Name: improved 3d hydrogel cultures of primary glial cells for in vitro modelling of neuroinflammation
Uploaded: 2017-12-08T15:00:00
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著者は、金融サポート レベル、CFI、AIHS、アルバータ州健康サービス、および脳研究のため Davey 基金から感謝しています。

1 日目スプレイグ ドーリー仔、斬罪に、安楽死から脳組織抽出のためのプロトコルは、動物愛護とアルバータ大学利用委員会によって承認されました。
1. ミクログリアやアストロ サイト分離67,68
メモ: 分離および細胞培養のためのすべてのメディアは水浴中で 37 ° C に予熱します。ハンクの平衡塩溶液 (HBSS)...

モデル グリア bioreactivity 3次元培養システムおよびグリア瘢痕のプロセスを生成する目標に向かって一次培養ミクログリア、アストロ サイト、オリゴデンドロ サイトをサポートし、により、電池の堅牢な評価システムを開発しました。形態と細胞間の相互作用。示されている顕微鏡写真から各セル型の形態が 2 D、3 D 浜および 3 D 浜基底板混合プラットフォームと異なる。2 D システムの形態?...

中枢神経系 (CNS) の炎症は急性の認刻極印を長く考慮された (例えば、虚血性脳卒中、脳外傷、脊髄損傷) および慢性 (例えばアルツハイマー病、パーキンソン病のおよびハンティントンの病気) 中枢神経損傷しかし、ますます、神経変性疾患や神経疾患に因果共同作成者として認識されます。持続的なまたは不適切な炎症神経損傷や髄 (例えば多発性硬化症) が発生し、脳の発達 (例えば、統合失調症、自閉症) と (例えばうつ病、不安の気分状態に悪影響を及ぼす、双極性障害)。さらに、植込み型デバイスを用いた新しい治療戦略 (e.g、脳-コンピューターのインターフェイス1,2,3, 脳深部刺激4,5, 脊柱。微小6,7,8,9,10) デバイスとその結果中枢神経系間のインターフェイスで予測可能な炎症性応答を生成します。11インプラントの寿命にわたる効果やデバイスの障害の損失を引き起こすことができます保護組織の応答です。中枢神経系の炎症通常中枢神経系組織の監視および異物応答 (レビュー12) を取付担当の常駐免疫細胞として機能するミクログリアによって開始されます。侮辱の重大度に応じて、ミクログリアの信号と追加募集細胞傷害のサイトの種類です。具体的には、ミクログリアは二次炎症性細胞と形態傷害サイト13,14を含む密な防護壁として機能するアストロ サイトをアクティブにします。ミクログリアはまた (参照15見直し) 免疫の浸透を許可する BBB の崩壊につながることができます末梢の免疫系の細胞の活動連鎖を開始できます。
中枢神経系に注入デバイス、デバイスの挿入だけでなく、外部デバイスの継続的な存在から生じる組織の損傷がグリア瘢痕と呼ばれるプロセスを開始します。このプロセスで、ミクログリアに移行し、損傷部位で増殖します。彼らはまた、潜在的な脅威を中和して追加のグリア細胞を募集する炎症性因子のリリースを開始します。その後、活性化アストロ サイトは肥大になるし、16の連続的な線維性バリアを形成するため注入装置をカプセル化を開始します。炎症性シグナル伝達もインプラントの周辺から神経突起の撤退を促進するために提供し、発展途上のグリア瘢痕17を補強する線維芽細胞を最終的に募集します。オリゴデンドロ サイトは、コンダクタンスを強化するミエリンのニューロンをシースの責任はこのプロセスを存続しないと傷跡18によってインプラントから離れた場所の細胞が分割されました。グリア瘢痕を大幅機能と記録電極に特に注入デバイスの寿命を低減し、最終的に神経インターフェイス19の機能を制限するのに役立ちます。
いくつかのアプローチは、生体適合性と中枢神経系20,21,22,23埋込デバイスのインターフェイス アクティビティを高めるに悪用されています。広範なレビューはこれらの神経インターフェイス24の生体適合性設計も承ります。最も著名な戦略を含める polyelthyleneglycol (PEG)、ポリ グリコール酸 (PLGA)25など互換性のあるコーティングと電極を囲むまたはポリ (エチレンなどの導電性ポリマー電極を強化dioxythiophene) (PEDOT) とポリピロール (PPy)26,27,28,29,30,31。生体活性コーティングは、配位子に由来するコラーゲン、コラーゲン、ヒアルロン酸32,33,34 など細胞外マトリックスを使用して神経組織の成長のための手がかりを提供するために採用されています。 ,35,36,37。これらのコーティングの生理活性はさらに自然な細胞分泌物30,38,39,40,41をエミュレートする成長因子リリース システムで検討されています。,42,43,44,45,46,47,48,49,50します同時に、いくつかの研究グループ電極形状、柔軟性、および機械的デバイスと組織51,52,53 ミスマッチを減少する組成を改造することを選択した。 ,,5455,56,57。完全に、これらの戦略をリードしている多くの有望な改善、次世代ニューラル界面デバイスでしかし、進行中の問題であり、進行状況は、複雑で時間のかかるin vivoモデルによって妨げられる可能性があります長期的な互換性.
動物モデル ・ ベースのアプローチは、実験のスループットを制限でき、電極生体適合性テストのコストが増加します。従来の細胞培養技術より費用効果が大きい代わりを提供するが、デバイスと組織58間の相互作用の複雑さの多くを要約する失敗を使用して体外に近づきます。特に、電極形状のモデリングと機械の不一致・微動デバイス障害59に貢献ホスト応答の生成に寄与すると考えの影響、2 D セル文化の制限を利用した表面コーティングのテスト,60。
2 D の細胞培養に関連する問題を克服するためにハイドロゲル培養神経細胞のために開発された幅広い用途、薬理学的研究61、直接神経細胞分化62病気を理解するために経路63,64、またはモデル細胞の移動、神経保護、またはモデル組織微小61他の細胞型の層状共培養します。ヒドロゲルはさまざまなサイズで容易に形成して共焦点蛍光顕微鏡などの一般的に使用される手法によって分析に非常に適しているジオメトリ、プライマリまたは不死化細胞培養の様々 なタイプを組み込むことができます。グリア瘢痕化プロセスのモデルを作成するには、最近開発し、注入電極 (図 1)65グリア細胞応答の高スループットをテストするためヒアルロン酸ベースの 3 D ハイドロゲル システムが特徴します。このシステムは、いくつかの明確な利点: 1); の内因性細胞外マトリックス成分であるヒアルロン酸の重合体で構成される 3 D 行列でプライマリのグリア細胞 (ミクログリア、アストロ サイト、オリゴデンドロ サイト) にカプセル化2) 剛性マトリックス ' チューニングできる「脳や脊髄組織の機械的性質を再現するには・ 3) 制限毒性カプセル化の間、緑色の光で光重合を用いた迅速なベンチ トップ アプローチでマトリックスでセルをカプセル化できます。このシステムにより、体内の生体適合性の主な機能: デバイスが組織と対等な方法でヒドロゲルに挿入され、埋込デバイスへの細胞の応答パラメーター65の広い範囲を監視します。機械的デバイスと多彩な構造と電気刺激パルス ハイドロゲル コーティング不一致が含まれます。このシステムでは、オリゴデンドロ サイトとがしばしば存在し、グリア瘢痕の募集関連前駆物質も含まれています。彼らの損傷と死とミクログリアによる貪食が高い炎症性傷害の指標とニューロン66の再髄鞘化を示す能力があるモデルは減少瘢痕または回復。
ここは合成と細胞の混入を改善するために市販の基底膜製剤併用ハイブリッド ヒアルロン酸ゲルの形成について述べる。さらに、初代培養グリア細胞 (ミクログリア、アストロ サイト、オリゴデンドロ サイト) の定款及び各種と共焦点顕微鏡を用いた文化成長の分析を示します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Materials for HAMA synthesis and photopolymerization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronic acid (HA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>53747-10G</td>
