiske strategier ved hjælp af implantabelt udstyr (fx., hjerne-computer-interfaces1,2,3, dyb brain stimulation4,5, intraspinal microstimulation6,7,8,9,10) generere en forudsigelig inflammatorisk respons på grænsefladen mellem enheden og CNS resulterer i en beskyttende væv svar, der kan forårsage tab af effektivitet eller enhed svigt over levetiden af implantatet11. Betændelse i CNS startes typisk af mikroglia, der fungerer som CNS ansvarlig for overvågning af væv og montering fremmedlegeme svar (gennemgik12) bopæl immunceller. Afhængigt af sværhedsgraden af en fornærmelse, celle mikroglia signal og rekruttere yderligere typer at en skade site. Specifikt, mikroglia aktivere astrocytter, der til gengæld fungerer som sekundær inflammatoriske celler og form en tætte beskyttende barriere til at indeholde en skade site13,14. Mikroglia kan også indlede en aktivitet cascade i cellerne i det perifere immunsystemet, hvilket kan resultere i nedbrydning af BBB at tillade immunsystemet infiltration (gennemgik i reference15).
For udstyr implanteret i CNS, kan vævsskader som følge af indsætning af enheder samt den fortsatte tilstedeværelse af den udenlandske enhed indlede en proces, der kaldes glial ardannelse. I denne proces, mikroglia migrere til og formere sig på stedet for skade. De indlede også frigivelsen af inflammatoriske faktorer til at neutralisere potentielle trusler og rekruttere flere gliaceller. Efterfølgende, aktiveret astrocytter blive hypertrofisk og begynde at indkapsle det indopererede udstyr for at danne en kontinuerlig fibrøst barriere16. Inflammatorisk signalering også tjener til at fremme inddragelse af neuronal processer i nærheden af implantatet og til sidst rekrutter fibroblaster for at styrke den tredje glial ar17. Oligodendrocytes, ansvarlig for kappematerialer neuroner i myelin at forbedre ledningsevne, overlever ikke denne proces og fjerne celler er partitioneret fra implantatet af ar-18. Glial ardannelse kraftigt reducerer funktion og levetid af implanteret udstyr, især for optagelse elektroder, og i sidste ende tjener til at begrænse funktionaliteten af neurale grænseflader19.
Flere metoder er blevet udnyttet til at øge biokompatibilitet og interface aktivitet af implanteret udstyr i CNS20,21,22,23. En omfattende gennemgang er tilgængelige på disse neurale grænseflader24biokompatible design. De mest fremtrædende strategier omfatter omkring elektrode med kompatible belægninger såsom polyelthyleneglycol (PEG), polylactic-co-glycolic syrer (PLGA)25, eller øge elektroden med ledende polymerer såsom poly (ethylen dioxythiophene) (PEDOT), og polypyrrole (PPy)26,27,28,29,30,31. Bioaktive belægninger har også været ansat til at give stikord til neurale væv vækst ved hjælp af ligander afledt af ekstracellulære matricer herunder collagens, fibronectins og hyaluronic syre32,33,34 ,35,36,37. Bioactivity af disse belægninger er blevet yderligere undersøgt med vækstfaktor frigivelse systemer at efterligne naturlige celle sekreter30,38,39,40,41 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50. samtidig nogle forskergrupper har valgt for at remodel elektrode geometri, fleksibilitet og sammensætning til at mindske den mekaniske misforhold mellem enhed og væv51,52,53 ,54,55,56,57. Helt, disse strategier har ført til mange lovende forbedringer i næste generations neurale interfacial enheder, men de langsigtede kompatibilitet er en løbende problem og fremskridt kan blive hæmmet af komplekse og tidskrævende in vivo modeller .
Dyr model-baserede tilgange kan begrænse den eksperimentelle overførselshastighed og øge omkostningerne ved afprøvning elektrode biokompatibilitet. In vitro metoder ved hjælp af konventionelle cellekultur teknikker tilbyder et mere omkostningseffektivt alternativ, men undlader at sammenfatte meget af kompleksiteten i samspillet mellem enhed og væv58. Især testning af overfladebelægning ved hjælp af 2D celle kultur grænser modellering af elektrode geometri og påvirkning af mekanisk misforhold og micromotion menes at bidrage til at generere en vært svar bidrager til enhed fejl59 , 60.
For at overvinde problemerne med 2D cellekultur, er hydrogel kulturer af neurale celler blevet udviklet til en bred vifte af applikationer, farmakologiske undersøgelser61, direkte neurale celle differentiering62, at forstå sygdom veje63,64, eller lagdelte i fælles kultur med andre celletyper model celle migration, neuroprotection, eller model væv microenvironments61. Hydrogels dannes let i forskellige størrelser og geometrier kan indarbejde mange typer af primære eller udødeliggjort cellekulturer, og er meget åbne over for analyse af almindeligt anvendte teknikker såsom Konfokal Fluorescens mikroskopi. For at oprette en model af glial ardannelse processen, har vi for nylig udviklet og karakteriseret en hyaluronsyre baseret 3D hydrogel system for høj overførselshastighed test af implanterede elektroder (figur 1)65glial responsen. Dette system har flere markante fordele: 1) primære glial celler (mikroglia, astrocytter, og oligodendrocytes) er indkapslet i en 3D matrix består af polymerer af hyaluronsyre, som er en komponent, endogene ekstracellulære matrix; 2) matrix stivhed kan være "tunet" for at genskabe de mekaniske egenskaber af hjerne eller rygmarv væv; og 3) celler kan være indkapslet i matrix i en hurtig bænk-top tilgang ved hjælp af photopolymerization med grønt lys, begrænse toksicitet under indkapsling. Dette system muliggør nøglen egenskaber i i vivo biokompatibilitet: anordninger er indsat i hydrogel på en sammenlignelig måde at væv, og den cellulære reaktion på implanterede enheder er overvåget for en lang række parametre65. Disse omfatter mekanisk misforhold mellem enheder og hydrogel belægninger af forskellige strukturer og elektrisk stimulation pulser. Dette system omfatter også oligodendrocyte og relaterede prækursorer, som er ofte til stede og rekrutteret i glial ar. Deres tab, død og fagocytose af mikroglia er yderst betegnende for inflammatoriske skade og som en model reduceret ardannelse eller recovery, de har kapacitet til at vise re-myelination af neuroner66.
Heri beskrives en metode til syntese og dannelsen af hybrid hyaluronsyre hydrogels kombineret med kommercielt tilgængelige basalmembranen formuleringer at forbedre celle indarbejdelse. Yderligere, vil vi vise indarbejdelse af primære kulturperler glial celler (mikroglia, astrocytter, og oligodendrocytes) og analyse af kultur vækst ved hjælp af immuncytokemi og konfokal mikroskopi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Materials for HAMA synthesis and photopolymerization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronic acid (HA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>53747-10G</td>
			<td>Streptococcus equi, MW: 1.5 - 1.8 X 10^6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride (MA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>275585-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Commerical Alcohols Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Anhydrous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (pH 7.4) tablets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine (TEA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90279-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Vinyl-2pyrrolidinone (NVP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V3409-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EosinY (EY)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6003-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440159-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (100 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (500 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1000-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH paper (Labstick)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Materials for glial cell isolation and cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1-2 Sprague Dawley rat pups</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>CD Sprague Dawley rat strain code 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissector scissors - slim blades (small)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14081-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors - Toughcut (large)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14130-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11521-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved fine forceps (Dumont #7)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium and Ham&#39;s nutrient mixture F-12 (DMEM/F12)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (PS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine (PLL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-6282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well Tissue culture treated plates (Cellstar)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665 108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-676-10K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (60 mm X 15 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100 mm X 15 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Coverslip (18 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-100 18CIR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Materials for microscopy (confocal and scanning electron microscopy)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-CNPase</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab6319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Iba1</td>
			<td>Wako Laboratory Chemicals</td>
			<td>019-17741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFAP</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab4674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td>Buffered (10%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>157-8</td>
			<td>Buffered (8%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guteraldehyde</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>16019</td>
			<td>Buffered (8%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetraoxide</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>19152</td>
			<td>Buffered (2%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldilazane (HMDS)</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>16700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>15055</td>
			<td>Anhydrous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide (25 X 75 X 1 mm)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved 3d hydrogel cultures of primary glial cells for in vitro modelling of neuroinflammation

