Name: improved 3d hydrogel cultures of primary glial cells for in vitro modelling of neuroinflammation
Uploaded: 2017-12-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation at JoVE.com

Forfatterne er takknemlig for økonomisk støtte fra NSERC, CFI, AIHS, Alberta helsetjenester og Davey begavelse for hjerneforskning.

Protokollen for hjernen vev utvinning fra dag 1 Sprague Dawley rotte unger, euthanized ved halshogging, ble godkjent av Animal Care og bruk komiteen ved University of Alberta.
1. Microglia og astrocytter isolasjoner67,68
Merk: Alle medier for isolasjon og cellekultur er forvarmet til 37 ° C i et vannbad. Hanks balansert salt løsning (HBSS) har 1% penicillin-streptomycin (PS). Alle Dulbecco endret Eagle's med...

Mot målet å generere en 3D kultur-systemet til modell glial bioreactivity og glial arrdannelse prosessen, har vi utviklet et system som kan støtte primære kulturperler microglia, astrocyttene og oligodendrocytes og aktiverer robust karakteristikk av cellen morfologi og celle-celle interaksjoner. Micrographs vises, var morfologi av hver celle utpreget annerledes med 2D, 3D-HAMA og 3D HAMA-basale lamina blanding plattformer. I 2D-systemet, morfologi var tydelig forutinntatt langs flyet av overflaten, men sammenlignet m...

