Name: improved 3d hydrogel cultures of primary glial cells for in vitro modelling of neuroinflammation
Uploaded: 2017-12-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation at JoVE.com

Los autores están agradecidos por el apoyo financiero de NSERC, CFI, AIHS, servicios de salud de Alberta y la Fundación Davey para la investigación del cerebro.

El protocolo para la extracción de tejido de cerebro de crías de rata de Sprague Dawley de día 1, sacrificados por decapitación, fue aprobado por el cuidado Animal y uso de la Universidad de Alberta.
1. Microglia y astrositos aislamientos67,68
Nota: Todos los medios para el aislamiento y el cultivo celular es precalentado a 37 ° C en un baño de agua. Una solución salina equilibrada de Hank (HBSS) tiene ...

Con el objetivo de generar un sistema de cultura 3D modelo bioreactivity glial y el proceso de cicatrización glial, hemos desarrollado un sistema que puede apoyar primaria cultivada microglia, astrocitos y oligodendrocitos y permite la caracterización sólida de células interacciones célula-célula y morfología. De las micrografías muestras la morfología de cada tipo de célula era distintamente diferente con 3D, 2D y 3D-HAMA HAMA Basal lámina mezcla las plataformas. En el sistema 2D, morfología claramente era p...

Inflamación del sistema nervioso central (SNC) durante mucho tiempo ha sido considerado como un sello de aguda (p. ej., accidente cerebrovascular isquémico, cerebral y lesión medular) y crónicas (por ejemplo enfermedad de Alzheimer, Parkinson de y las enfermedades de Huntington) lesión del CNS, pero es cada vez más reconocido como una contribución causal a neurodegenerativas y trastornos neuropsiquiátricos. Sostenida o inflamación inadecuada puede causar lesiones neurales y desmielinización (p. ej. , esclerosis múltiple) e influyen negativamente en el desarrollo del cerebro (p. ej., esquizofrenia, autismo) y Estados de ánimo (p. ej., depresión, ansiedad trastorno bipolar). Además, nuevas estrategias terapéuticas utilizando dispositivos implantables (e.g., interfaces cerebro-computadora1,2,3, cerebral profunda estimulación4,5, intraspinal microstimulation6,7,8,9,10) generan una respuesta inflamatoria predecible en la interfaz entre el dispositivo y el SNC, resultando en un respuesta de tejido protector que puede causar pérdida de eficacia o dispositivo falla durante la vida útil de los implantes11. Inflamación en el SNC es típicamente iniciada por microglía, que funcionan como las células inmunes residentes del SNC responsable de vigilancia de tejido y la respuesta de cuerpo extraño (ha comentado12) de montaje. Dependiendo de la gravedad de un insulto, la señal de la microglia y recluta adicional celular tipos a un sitio de la lesión. Específicamente, la microglia activar los astrocitos, que a su vez actúan como células inflamatorias secundarias y forma una barrera protectora densa que contiene una lesión sitio13,14. Microglía también puede iniciar una cascada de actividad en las células del sistema inmune periférico, que puede resultar en la ruptura de la BBB para permitir la infiltración inmunitaria (revisada en la referencia15).
En el caso de dispositivos implantados en el SNC, daño tisular resultante de la inserción de un dispositivo así como la permanencia del dispositivo exterior puede iniciar un proceso llamado el marcar con una cicatriz glial. En este proceso, la microglia migran y proliferan en el sitio de la lesión. También inician la liberación de factores inflamatorios para neutralizar amenazas potenciales y reclutan más células gliales. Posteriormente, astrocitos activados se convierten hipertróficos y comienzan a encapsular el dispositivo implantado para formar una barrera fibrosa continua16. Señalización inflamatoria también sirve para promover la retirada de los procesos neuronales de la vecindad del implante y finalmente contrata a los fibroblastos para reforzar el desarrollo de cicatriz glial17. Los oligodendrocitos, responsables de recubrimiento de las neuronas de mielina para mejorar la conductancia, no sobreviven este proceso y se reparten las células distantes del implante por la cicatriz de18. Cicatriz glial grandemente reduce la función y vida útil de dispositivos implantados, especialmente para electrodos de grabación y en última instancia, sirve para limitar la funcionalidad de los interfaces neuronales19.
Varios acercamientos se han aprovechado para aumentar la biocompatibilidad y actividad del interfaz de dispositivos implantados en el CNS20,21,,,2223. Una extensa revisión está disponible en el diseño biocompatible de estas interfaces neuronales24. Las estrategias más importantes incluyen que rodea el electrodo con capas compatibles tales como polyelthyleneglycol (PEG), ácidos poliláctico-co-glicólico (PLGA)25, o mejorar el electrodo con polímeros conductores como poli (etileno dioxythiophene) (PEDOT) y el polypyrrole (PPy)26,27,28,29,30,31. Recubrimientos bioactivos también han sido empleados para proporcionar claves para el crecimiento del tejido neural con ligandos derivados de matrices extracelulares incluyendo colágenos, fibronectinas y ácidos hialurónico32,33,34 ,35,36,37. La bioactividad de estos recubrimientos se ha explorado más lejos con sistemas de liberación de factor de crecimiento para emular celular natural secreciones30,38,39,40,41 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50. al mismo tiempo, algunos grupos de investigación han optado por remodelar la geometría del electrodo, la flexibilidad y la composición para disminuir el desajuste mecánico entre aparato y tejidos51,52,53 ,54,55,56,57. En conjunto, estas estrategias han dado lugar a muchas mejoras prometedoras en dispositivos interfaciales neurales de próxima generación, sin embargo la compatibilidad a largo plazo es un problema en curso y el progreso puede verse obstaculizado por modelos complejos y lentos en vivo .
Enfoques basados en el modelo animal pueden limitar el rendimiento experimental y aumentan los costos de las pruebas de biocompatibilidad del electrodo. In vitro se aproxima mediante cultivo celular convencional técnicas ofrecen una alternativa más rentable pero no mucho de la complejidad de la interacción entre dispositivo y tejido58recapitular. En particular, pruebas de recubrimientos de superficie con límites de cultura celular 2D el modelado de la geometría del electrodo y la influencia del desajuste mecánico y micromotion pensado para contribuir a generar una respuesta de host contribuyendo al fracaso de dispositivo59 , 60.