I det centrale nervesystem, mange akutte skader og neurodegenerative sygdomme, såvel som implanterede enheder eller biomaterialer manipuleret til at forbedre funktion resultat i det samme resultat: overskydende betændelse fører til gliosis, cytotoksicitet, og/eller dannelsen af et glial ar, der kollektivt forværre skaden eller forhindre sund opsving. Med hensigten at skabe et system til model glial ar dannelse og undersøgelse inflammatoriske processer, vi har skabt en 3D celle stillads i stand til at boliger primære kulturperler glial celler: mikroglia, der regulerer fremmedlegeme svar og indlede den inflammatorisk begivenhed, astrocytter, der svare til at danne et fibrøst ar og oligodendrocytes, der er typisk udsatte for inflammatoriske skade. Den nuværende arbejde giver et detaljeret trinvis metode til fabrikation, kultur og mikroskopiske karakterisering af hyaluronsyre-baseret 3D hydrogel stillads med indkapslede rotte hjerne-afledte gliaceller. Yderligere, protokoller for karakterisering af celle indkapsling og hydrogel stillads af Konfokal immunofluorescens og scanning Elektron Mikroskopi er demonstreret, samt evnen til at ændre stillads med bioaktive substrater, med inkorporering af en kommerciel basal lamina blanding til forbedret celle integration.

