Name: improved 3d hydrogel cultures of primary glial cells for in vitro modelling of neuroinflammation
Uploaded: 2017-12-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation at JoVE.com

Die Autoren sind dankbar für finanzielle Unterstützung von NSERC, CFI AIHS, Alberta Health Services und der Davey-Stiftung für Hirnforschung.

Das Protokoll für die Gehirn-Gewebe-Extraktion von Tag 1 Sprague-Dawley Ratten Welpen, durch Enthauptung, eingeschläfert wurde von der Animal Care und Nutzung hat an der University of Alberta genehmigt.
(1) Mikroglia und Astrozyten Isolationen67,68
Hinweis: Alle Medien für Isolation und Zellkultur wird auf 37 ° C in einem Wasserbad vorgewärmt. Hank es ausgeglichene Salzlösung (HBSS) hat 1 % Penicillin-St...

Für das Ziel ein 3D Kultursystem zu Gliazellen Bioreactivity Modell und der Glia Vernarbung zu erzeugen haben wir ein System entwickelt, die primäre kultivierten Mikroglia, Astrozyten und Oligodendrozyten unterstützen können und robuste Charakterisierung der Zelle ermöglicht Morphologie und Zell-Zell-Interaktionen. Aus den Aufnahmen gezeigt war die Morphologie der jeden Zelltyp deutlich anders mit 2D, 3D-HAMA und 3D HAMA basalen Lamina Mischung Plattformen. Im 2D System Morphologie wurde entlang der Ebene der Oberfl...

