Name: improved 3d hydrogel cultures of primary glial cells for in vitro modelling of neuroinflammation
Uploaded: 2017-12-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation at JoVE.com

저자는 NSERC, CFI, AIHS, 알버타 헬스 서비스, 그리고 뇌 연구를 위한 비 기부금에서 재정 지원에 대 한 감사.

주 1 Sprague Dawley 쥐 새끼, 잘린에 의해 안락사에서 뇌 조직 추출 프로토콜 동물 관리 및 사용 위원회 앨버타의 대학에 의해 승인 되었다.
1. Microglia 및 사이토 격리67,68
참고: 격리 및 세포 배양에 대 한 모든 미디어는 물 욕조에 37 ° c으로 미리 데워 행 크의 균형된 소금물 (HBSS)는 1% 페니실린-스 (PS). 모든 Dulbecco의 ?...

모델 glial bioreactivity 3 차원 문화 시스템 및 glial 흉터 프로세스 생성의 목표를 향해 우리 셀의 강력한 묘사를 가능 하 게 이다 및 oligodendrocytes 기본 교양된 microglia를 지원할 수 있는 시스템을 개발 했습니다. 형태학 및 세포 세포 상호 작용입니다. 표시 하는 현미경 사진에서 각 셀 형식의 형태학이 달랐다 분명히 2D, 3D-하 마, 그리고 3D 하 마 기저 lamina 혼합 플랫폼. 2D 시스템에서의 표면, 평면 형태 ?...