Para superar los problemas asociados con el cultivo celular 2D, hidrogel cultivos de células neuronales se han desarrollado para una amplia variedad de aplicaciones, estudios farmacológicos61, para dirigir la célula neuronal diferenciación62, para entender la enfermedad vías63,64, o capas en co-cultivo con otros tipos de células para la migración celular de modelo, neuroprotección, o modelo tejido microambientes61. Los hidrogeles se forman fácilmente en diferentes tamaños y geometrías pueden incorporar varios tipos de cultivos celulares primarios o inmortalizadas y son altamente susceptibles de análisis por técnicas utilizadas como la microscopía de fluorescencia confocal. Para crear un modelo del proceso de cicatrización glial, recientemente hemos desarrollado y caracterizado un sistema de hidrogel 3D basado en ácido hialurónico para alto rendimiento de la prueba de la respuesta glial a electrodos implantados (figura 1)65. Este sistema tiene varias ventajas: 1) primarias células gliales (microglia, astrocitos y oligodendrocitos) están encapsuladas en una matriz 3D compuesto por polímeros de ácido hialurónico, que es un componente de la matriz extracelular endógeno; 2) la rigidez de la matriz puede ser 'afinada' para recrear las propiedades mecánicas del cerebro o el tejido de la médula espinal; y 3) las células pueden ser encapsuladas en la matriz en forma de mesa rápida mediante fotopolimerización con luz verde, limitar la toxicidad durante la encapsulación. Este sistema permite que las características clave de biocompatibilidad en vivo : los dispositivos se insertan en el hidrogel de manera comparable al tejido, y la respuesta celular a dispositivos implantados son supervisados para una amplia gama de parámetros65. Estos incluyen mecánica falta de coincidencia entre los dispositivos y los recubrimientos de hidrogel de diversas estructuras y pulsos de estimulación eléctrica. Este sistema también incluye oligodendrocyte y precursores relacionados, que están a menudo presentes y reclutados en las cicatrices gliales. Su fagocitosis por microglía, daño y muerte son altamente indicativos de lesión inflamatoria y un modelo de reducción de cicatrización o recuperación, tienen la capacidad para demostrar re-mielinización de las neuronas66.
Adjunto describimos un método para la síntesis y formación de híbridos hidrogeles de ácido hialurónico combinados con formulaciones disponibles en el mercado la membrana del sótano para mejorar la incorporación de la célula. Además, demostraremos la incorporación de las células gliales cultivadas primarias (microglia, astrocitos y oligodendrocitos) y análisis del crecimiento de la cultura mediante inmunocitoquímica y microscopía confocal.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Materials for HAMA synthesis and photopolymerization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronic acid (HA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>53747-10G</td>
			<td>Streptococcus equi, MW: 1.5 - 1.8 X 10^6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride (MA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>275585-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Commerical Alcohols Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Anhydrous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (pH 7.4) tablets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine (TEA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90279-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Vinyl-2pyrrolidinone (NVP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V3409-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EosinY (EY)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6003-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440159-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (100 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (500 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1000-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH paper (Labstick)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Materials for glial cell isolation and cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1-2 Sprague Dawley rat pups</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>CD Sprague Dawley rat strain code 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissector scissors - slim blades (small)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14081-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors - Toughcut (large)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14130-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11521-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved fine forceps (Dumont #7)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium and Ham&#39;s nutrient mixture F-12 (DMEM/F12)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (PS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine (PLL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-6282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well Tissue culture treated plates (Cellstar)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665 108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-676-10K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (60 mm X 15 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100 mm X 15 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Coverslip (18 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-100 18CIR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Materials for microscopy (confocal and scanning electron microscopy)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-CNPase</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab6319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Iba1</td>
			<td>Wako Laboratory Chemicals</td>
			<td>019-17741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFAP</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab4674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td>Buffered (10%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>157-8</td>
			<td>Buffered (8%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guteraldehyde</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>16019</td>
			<td>Buffered (8%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetraoxide</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>19152</td>
			<td>Buffered (2%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldilazane (HMDS)</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>16700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>15055</td>
			<td>Anhydrous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide (25 X 75 X 1 mm)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved 3d hydrogel cultures of primary glial cells for in vitro modelling of neuroinflammation