Entzündung des zentralen Nervensystems (ZNS) ist seit langem als ein Markenzeichen von akuten (z.B., ischämischen Schlaganfall, Schädel-Hirn und Rückenmarksverletzungen) und chronische (z.B. Alzheimer, Parkinson und Huntington Krankheiten) CNS Verletzung, aber zunehmend als eine kausale Neurodegenerative und neuropsychiatrische Störungen erkannt wird. Aufrechterhalten oder unangemessen Entzündung kann dazu führen, dass neuronale Schädigung und Demyelinisierung (z.B. Multiple Sklerose) und negativ beeinflussen die Entwicklung des Gehirns(z. B.Schizophrenie, Autismus) und Stimmung Staaten(z. B.Depression, Angst Bipolare Störung). Weitere, neue therapeutische Strategien mit implantierbaren Geräten (zB., Gehirn-Computer-Schnittstellen1,2,3, deep Brain Stimulation4,5, intraspinal Microstimulation6,7,8,9,10) erzeugen eine vorhersehbare Entzündungsreaktion an der Schnittstelle zwischen dem Gerät und der CNS, wodurch eine schützende Gewebe Reaktion, die über die gesamte Lebensdauer des Implantats11Verlust der Wirksamkeit oder Gerät Fehler verursachen können. Entzündung im ZNS ist in der Regel von Mikroglia, initiiert die als Residenten Immunzellen des ZNS verantwortlich für Gewebe Überwachung und Montage der Fremdkörper-Reaktion (bewertete12) fungieren. Abhängig von der Schwere der Beleidigung, Zelltypen die Mikroglia Signal und Rekrut zusätzliche zu einer Verletzung Aufstellungsort. Insbesondere die Mikroglia aktivieren die Astrozyten, die wiederum als sekundäre Entzündungszellen und bilden einen dichten Schutzbarriere zu einer Verletzung Seite13,14enthalten fungieren. Mikroglia kann auch eine Aktivität Kaskade in den Zellen des peripheren Immunsystems initiieren, was in der Aufschlüsselung der BBB erlauben immun Infiltration (rezensiert in Referenz15) führen kann.
Bei Geräte implantiert in das ZNS kann Gewebeschäden infolge Gerät einsetzen sowie die anhaltende Präsenz von ausländischen Gerät einen Prozess bezeichnet glialen Narbenbildung einzuleiten. In diesem Prozess der Mikroglia zu migrieren und vermehren sich an der Stelle der Verletzung. Sie initiieren auch die Freisetzung von Entzündungsfaktoren, potenzielle Bedrohungen zu neutralisieren und zusätzliche Gliazellen zu rekrutieren. Danach aktivierte Astrozyten werden hypertrophe und Verkapselung der implantierten Geräts um eine kontinuierliche faserige Barriere16zu bilden beginnen. Entzündliche Signalgebung dient auch zur Rücknahme der neuronalen Prozessen aus der Umgebung des Implantats zu fördern und schließlich Rekruten Fibroblasten um die entwickelnden glial Narbe17zu verstärken. Die Oligodendrozyten, verantwortlich für die Ummantelung von Nervenzellen im Myelin zur Verbesserung der Leitfähigkeit, diesen Prozess nicht überleben und entfernten Zellen sind vom Implantat nach der Narbe18partitioniert. Glialen Narbenbildung erheblich reduziert, die Funktion und Lebensdauer von Implantaten, insbesondere für Aufnahme Elektroden und letztlich dient dazu, die Funktionalität der neuronale Schnittstellen19zu begrenzen.
Verschiedene Ansätze wurden genutzt, um die Biokompatibilität und Schnittstelle Aktivität von Implantaten in der CNS20,21,22,23. Eine umfassende Überprüfung ist auf das biokompatible Design dieser neuronale Schnittstellen24erhältlich. Die prominentesten Strategien umfassen rund um die Elektrode mit kompatibel Beschichtungen wie Polyelthyleneglycol (PEG), Polymilchsäure-co-Glykol Säuren (PLGA)25, oder die Verbesserung der Elektrode mit leitfähigen Polymeren wie Poly (Ethylen Dioxythiophene) (PEDOT) und Polypyrrol (PPy)26,27,28,29,30,31. Bioaktive Beschichtungen haben auch eingesetzt worden, um Hinweise für Nervengewebe Wachstum mit Liganden abgeleiteten extrazellulären Matrizen einschließlich Kollagene, Fibronectins und Hyaluronsäure32,33,34 bieten ,35,36,37. Die Bioaktivität dieser Beschichtungen ist weiter erforscht worden mit Wachstumsfaktor Freisetzung Systeme emulieren natürliche Zelle Sekrete30,38,39,40,41 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50. gleichzeitig einige Forschungsgruppen haben sich entschieden, die Elektroden-Geometrie, die Flexibilität und die Zusammensetzung der mechanische Konflikt zwischen Gerät und Gewebe51,52,53 verringern umgestalten ,54,55,56,57. Insgesamt haben diese Strategien zu viele vielversprechende Verbesserungen im nächsten Generation neuronale Grenzflächen Geräte, aber die langfristige Kompatibilität geht es laufend und Fortschritt kann durch komplexe und zeitaufwendige in Vivo Modellen behindert .
Tierische modellbasierte Ansätze können experimentelle Durchsatz zu begrenzen und erhöhen die Kosten der Prüfung Elektrode Biokompatibilität. In-vitro- nähert sich mit konventionellen Zellkultur Techniken bieten eine kostengünstige Alternative, aber nicht zu viel von der Komplexität der Interaktion zwischen Gerät und Gewebe58rekapitulieren. Insbesondere Prüfung von Oberflächenbeschichtungen mit 2D Zelle Kultur Grenzen die Modellierung von Elektroden-Geometrie und der Einfluss der mechanischen Konflikt und Micromotion dachte dazu beitragen, eine Wirtsantwort Gerät Fehler59 zur Erzeugung , 60.
Um Probleme im Zusammenhang mit 2D Zellkultur zu überwinden, wurden Hydrogel Kulturen von neuronalen Zellen für eine Vielzahl von Anwendungen, pharmakologische Studien61, entwickelt, um direkte neuronale Zelle Differenzierung62, um Krankheit zu verstehen Wege63,64, oder geschichtete in Kokultur mit anderen Zelltypen Modell Zellwanderung, Neuroprotektion, oder Modell Gewebe Mikroumgebungen61. Hydrogele bilden sich leicht in verschiedenen Größen und Geometrien können zahlreiche Arten von primären oder verewigt Zellkulturen integrieren und Analyse von häufig verwendeten Techniken wie konfokale Fluoreszenzmikroskopie höchst zugänglicher sind. Um ein Modell der Glia Vernarbung zu erstellen, haben wir vor kurzem entwickelt und charakterisiert eine Hyaluronsäure basierte 3D Hydrogel-System für Hochdurchsatz-Prüfung der Glia Reaktion auf implantierten Elektroden (Abbildung 1)65. Dieses System hat einige deutliche Vorteile: 1) primären Gliazellen (Oligodendrozyten, Mikroglia und Astrozyten) sind gekapselt in einer 3D Matrix bestehend aus Polymeren von Hyaluronsäure, welche eine endogene extrazelluläre Matrix Komponente; (2) die Matrix Steifigkeit kann "abgestimmt" werden, um die mechanischen Eigenschaften des Gehirns oder Rückenmarks Gewebe neu zu erstellen; und 3) Zellen können in der Matrix in einem schnellen Benchtop-Ansatz grünes Licht, Begrenzung der Toxizität während Kapselung Photopolymerisation mit gekapselt werden. Dieses System ermöglicht der wichtigsten Features von in Vivo Biokompatibilität: Geräte werden eingefügt in das Hydrogel in vergleichbarer Weise auf Gewebe, und die zelluläre Antwort auf Implantaten sind für eine Vielzahl von Parametern65überwacht. Dazu gehören mechanische Missverhältnis zwischen den Geräten und die Hydrogel-Beschichtungen von verschiedenen Strukturen und Reizstrom-Impulse. Dieses System beinhaltet auch Oligodendrozyt und verwandte Vorläufer, die häufig anwesend und rekrutierten glial Narben sind. Ihre Schäden, Tod und Phagozytose von Mikroglia sind höchst bezeichnend für entzündliche Verletzungen und wie ein Modell Narbenbildung oder Recovery reduziert, sie haben die Fähigkeit, Re-Myelinisierung der Nervenzellen66demonstrieren.
Hier beschreiben wir eine Methode zur Synthese und Bildung von hybriden Hyaluronsäure Hydrogele in Kombination mit handelsüblichen Basalmembran Formulierungen Zelle Aufnahme zu verbessern. Darüber hinaus demonstrieren wir Ihnen die Übernahme der primären kultivierten glial Zellen (Oligodendrozyten, Mikroglia und Astrozyten) und Analyse der Kultur Wachstum mit Immunocytochemistry und konfokalen Mikroskopie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Materials for HAMA synthesis and photopolymerization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronic acid (HA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>53747-10G</td>
			<td>Streptococcus equi, MW: 1.5 - 1.8 X 10^6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride (MA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>275585-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Commerical Alcohols Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Anhydrous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (pH 7.4) tablets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine (TEA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90279-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Vinyl-2pyrrolidinone (NVP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V3409-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EosinY (EY)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6003-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440159-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (100 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (500 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1000-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH paper (Labstick)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Materials for glial cell isolation and cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1-2 Sprague Dawley rat pups</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>CD Sprague Dawley rat strain code 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissector scissors - slim blades (small)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14081-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors - Toughcut (large)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14130-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11521-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved fine forceps (Dumont #7)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium and Ham&#39;s nutrient mixture F-12 (DMEM/F12)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (PS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine (PLL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-6282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well Tissue culture treated plates (Cellstar)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665 108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-676-10K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (60 mm X 15 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100 mm X 15 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Coverslip (18 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-100 18CIR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Materials for microscopy (confocal and scanning electron microscopy)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-CNPase</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab6319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Iba1</td>
			<td>Wako Laboratory Chemicals</td>
			<td>019-17741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFAP</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab4674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td>Buffered (10%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>157-8</td>
			<td>Buffered (8%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guteraldehyde</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>16019</td>
			<td>Buffered (8%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetraoxide</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>19152</td>
			<td>Buffered (2%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldilazane (HMDS)</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>16700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>15055</td>
			<td>Anhydrous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide (25 X 75 X 1 mm)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved 3d hydrogel cultures of primary glial cells for in vitro modelling of neuroinflammation