중앙 신경 조직 (CNS)의 염증이 오래 고려 되었습니다 급성의 특징 (예:허 혈 성 뇌졸중, 외상 성 뇌, 척수 손상) 및 만성 (예: 알츠하이머병, 파 킨 슨 병의, 그리고 Huntington의 질병) CNS 상해, 하지만 점점 신경 정신병 무질서 하 인과 기여자로 인식 됩니다. 지속 또는 부적 절 한 수 있습니다 신경 상해의 원인과 demyelination (예: 다 발성 경화 증), 염증과 부정적인 영향 (예를 들어, 정신 분열 증, 자폐증) 두뇌 개발 및 기분 상태 (예, 우울증, 불안 양극성 질환). 또한, 새로운 치료 전략을 이식할 수 있는 장치를 사용 하 여 (예., 뇌-컴퓨터 인터페이스1,2,3, 깊은 두뇌 자극4,5, intraspinal microstimulation6,7,8,,910) 장치 및 CNS에서 결과 사이의 인터페이스에서 예측 가능한 선 동적인 응답을 생성 한 11임 플 란 트 수명에 걸쳐 효능 또는 장치 실패의 손실을 일으킬 수 있는 보호 조직 응답. CNS에 염증은 일반적으로 CNS 조직 감시 및 이물질 응답 (검토12) 장착에 대 한 책임의 거주 면역 세포 기능 microglia에 의해 시작 됩니다. 모욕의 심각도에 따라, microglia 신호 및 모집 추가 부상 사이트 종류 세포. 특히,는 microglia 활성화에 보조 염증 세포 및 양식 부상 사이트13,14를 포함 하는 밀도 보호벽 역할 이다. Microglia 또한 (참조15검토) 면역 침투를 허용 하도록 BBB의 붕괴 귀 착될 수 있다 주변 면역계의 세포에 활동 캐스케이드를 시작할 수 있습니다.
CNS에 이식 하는 장치의 경우 조직을 피해 외국 장치의 지속적인된 존재로 서 장치 삽입 glial 흉터 라고 하는 프로세스를 시작할 수 있습니다. 이 과정에서는 microglia 마이그레이션을 하 고 상해의 사이트에 확산. 그들은 또한 잠재적인 위협을 중화 하 고 모집 추가 glial 세포를 염증 인자의 방출을 시작 합니다. 그 후, 활성화 이다 hypertrophic 되 고 연속 섬유 장벽16이식된 장치를 캡슐화 시작. 염증 신호는 임 플 란 트의 주변에서 신경 프로세스의 철수를 촉진 하는 역할도 하 고 결국 개발 glial 흉터17강화 섬유 아 세포를 신병. Oligodendrocytes, 전도성, 강화 하기 위하여 myelin 신경 세포를 넣는 담당 할 하지이 과정 생존과 먼 셀 플에서 흉터18으로 분할 된다. Glial 흉터 크게 기능과 기록 전극, 특히 이식된 소자의 수명 감소 하 고 궁극적으로 신경 인터페이스19의 기능을 제한 하는 역할.
몇 가지 방법은 생체 적합성 및 CNS20,21,,2223에서 이식 장치 인터페이스 활동 증가 악용 되어 있다. 이러한 신경 인터페이스24의 생체 디자인에 광범위 한 검토를 이용하실 수 있습니다. 가장 눈에 띄는 전략 polyelthyleneglycol (PEG), 공동 glycolic polylactic 산 (PLGA)25, 같은 호환 코팅 전극 주변 또는 강화 폴 리 (에틸렌 등 전도성 폴리머와 전극 포함 dioxythiophene) (PEDOT), polypyrrole (PPy)26,,2728,29,30,31. 생리 활성 코팅 collagens, 히 알루 론 산32,33,34, fibronectins, 등 세포 외 매트릭스에서 파생 하는 ligands를 사용 하 여 신경 조직의 성장에 대 한 단서를 제공 하기 위해 고용 또한 있다 ,35,,3637. 성장 인자 릴리스 시스템을 흉내 낸 자연 세포 분 비 물30,38,39,,4041 이 코팅의 bioactivity 더 탐험 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50. 동시에, 일부 연구 그룹 전극 형상, 유연성, 및 구성 장치 및 조직51,52,53 사이 기계적인 불일치 감소을 개장 하기로 ,,5455,,5657. 그러나 이러한 전략 있는 많은 유망 개선 이어질 다음-세대 신경 계면 장치, 장기 호환성에 문제 이며 진행 복잡 하 고 시간이 걸리는 시내 vivo 모델에 의해 방해 받을 수 있습니다. .
동물 모델 기반 접근 실험 처리량을 제한 하 고 전극 생체 적합성 테스트의 비용을 증가 시킬 수 있습니다. 생체 외에서 기존의 세포 배양 기술을 더 비용 효율적인 대안을 제공 하지만 많은 장치 및 조직58사이 상호 작용의 복잡성을 정리 하지를 사용 하 여 접근 한다. 특히, 전극 형상의 모델링 및 기계적 불일치 및 micromotion 장치 오류59 기여 호스트 응답 생성을 생각 영향 문화 제한, 2D 셀을 사용 하 여 표면 코팅의 테스트 , 60.
2 차원 세포 배양과 관련 된 문제를 해결 하려면 신경 세포의 하이드로 겔 문화 개발 되었으며, 다양 한 응용 프로그램, 약리 연구61, 신경 세포 분화62, 질병을 이해 하는 것을 직접 경로63,64또는 다른 세포 유형 모델 셀 마이그레이션, neuroprotection, 또는 모델 조직 microenvironments61층된에 공동 문화. Hydrogels 쉽게 다른 크기로 형성 되 고 형상 기본 또는 불멸 하 게 한 세포 배양의 수많은 종류를 통합할 수 있습니다 매우 공초점 형광 현미경 등 일반적으로 사용 되 기술에 의해 분석을 받을. Glial 흉터 프로세스의 모델을 만들려면, 우리는 최근 개발과 이식된 전극 (그림 1)65glial 응답의 높은 처리량 테스트를 위해 히 알루 론 산 기반된 3 차원 하이드로 겔 시스템 특징. 이 시스템은 여러 가지 이점이 있다: 1) 3 차원 매트릭스 고분자 히 알루 론 산, 생 세포 외 매트릭스 구성;의 구성에서 기본 glial 세포 (microglia, 이다, 및 oligodendrocytes) 캡슐화 2)는 매트릭스 강성 조정 될 수 있다 '' 두뇌 또는 척수 조직;의 기계적 특성을 재현 하 그리고 3) 세포는 빠른 벤치탑 접근 제한 독성 캡슐화 중 녹색 빛으로 photopolymerization를 사용 하 여 매트릭스에 캡슐화 될 수 있습니다. 이 시스템은 생체 내에서 생체 적합성의 주요 기능 수 있습니다: 장치는 하이드로 겔 조직으로, 유사한 방식으로 삽입 되 고 이식된 장치에 세포질 응답은 다양 한 매개 변수65에 대 한 모니터링. 다양 한 구조와 전기 자극 펄스의 하이드로 겔 코팅, 기계 불일치나 장치 포함 됩니다. 이 시스템은 또한 oligodendrocyte 및 자주 존재 하 고 glial 흉터에 채용 관련된 선구자 포함 됩니다. 그들의 손상, 죽음, 그리고 microglia에 의해 식 균 작용은 매우 선 동적인 상해의 지표 그리고 모델 감소 흉터 또는 복구, 그들은 능력을 다시-myelination 뉴런66의 설명.
여기는 합성 및 하이브리드 히 알루 론 산 hydrogels 셀 병합을 개선 하기 위해 상용 지하실 멤브레인 공법으로 결합의 형성 하는 방법에 설명 합니다. 또한, 우리는 기본 교양된 glial 세포 (microglia, 이다, 및 oligodendrocytes)의 설립 및 문화 성장 immunocytochemistry 그리고 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 분석을 시연할 예정 이다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Materials for HAMA synthesis and photopolymerization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronic acid (HA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>53747-10G</td>
			<td>Streptococcus equi, MW: 1.5 - 1.8 X 10^6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride (MA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>275585-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Commerical Alcohols Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Anhydrous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (pH 7.4) tablets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine (TEA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90279-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Vinyl-2pyrrolidinone (NVP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V3409-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EosinY (EY)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6003-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440159-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (100 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (500 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1000-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH paper (Labstick)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Materials for glial cell isolation and cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1-2 Sprague Dawley rat pups</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>CD Sprague Dawley rat strain code 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissector scissors - slim blades (small)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14081-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors - Toughcut (large)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14130-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11521-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved fine forceps (Dumont #7)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium and Ham&#39;s nutrient mixture F-12 (DMEM/F12)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (PS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine (PLL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-6282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well Tissue culture treated plates (Cellstar)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665 108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-676-10K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (60 mm X 15 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100 mm X 15 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Coverslip (18 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-100 18CIR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Materials for microscopy (confocal and scanning electron microscopy)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-CNPase</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab6319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Iba1</td>
			<td>Wako Laboratory Chemicals</td>
			<td>019-17741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFAP</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab4674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td>Buffered (10%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>157-8</td>
			<td>Buffered (8%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guteraldehyde</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>16019</td>
			<td>Buffered (8%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetraoxide</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>19152</td>
			<td>Buffered (2%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldilazane (HMDS)</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>16700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>15055</td>
			<td>Anhydrous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide (25 X 75 X 1 mm)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved 3d hydrogel cultures of primary glial cells for in vitro modelling of neuroinflammation