Betennelse i sentralnervesystemet (CNS) har lenge vært ansett som et kjennetegn på akutt (f.eks, iskemiske hjerneslag, traumatisk brain og ryggmargsskade) og kronisk (f.eks Alzheimers, Parkinsons og Huntingtons sykdommer) CNS skade, men er stadig mer anerkjent som kausale bidragsyter til nevrodegenerative og nevropsykiatriske lidelser. Vedvarende eller upassende betennelse kan forårsake neural skade og demyelinisering (f.eks multippel sklerose), og negativt påvirke hjernens utvikling (f.eks, schizofreni, autisme) og affektive tilstander (f.eks, depresjon, angst bipolar lidelse). Videre, romanen strategier bruker implanterbare enheter (f.eks., hjerne-datamaskin-grensesnitt1,2,3, dypt hjernen stimulering4,5, intraspinal microstimulation6,7,8,9,10) genererer en forutsigbar inflammatorisk respons på grensesnittet mellom enheten og CNS resulterer i en beskyttende vev svar som kan føre til tap av effekt eller enheten over levetiden til implantatet11. Betennelse i CNS er vanligvis initiert av microglia, som fungerer som bosatt immunceller av CNS ansvarlig for vev overvåking og montering fremmedlegeme svaret (anmelder12). Avhengig av alvorlighetsgraden av en fornærmelse, celle microglia signalet og rekruttere ytterligere typer til et skade. Spesielt microglia aktivere astrocyttene, som i sin tur fungerer som sekundær inflammatoriske celler og form en tett beskyttende barriere inneholder en skade nettstedet13,14. Microglia kan også starte en aktivitet gjennomgripende i cellene i eksterne immunsystemet, noe som kan resultere i nedbryting av BBB å tillate immun infiltrasjon (omtalt i referanse15).
Ved implantert i CNS, kan vevsskade som følge av innsetting av enheter som fortsatt tilstedeværelse av utenlandske enheten initiere en prosess kalt gliøst. I denne prosessen, microglia overføre til og sprer på stedet av skade. De også starte utgivelsen av inflammatoriske faktorer å nøytralisere potensielle trusler og rekruttere ytterligere gliacellene. Deretter aktivert astrocyttene blir hypertrofisk og begynne innkapsle en implantert enhet for å danne en sammenhengende fibrøs barriere16. Inflammatorisk signalisere tjener også til å fremme tilbaketrekking av neuronal prosesser fra nærheten av implantatet og til slutt rekrutterer fibroblaster å forsterke de utvikle glial arr17. Oligodendrocytes, ansvarlig for vindsperre nerveceller i myelin å forbedre konduktans, overleve ikke denne prosessen og fjerne celler er partisjonert fra implantatet av arr18. Gliøst sterkt reduserer funksjon og levetid implantert enheter, spesielt for opptak elektroder, og til slutt serverer begrense funksjonaliteten til neural grensesnitt19.
Flere tilnærminger har blitt utnyttet for å øke biocompatibility og grensesnitt aktivitet implantert enheter i CNS20,21,22,23. En omfattende vurdering er tilgjengelig på biokompatible utformingen av disse neural grensesnitt24. De mest fremtredende strategiene omfatter rundt elektroden med kompatibel belegg som polyelthyleneglycol (PEG), polylactic-co-glycolic syrer (PLGA)25, eller forbedre elektroden med ledende polymerer som poly (etylen dioxythiophene) (PEDOT), og polypyrrole (PPy)26,27,28,29,30,31. Bioaktive belegg har også vært ansatt å gi signaler for neural vevvekst med ligander avledet fra ekstracellulære matriser inkludert collagens, fibronectins og hyaluronic syren32,33,34 ,35,36,37. Bioactivity av disse belegg har vært utforsket med vekstfaktor utgivelsen systemer å etterligne naturlige celle sekreter30,38,39,40,41 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50. samtidig, noen forskningsgrupper har valgt for å remodel elektrode geometri, fleksibilitet og komposisjon redusere mekanisk misforholdet mellom enheten og vev51,52,53 ,54,55,56,57. Sammen har disse strategiene ført til mange lovende forbedringer i neste generasjons nevrale interfacial enheter, men langsiktig kompatibilitet er en pågående sak og fremdriften kan bli hindret av komplekse og tidkrevende i vivo modeller .
Dyr modell-baserte tilnærminger kan begrense eksperimentelle gjennomstrømningen og øke kostnadene ved testing elektrode biocompatibility. In vitro tilnærminger med konvensjonelle cellekultur teknikker tilbyr et mer kostnadseffektivt alternativ, men ikke recapitulate mye av kompleksiteten av samspillet mellom enheten og vev58. Spesielt testing av overflatebelegg bruker 2D celle kultur grenser modellering av elektroden geometri og påvirkning av mekaniske feil og micromotion som er tenkt å bidra til å generere vert svar bidrar til enheten feil59 , 60.
For å overvinne problemer forbundet med 2D cellekultur, har hydrogel kulturer av neural celler blitt utviklet for en rekke applikasjoner, farmakologiske studier61, for direkte neural cellen differensiering62, å forstå sykdom trasé63,64eller lag i co kultur med andre celletyper modell celle migrasjon, neuroprotection, eller modell vev microenvironments61. Hydrogels er lett dannet i forskjellige størrelser og geometrier kan inkludere mange typer primære eller udødeliggjort cellekulturer, og er svært mottakelig for analyse av brukte teknikker som AC confocal fluorescens mikroskopi. For å opprette en modell av glial arrdannelse prosessen, har vi nylig utviklet og kjennetegnes en hyaluronsyre basert 3D hydrogel system for høy gjennomstrømming testing av glial svaret implanterte elektroder (figur 1)65. Dette systemet har flere forskjellige fordeler: 1) primære gliacellene (microglia, astrocyttene og oligodendrocytes) er innkapslet i en 3D matrise som består av hyaluronsyre, som er en endogen ekstracellulær matrix komponent; 2) matrix stivhet kan være "innstilt" for å gjenskape de mekaniske egenskapene av hjernen eller ryggmargen vev; og 3) celler kan være innkapslet i matrisen i en rask benk toppen tilnærming photopolymerization med grønt lys, begrense toksisitet under innkapsling. Dette systemet muliggjør nøkkel vise egenskaper av i vivo biocompatibility: enheter inn i hydrogel på en tilsvarende måte til vev og cellulær respons til implantert enheter blir overvåket for en rekke parametere65. Disse inkluderer mekanisk misforholdet mellom enheter og hydrogel belegg av ulike strukturer og elektrisk stimulering pulser. Dette systemet omfatter også oligodendrocyte og relaterte forløpere, som er ofte tilstede og rekruttert i glial arr. Deres skade, død og fagocytose av microglia er svært indikativ av inflammatoriske skade som en modell redusert arrdannelse eller gjenoppretting, de har kapasitet til å demonstrere re-myelination av neurons66.
Her beskriver vi en metode for syntese og dannelsen av hybrid hyaluronsyre hydrogels kombinert med kommersielt tilgjengelig kjelleren membran formuleringer å forbedre celle innlemmelse. Videre vil vi vise innlemmelse av primære kulturperler gliacellene (microglia, astrocyttene og oligodendrocytes) og analyse av kultur vekst ved hjelp av immunocytochemistry og AC confocal mikroskopi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Materials for HAMA synthesis and photopolymerization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronic acid (HA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>53747-10G</td>
			<td>Streptococcus equi, MW: 1.5 - 1.8 X 10^6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride (MA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>275585-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Commerical Alcohols Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Anhydrous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (pH 7.4) tablets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine (TEA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90279-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Vinyl-2pyrrolidinone (NVP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V3409-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EosinY (EY)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6003-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440159-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (100 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (500 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1000-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH paper (Labstick)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Materials for glial cell isolation and cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1-2 Sprague Dawley rat pups</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>CD Sprague Dawley rat strain code 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissector scissors - slim blades (small)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14081-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors - Toughcut (large)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14130-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11521-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved fine forceps (Dumont #7)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium and Ham&#39;s nutrient mixture F-12 (DMEM/F12)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (PS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine (PLL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-6282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well Tissue culture treated plates (Cellstar)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665 108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-676-10K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (60 mm X 15 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100 mm X 15 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Coverslip (18 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-100 18CIR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Materials for microscopy (confocal and scanning electron microscopy)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-CNPase</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab6319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Iba1</td>
			<td>Wako Laboratory Chemicals</td>
			<td>019-17741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFAP</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab4674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td>Buffered (10%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>157-8</td>
			<td>Buffered (8%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guteraldehyde</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>16019</td>
			<td>Buffered (8%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetraoxide</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>19152</td>
			<td>Buffered (2%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldilazane (HMDS)</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>16700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>15055</td>
			<td>Anhydrous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide (25 X 75 X 1 mm)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved 3d hydrogel cultures of primary glial cells for in vitro modelling of neuroinflammation