Til model neurale væv vært svar og glial arret i en høj produktivitet, kræver in vitro system en 3D celle stillads med en matrix materiale, der er biokompatible, ikke afholde en cytotoksisk begivenhed i i situ dannelse og kan ændres med bioaktive komponenter til at guide velvillige svar. Til dette formål har vi skabt en 3D celle stillads system baseret på hyaluronsyre og indkapslet en primær blandet glial celler befolkning for at studere celle-celle interaktioner...

Watch this Scientific Journal Video about Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation at JoVE.com

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Heri, præsenterer vi en protokol til rotte 3D kultur hjerne-afledte glia celler, herunder astrocytter, mikroglia og oligodendrocytes. Vi demonstrere primære cellekultur, methacrylated hyaluronsyre (HAMA) hydrogel syntese, HAMAphoto-polymerisation og celle indkapsling og prøve behandling for Konfokal og scanning elektron mikroskopisk billeddannelse.

Forbedret 3D Hydrogel kulturer af primære Glial celler for In Vitro modellering af Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

Dyrkning af humane neurale stamceller i en 3-dimensionel selvsamlende peptid Hydrogel

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Udvikling af Amelogenin-chitosan Hydrogel for<em&gt; In Vitro</em&gt; Emalje genvækst med en tæt grænseflade

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øjenirritation Test (EIT) for Hazard Identifikation af Eye Irriterer Kemikalier hjælp rekonstrueret human Cornea-lignende Epithelial (RHCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D Hydrogel stillads til Artikulære chondrocyt Kultur og brusk Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Konstruktion af Modular Hydrogel Leverandørbrugsanvisning på mikromønstrede Macro-skaleret 3D Cellular Arkitektur

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Mikrofluid Flow Chambers Brug Rekonstitueret Blood til Model Hæmostase og trombocytinfusion<em&gt; In vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

Bioprintable calciumalginat/gelatine Hydrogel 3D In Vitro modelsystemer fremkalde celle klumpformet dannelse

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

3D trykt porøse Cellulose Nanocomposite Hydrogel stilladser

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Protokoller af 3D Bioprinting af gelatine Methacryloyl hydrogel baserede Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Avancerede 3D-levermodeller til in vitro genotoksicitetstest efter langvarig nanomaterialeeksponering

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...