Name: improved 3d hydrogel cultures of primary glial cells for in vitro modelling of neuroinflammation
Uploaded: 2017-12-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation at JoVE.com

Авторы признательны за финансовую поддержку от Сенти, CFI, AIHS, служб здравоохранения Альберты и Дэви дар для исследования мозга.

Протокол для извлечения ткани мозга от 1 день Sprague-Dawley крыса щенков, умерщвлены, обезглавливание, был одобрен животное уход и использование Комитетом в университете Альберты.
1. Микроглия и экзоцитоз изоляции67,68
Примечание: Вс?...

К цели создания 3D культуры системы модель глиальных bioreactivity и глиальных рубцов процесса мы разработали систему, которая может поддерживать основной культурный микроглии, астроциты и Олигодендроциты и обеспечивает надежную характеристику ячейки Морфология и ячеек взаимодействий. От ?...

Воспаление центральной нервной системы (ЦНС) уже давно считается признаком острого (например, ишемического инсульта, черепно-мозговой и травмы спинного мозга) и хронические (например болезнь Альцгеймера, Паркинсона и болезни Хантингтона) травмы ЦНС, Однако все шире признается как причинная вклад нейродегенеративных и нервно-психиатрическими расстройствами. Устойчивый или неуместным воспаление может вызвать нейронных травмы и демиелинизации (например рассеянный склероз) и негативно повлиять на развитие мозга (например, шизофрения, аутизм) и настроения государств (например, депрессии, тревоги Биполярное расстройство). Кроме того, Роман терапевтические стратегии, с помощью имплантируемых устройств (например., мозг компьютер интерфейсы1,2,3, глубокие мозга стимуляции4,5, межпозвонковые microstimulation6,,78,9,10) создания предсказуемой воспалительной реакции на стыке между устройством и ЦНС, что приводит к ответ защитной ткани, что может привести к потере эффективности или устройство отказа в течение имплантат11. Воспаления в ЦНС инициируется обычно микроглии, который функционировать в качестве резидентов иммунные клетки ЦНС, ответственных за наблюдение ткани и монтаж инородного тела ответа (обзор12). В зависимости от тяжести оскорбления, микроглии сигнал и набирать дополнительные ячейки типы сайт травмы. В частности микроглии активировать астроциты, которые в свою очередь выступают в качестве вторичных воспалительных клеток и формы плотный защитный барьер содержать травмы сайт13,14. Микроглии может также инициировать деятельность Каскад в клетках периферической иммунной системы, которая может привести к срыву BBB разрешить иммунной инфильтрат (обзор в ссылка15).
В случае устройства имплантируется в ЦНС ткани, ущерб от вставки устройства, а также продолжающееся присутствие иностранных устройства может инициировать процесс называют глиальных рубцов. В этом процессе микроглии мигрировать и размножаться на месте травмы. Они также инициировать освобождение воспалительных факторов для нейтрализации потенциальных угроз и набирать дополнительные глиальных клеток. Впоследствии активированные астроциты стать гипертрофических и начать инкапсуляции имплантированный сформировать непрерывный волокнистых барьер16. Воспалительные сигнализации также служит для поощрения вывода нейрональные процессы из окрестностей имплантата и в конечном итоге новобранцев фибробласты для укрепления развивающихся глиальный рубец17. Олигодендроциты, ответственных за обрешетки нейронов в миелина повышения проводимости, не пережить этот процесс и дальних клетки разделены от имплантата шрам18. Глиальные рубцов значительно уменьшает функции и жизни имплантированных устройств, особенно для записи электродов и в конечном счете служит для ограничения функциональности нейронных интерфейсы19.
Чтобы увеличить биосовместимость и действие интерфейса имплантированных устройств в ЦНС20,21,,2223использовались несколько подходов. Обширный обзор доступен на биосовместимых дизайн эти нейронные интерфейсы24. Наиболее известные стратегии включают в себя окружающие электрод с совместимыми покрытий, таких как polyelthyleneglycol (PEG), polylactic-co гликолевой кислоты (PLGA)25, или повышение электрод с электропроводящие полимеры, такие как поли (этилена dioxythiophene) (PEDOT) и политиофен (PPy)26,27,28,,2930,31. Биоактивные покрытия также были использованы для предоставления подсказок для роста нервной ткани, используя лигандов, производный от внеклеточной матрицы, включая коллагены, fibronectins и гиалуроновой кислоты32,33,34 ,35,,3637. Биологическую этих покрытий была изучена далее с фактором роста выпуска систем для имитации природных клеток выделениями30,,3839,40,41 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50. одновременно, некоторые исследовательские группы решили переделывать геометрия электрода, гибкость и композиции для уменьшения механического несоответствия между устройством и ткани51,52,53 ,54,55,56,57. В целом эти стратегии привели к множество многообещающих улучшений в нейронных межфазного устройств следующего поколения, однако долгосрочные совместимость является вопросом продолжается, и прогресс может сдерживаться сложным и длительным в vivo модели .
Животных подходы, основанные на модели можно ограничить экспериментальной пропускную способность и увеличить стоимость тестирования биосовместимость электрода. В vitro подходы с использованием обычных клеточной культуры техники предлагают более экономически эффективные альтернативы, но не резюмировать большую сложность взаимодействия между устройством и ткани58. В частности тестирование поверхности покрытий с использованием 2D клетки культуры ограничения моделирования геометрии электрода и влияние механического несоответствия и micromotion мысли способствовать генерации хоста ответ, способствуя устройство отказа59 , 60.