In das zentrale Nervensystem, zahlreichen akuten Verletzungen und Neurodegenerative Erkrankungen, sowie implantierten Geräten oder Biomaterialien entwickelt zur Verbesserung der Funktion führen zu dem gleichen Ergebnis: überschüssige Entzündung führt zu Gliosis, Zytotoxizität, und/oder Bildung einer glial Narbe, die kollektiv Verletzung verschlimmern oder gesunde Erholung verhindern. Wir haben mit dem Ziel der Schaffung eines Systems zum Modell glial Narbe Bildung und Studium Entzündungsprozesse leski 3D Zelle in der Lage, Gehäuse primäre kultivierte Gliazellen erzeugt: Mikroglia, die Fremdkörper-Reaktion zu regulieren und die entzündlichen Ereignis, Astrozyten, die Beantwortung um eine faserige Narbe zu bilden und Oligodendrozyten, die in der Regel zu entzündlichen Verletzungen anfällig sind. Das vorliegende Werk bietet eine detaillierte Schritt für Schritt Methode für die Herstellung, die Kultur und die mikroskopische Charakterisierung leski Hyaluronsäure-basierten 3D Hydrogel mit gekapselten Ratte Gehirn abgeleitet Gliazellen. Darüber hinaus werden Protokolle zur Charakterisierung der Zelle Kapselung und das Hydrogel Gerüst durch konfokale Immunofluoreszenz und Rasterelektronenmikroskopie demonstriert, sowie die Fähigkeit, das Gerüst mit bioaktiven Substraten mit ändern Gründung einer gewerblichen Basallamina Mischung zur verbesserten Zelle Integration.

Um das Nervengewebe Wirtsantwort und glial Narbe in einen hohen Durchsatz zu modellieren, erfordert in-vitro- System leski 3D Zelle mit einem Matrixmaterial, die biokompatibel, fallen nicht an einer zytotoxischen Ereignis während in Situ Bildung und kann geändert werden mit bioaktiven Komponenten um wohlwollende Reaktion führen. Wir haben zu diesem Zweck schuf ein 3D Zelle-Gerüst-System basierend auf Hyaluronsäure und gekapselt eine primäre gemischte Gliazelle Bev?...

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Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die 3D Kultur der Ratte Gehirn abgeleitet Glia-Zellen, einschließlich der Oligodendrozyten, Astrozyten und Mikroglia. Wir zeigen Primärzelle Kultur, methacrylated Hyaluronsäure (HAMA) Hydrogel Synthese, HAMAphoto-Polymerisation und Zelle Kapselung und Probe Verarbeitung für die konfokale und scanning Electron mikroskopische Bildgebung.

3D Hydrogel Kulturen von primären Gliazellen für In-vitro- Modellierung von Neuroinflammation verbessert

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

Kultivierung humaner neuronaler Vorläuferzellen in einer 3-dimensionalen Self-Montage Peptide Hydrogel

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Forschung

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