중앙 신경 조직, 수많은 급성 부상 및 신경 장애, 뿐만 아니라 이식 장치 또는 생체 같은 결과에서 함수 결과 향상 시키기 위해 설계: gliosis, 세포 독성, 이끌어 과잉 염증 또는 집합적으로 부상 악화 또는 건강 회복을 방해 glial 흉터 대형. 우리가 3 차원 셀 비 계 기본 교양된 glial 세포 수 있는 모델 glial 흉터 대형 그리고 연구 염증 성 프로세스에 시스템을 만드는의 도와 함께 생성: microglia 이물질 응답을 통제 하 고 시작 하는 염증 성 이벤트, 이다 섬유질 흉터 형성에 응답 하는 및 oligodendrocytes 일반적으로 염증 성 손상에 취약. 현재 작업 방법을 제공 한다는 상세한 단계별 제작, 문화, 및 캡슐화 된 쥐와 히 알루 론 산 기반 3D 히드로 발판의 현미경 특성 두뇌 파생 glial 세포를. 또한, 세포 캡슐화 및 confocal 면역 형광 및 전자 현미경을 스캐닝 하 여 하이드로 겔 비의 특성에 대 한 프로토콜을 보여 줍니다와 생리 활성 기판으로 비 계를 수정 하는 능력 뿐만 아니라 향상 된 셀 통합 상업 기저 lamina 혼합물 설립

신경 조직 호스트 응답 및 높은 처리량 glial 흉터를, 에서 시험관 시스템 생체, 원래의 장소에 형성 하는 동안 세포 독성 이벤트를 초래 하지 않습니다 이며 대 행렬 자료와 3D 셀 비 계 필요 로 자비로 운 응답 가이드 bioactive 구성 요소. 이 위해, 우리 히 알루 론 산에 따라 3D 셀 발판 시스템 하 고 캡슐화 기본 혼합된 glial 세포 인구 세포 세포 상호 작용 및 glial b...

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Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

여기, 우리는 쥐의 3D 문화에 대 한 프로토콜 이다, microglia, 및 oligodendrocytes를 포함 하 여 두뇌 파생 명과 셀을 제시. 1 차 세포 배양, methacrylated 히 알루 론 산 (하 마) 하이드로 겔 합성, HAMAphoto 중 합 및 셀 캡슐화 및 샘플 공초점 레이저 스캐닝 전자 현미경 이미징 처리 설명 합니다.

생체 외에서 Neuroinflammation의 모델링에 대 한 기본 Glial 세포의 3 차원 하이드로 겔 문화 개선

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

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3 차원 자기 조립 펩티드 히드로겔에서 인간 신경 전구 세포의 배양

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

연구

생체공학

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To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

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