Преодолеть проблемы, связанные с 2D клеточной культуры, гидрогеля культур нервные клетки были разработаны для широкого спектра приложений, фармакологические исследования61, направлять нейронных клеток дифференциации62, чтобы понять болезнь пути63,64, или слоистых в совместное культуры с другими типами клеток модели миграции клеток, нейропротекторного эффекта, или модель ткани микросреды61. Гидрогели легко образуются в разных размеров и геометрии может включать многочисленные типы первичных или увековечен клеточных культур и очень поддаются анализа часто используемые методы, такие как конфокальный флуоресцентной микроскопии. Для создания модели процесса глиальных рубцов, мы недавно разработали и охарактеризовала систему гиалуроновой кислоты на основе гидрогеля 3D для высокой пропускной способности тестирования глиальных реакции имплантированных электродов (рис. 1)65. Эта система имеет ряд отличительных преимуществ: 1) первичных глиальных клеток (микроглии астроциты и Олигодендроциты), инкапсулированным в 3D-матрицы состоит из полимеров гиалуроновой кислоты, которая является компонентом эндогенного внеклеточная матрица; 2 матрицы жесткости можно «настроить» воссоздать механические свойства головного или спинного тканей; и 3) клетки может быть инкапсулирована в матрице в быстрый настольное подход с использованием фотополимеризации с зеленым светом, ограничение токсичности при инкапсуляции. Эта система позволяет ключевые особенности в vivo биосовместимость: устройств вставляются в гидрогеля на основе сопоставимых ткани, и клеточный ответ на имплантированного устройства контролируются для широкого спектра параметров65. К ним относятся механические несоответствие между устройствами и гидрогеля покрытий различных структур и электрическая стимуляция импульсами. Эта система также включает в себя Олигодендроциты и связанной с прекурсорами, которые часто присутствующих и набранных в глиальных шрамы. Их повреждение, смерть и фагоцитоз, микроглии весьма показательны воспалительных повреждений и как модель уменьшить рубцы или восстановления, они имеют способность продемонстрировать ре миелинизации нейронов66.
Здесь мы описываем метод синтеза и формирование гибридных гидрогели гиалуроновой кислоты в сочетании с коммерчески доступных базальной мембраны составов для улучшения ячейки инкорпорации. Кроме того мы покажем включения первичных культивировали глиальных клеток (микроглии, астроциты и Олигодендроциты) и анализ роста культуры с использованием иммуноцитохимии и confocal микроскопии.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Materials for HAMA synthesis and photopolymerization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronic acid (HA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>53747-10G</td>
			<td>Streptococcus equi, MW: 1.5 - 1.8 X 10^6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride (MA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>275585-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Commerical Alcohols Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Anhydrous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (pH 7.4) tablets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine (TEA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90279-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Vinyl-2pyrrolidinone (NVP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V3409-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EosinY (EY)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6003-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440159-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (100 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (500 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1000-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH paper (Labstick)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Materials for glial cell isolation and cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1-2 Sprague Dawley rat pups</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>CD Sprague Dawley rat strain code 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissector scissors - slim blades (small)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14081-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors - Toughcut (large)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14130-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11521-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved fine forceps (Dumont #7)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium and Ham&#39;s nutrient mixture F-12 (DMEM/F12)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (PS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine (PLL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-6282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well Tissue culture treated plates (Cellstar)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665 108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-676-10K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (60 mm X 15 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100 mm X 15 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Coverslip (18 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-100 18CIR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Materials for microscopy (confocal and scanning electron microscopy)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-CNPase</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab6319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Iba1</td>
			<td>Wako Laboratory Chemicals</td>
			<td>019-17741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFAP</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab4674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td>Buffered (10%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>157-8</td>
			<td>Buffered (8%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guteraldehyde</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>16019</td>
			<td>Buffered (8%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetraoxide</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>19152</td>
			<td>Buffered (2%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldilazane (HMDS)</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>16700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>15055</td>
			<td>Anhydrous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide (25 X 75 X 1 mm)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved 3d hydrogel cultures of primary glial cells for in vitro modelling of neuroinflammation