I det sentrale nervesystemet, mange akutte skader og nevrodegenerative lidelser, så vel som implantert enheter eller biologisk materiale utviklet for å forbedre funksjonen resultatet i samme utfallet: overflødig betennelse fører til gliosis, cytotoksisitet, og/eller dannelsen av et glial arr som samlet forverre skade eller hindre sunn utvinning. Med hensikten å skape et system for modell glial arr dannelse og studere inflammatoriske prosesser, vi har generert en 3D celle stillaset direktetilknytning primære kulturperler gliacellene: microglia som regulerer fremmedlegeme svaret og starte den provoserende hendelsen, astrocyttene som svarer til danner et fibrøst arr. og oligodendrocytes som er vanligvis utsatt for inflammatorisk skade. Dette arbeidet gir detaljerte trinn for trinn metode for fabrikasjon, kultur og mikroskopiske karakterisering av en hyaluronsyre-basert 3D hydrogel stillaset med innkapslede rotten hjerne-avledet gliacellene. Videre, protokoller for karakterisering av cellen innkapsling og hydrogel stillaset av AC confocal immunofluorescence og skanning elektronmikroskop er bevist, og evnen til å endre stillaset med bioaktive underlag, med innlemmelse av en kommersiell basale lamina blanding for forbedret celle integrasjon.

For å modellere nevrale vev vert svaret og glial arr i en høy gjennomstrømning, krever i vitro system en 3D celle stillaset med en matrix-materiale som er biokompatible, ikke pådra en cytotoksisk hendelse under i situ dannelse og kan endres med bioaktive komponenter til guide velvillig reaksjon. Dette har vi opprettet et 3D celle stillaset system basert på hyaluronsyre og innkapslet primære blandet glial celle innbyggere å studere celle-celle interaksjoner og glia...

Watch this Scientific Journal Video about Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation at JoVE.com

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Her presenterer vi en protokoll for 3D kultur rotte hjerne-avledet glia cellene, inkludert astrocyttene, microglia og oligodendrocytes. Viser vi primære cellekultur, methacrylated hyaluronsyre (HAMA) hydrogel syntese, HAMAphoto-polymerisasjon og celle innkapsling og eksempel behandling for AC confocal og skanning elektron mikroskopiske bildebehandling.

Forbedret 3D Hydrogel kulturer av primære gliacellene for In Vitro modellering av Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

Dyrking av Human Neural stamceller i en 3-dimensjonal Self-montering Peptid Hydrogel

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Utvikling av Amelogenin-kitosan Hydrogel for<em&gt; In Vitro</em&gt; Emalje Gjengroing med en Dense Interface

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øyeirritasjonstest (EIT) for fareidentifikasjon for Eye irriterende kjemikalier som bruker Rekonstruert Menneskelig Hornhinnen lignende Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D Hydrogel Stillas for Ledd chondrocyttransplantasjon Kultur og brusk Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Bygging av Modular Hydrogel blad for Micropatterned Macro-skalert 3D Cellular Arkitektur

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Bruke Rekonstituert Blood Model Hemostase og platetransfusjon<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro modellsystemer indusere celle-formet formasjon

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

3D trykt porøse Cellulose Nanocomposite Hydrogel stillaser

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Protokoller av 3D Bioprinting av gelatin Methacryloyl hydrogel basert Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Avanserte 3D levermodeller for in vitro gentoksisitetstesting etter langvarig nanomaterialeeksponering

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...