En el sistema nervioso central, numerosas lesiones agudas y enfermedades neurodegenerativas, así como implantados dispositivos o biomateriales diseñados para mejorar el resultado de la función en el mismo resultado: inflamación exceso conduce a gliosis, citotoxicidad, o formación de una cicatriz glial que colectivamente exacerban la lesión o impiden la sana recuperación. Con la intención de crear un sistema modelo cicatriz glial formación y estudio de los procesos inflamatorios, hemos generado un andamio celular 3D capaz de albergar células gliales cultivadas primarias: microglía que regulan la respuesta de cuerpo extraño e iniciar la eventos inflamatorios, astrocitos que responden a la forma de una cicatriz fibrosa y oligodendrocitos que son generalmente vulnerables a lesiones inflamatorias. El presente trabajo proporciona un método paso a paso detallado de la fabricación, la cultura y la caracterización microscópica de un andamio de hidrogel 3D a base de ácido hialurónico con encapsulado rata derivado de células gliales. Además, se demuestran los protocolos para la caracterización de la encapsulación de la célula y el andamio de hidrogel por inmunofluorescencia confocal y microscopía electrónica de barrido, así como la capacidad de modificar el andamio con substratos bioactivos, con incorporación de una mezcla comercial lámina basal a la integración mejorada de la célula.

Para modelar la respuesta del huésped tejido neural y la cicatriz glial en un alto rendimiento, sistema in vitro requiere un andamiaje celular 3D con un material de matriz que es biocompatible, no incurrir en un evento de citotóxico durante la formación en situ y es modificable con componentes bio-activos para guiar la respuesta benévola. Para ello, hemos creado un sistema de andamio de celular 3D basado en ácido hialurónico y encapsulado en una población de célu...

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Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Adjunto, presentamos un protocolo para el cultivo 3D de rata células glia derivado del cerebro, incluyendo astrocitos, microglia y oligodendrocitos. Demostramos cultivo celular primario, síntesis de hidrogel desarrolla el ácido hialurónico (HAMA), encapsulación HAMAphoto-polimerización y de la célula y muestra de procesamiento para la proyección de imagen microscópica electrónica de barrido y confocal.

Mejora 3D hidrogel culturas de células Glial primarias para In Vitro modelado de neuroinflamación

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