			<td>Streptococcus equi, MW: 1.5 - 1.8 X 10^6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride (MA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>275585-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Commerical Alcohols Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Anhydrous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (pH 7.4) tablets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine (TEA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90279-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Vinyl-2pyrrolidinone (NVP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V3409-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EosinY (EY)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6003-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440159-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (100 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (500 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1000-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH paper (Labstick)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Materials for glial cell isolation and cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1-2 Sprague Dawley rat pups</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>CD Sprague Dawley rat strain code 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissector scissors - slim blades (small)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14081-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors - Toughcut (large)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14130-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11521-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved fine forceps (Dumont #7)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium and Ham&#39;s nutrient mixture F-12 (DMEM/F12)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (PS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine (PLL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-6282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well Tissue culture treated plates (Cellstar)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665 108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-676-10K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (60 mm X 15 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100 mm X 15 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Coverslip (18 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-100 18CIR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Materials for microscopy (confocal and scanning electron microscopy)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-CNPase</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab6319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Iba1</td>
			<td>Wako Laboratory Chemicals</td>
			<td>019-17741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFAP</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab4674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td>Buffered (10%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>157-8</td>
			<td>Buffered (8%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guteraldehyde</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>16019</td>
			<td>Buffered (8%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetraoxide</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>19152</td>
			<td>Buffered (2%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldilazane (HMDS)</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>16700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>15055</td>
			<td>Anhydrous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide (25 X 75 X 1 mm)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved 3d hydrogel cultures of primary glial cells for in vitro modelling of neuroinflammation