В центральной нервной системе, многочисленные острые травмы и нейродегенеративных расстройств, а также имплантированных устройств или биоматериалов инженерии для повышения функции результат в тот же результат: избыточное воспаление приводит к глиоза, цитотоксичность, и/или формирование глиальных шрам, коллективно усугубляют травмы или предотвратить здоровое восстановление. С целью создания системы для моделирования глиальный рубец образование и исследование воспалительных процессов, мы породили 3D клеток леску вмещать первичной культивировали глиальные клетки: микроглии, регулировать инородного тела ответа и инициировать воспалительные событие, астроциты, которые отвечают сформировать волокнистых шрам и олигодендроциты, которые обычно уязвимы к воспалительным травмы. Настоящая работа обеспечивает подробный пошаговый метод для изготовления, культуры и микроскопическая характеристика леску на основе гиалуроновой кислоты 3D гидрогеля с инкапсулированным крыса мозга производные глиальных клеток. Кроме того демонстрируются протоколы для характеризации клеток инкапсуляции и гидрогеля леса конфокальный иммунофлюоресценции и сканирующей электронной микроскопии, а также способность изменить на эшафот с биоактивными субстратов, с учет коммерческих базальной пластинки смесь Улучшенная ячейка интеграции.

К модели ответа хоста нервной ткани и глиальный рубец в высокой пропускной способности, в пробирке система требует 3D ячейки леску с матрицы материалом, который биосовместимых, не нести цитотоксических событий во время формирования в situ и изменяемые с биоакт?...

Watch this Scientific Journal Video about Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation at JoVE.com

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Здесь мы представляем протокол для 3D культуре крысы клеток мозга, полученных глии, включая астроциты, Микроглия и олигодендроциты. Мы демонстрируем культуры главной ячейки, гидрогеля синтез methacrylated гиалуроновой кислоты (HAMA), HAMAphoto полимеризации и ячейки инкапсуляции и образец обработки для конфокальных и сканирования электрона микроскопических изображений.

Улучшение 3D гидрогеля культур первичных глиальных клеток In Vitro моделирования Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

Культивирование прав нервные клетки-предшественники в 3-мерном самоорганизации пептидов Гидрогель

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Развитие амелогенина-хитозана гидрогеля для<em&gt; Экстракорпоральное</em&gt; Эмаль Восстановление с плотной интерфейса

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Раздражение глаз тест (СПЭ) для идентификации опасности глазных Раздражает химических веществ с использованием реконструированного человеческой роговицы, как Эпителиальный (RHCE) тканей Модель

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D Гидрогель Строительные леса для суставной хондроцит культуры и хряща поколения

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Строительство модульных гидрогеля листов для Micropatterned Макро-масштабного 3D Cellular архитектуры

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Микрожидкостных Flow Камеры Использование водостойких крови к модели гемостаза и тромбоцитарный Переливание<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

Bioprintable Альгинатные/желатин гидрогеля 3D в Vitro модель системы вызывать клетки сфероида образование

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

3D печать пористых целлюлозы нанокомпозитных гидрогеля подмости

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Протоколы 3D биопечати желатина Methacryloyl Гидрогель на основе биоинков

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Расширенные 3D модели печени для тестирования генотоксичности in vitro после долгосрочного воздействия наноматериалов

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...