同様にイオン注入装置や生体が同じ結果に関数の結果を高めるように設計されて中枢神経系、多数の急性障害と神経変性疾患、: 細胞毒性、神経膠症につながる過剰な炎症および/または総称して怪我を悪化させるまたは健康回復を防ぐグリア瘢痕の形成。初代培養グリア細胞を収容可能 3 D 細胞培養足場を生成、グリア瘢痕形成と研究炎症性プロセスをモデル化するシステムの作成の意図で: ミクログリア異物反応を調節する、開始、炎症性イベント、線維性瘢痕の形成に対応するアストロ サイト、オリゴデンドロ サイト通常炎症性傷害を受けやすい。現在の仕事では、脳グリア細胞作製、カルチャ、およびカプセル化されたラットとヒアルロン酸ベースの 3 D ハイドロゲル足場の微視的構造の評価のための詳細なステップバイ ステップのメソッドを提供します。生理活性基板と足場を変更する能力だけでなく、電池封止材と共焦点の蛍光および走査電顕によるハイドロゲル足場のキャラクタリゼーションのためのプロトコルの実証、さらに、改良されたセル統合商業基底膜の混合物の設立。

神経組織のホスト応答と高スループットのグリア瘢痕をモデル化するには、 in vitroシステムはマトリックス材料は生体親和性、その場形成、細胞傷害性のイベントを発生させないとを変更すると 3 D の細胞の足場を必要とします。優しい対応を導くための生理活性成分。このため、ヒアルロン酸に基づく 3 D の細胞の足場システムを作成し、細胞間相互作...

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Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

ここで、ラットの 3 D の文化のためのプロトコル脳由来グリア細胞、アストロ サイト、ミクログリア、オリゴデンドロ サイトなどを紹介します。一次電池文化、ならびにヒアルロン酸 (浜) ハイドロゲル合成、HAMAphoto 重合と細胞のカプセル化、共焦点走査型電子顕微鏡画像処理サンプルを紹介しています。

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Research

JoVE Journal

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