Name: improved 3d hydrogel cultures of primary glial cells for in vitro modelling of neuroinflammation
Uploaded: 2017-12-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation at JoVE.com

Författarna är tacksamma för finansiellt stöd från NSERC, CFI, AIHS, Alberta Health Services och Davey begåvningen för hjärnforskning.

Protokollet för hjärnans vävnad utvinning från dag 1-Sprague Dawley råttungar, euthanized genom halshuggning, godkändes av djur vård och användning kommittén vid University of Alberta.
1. mikroglia och Astrocyten isoleringar67,68
Obs: Alla medier för isolering och cellodling är förvärmd till 37 ° C i ett vattenbad. Hanks balanserad saltlösning (HBSS) har 1% penicillin-streptomycin (PS). Alla Dul...

Mot målet att generera en 3D kultur system till modell gliaceller bioreactivity och gliaceller ärrbildning processen, har vi utvecklat ett system som kan stödja primära odlade mikroglia, astrocyter och oligodendrocyter och möjliggör robust karakterisering av cell morfologi och cell-cell interaktioner. Från de micrographs som visas, var morfologi av varje celltyp påtagligt annorlunda med 2D, 3D-HAMA och 3D HAMA-basala lamina blandning plattformar. I 2D-systemet morfologi var tydligt partisk längs med ytan plan, m...

Inflammation i centrala nervsystemet (CNS) har länge ansetts vara ett signum för akut (t.ex., ischemisk stroke, traumatisk hjärnskada och ryggmärgsskada) och kronisk (t.ex. Alzheimers, Parkinsons och Huntingtons sjukdomar) CNS skada, men känns alltmer som en kausal bidragsgivare till neurodegenerativa och neuropsykiatriska funktionsnedsättningar. Ihållande eller olämpligt inflammation kan orsaka neurala skada och demyelinisering (t ex multipel skleros), och negativt påverka hjärnans utveckling (t.ex., schizofreni, autism) och mood states (t.ex., depression, ångest bipolär sjukdom). Ytterligare, nya terapeutiska strategier använder implanterbara produkter (t.ex., hjärna-dator-gränssnitt1,2,3, djupa hjärnan stimulering4,5, intraspinala microstimulation6,7,8,9,10) generera en förutsägbar inflammatorisk reaktion i gränssnittet mellan enheten och CNS resulterar i en skyddande vävnad svar som kan orsaka förlust av effekt eller enhet misslyckande under hela livstiden för implantatet11. Inflammation i CNS initieras vanligen av mikroglia, som fungera som bosatt immuncellerna i CNS ansvarar för övervakning av vävnad och montering främmande kropp svaret (granskade12). Beroende på svårighetsgraden av en förolämpning, cell mikroglia signalen och rekrytera ytterligare typer till en skada. Specifikt, aktivera mikroglia astrocyterna, som i sin tur fungerar som sekundära inflammatoriska celler och bildar en tät skyddande barriär ska innehålla en skada plats13,14. Mikroglia kan också initiera en aktiviteten kaskad i cellerna i perifera immunförsvaret, vilket kan leda till nedbrytning av BBB att tillåta immun infiltration (ses i referens15).
När det gäller produkter som implanteras i CNS, kan vävnadsskada som följd av enheten införande samt den fortsatta närvaron av utländska enheten initiera en process som kallas gliaceller ärrbildning. I denna process, mikroglia migrera till och föröka sig på platsen för skadan. De initierar också frisättningen av inflammatoriska faktorer att neutralisera potentiella hot och rekrytera ytterligare gliaceller. Därefter aktiverade astrocyter blivit hypertrofisk och börjar kapsla in den implanterade enheten för att bilda en kontinuerlig fibrösa barriär16. Inflammatoriska signalering tjänar också till att främja tillbakadragande av neuronala processer från närheten av implantatet och så småningom rekryterar fibroblaster för att förstärka den framkallande gliaceller ärr17. Oligodendrocyter, ansvarig för mantlar nervceller i myelin att förbättra konduktans, överlever inte denna process och avlägsna celler är partitionerade från implantatet av ärr18. Gliaceller ärrbildning kraftigt minskar funktion och livslängd av inopererade enheter, särskilt för inspelning elektroder, och i slutändan tjänar till att begränsa funktionaliteten av neurala gränssnitt19.
Flera metoder har utnyttjats för att öka av biokompatibilitet och gränssnitt aktiviteten av implantat i CNS20,21,22,23. En omfattande översyn är tillgänglig på biokompatibla utformningen av dessa neurala gränssnitt24. De mest framträdande strategierna inkluderar kring elektroden med kompatibel beläggningar såsom polyelthyleneglycol (PEG), polylactic-co-glykolsyra syror (PLGA)25, eller förbättra elektroden med ledande polymerer såsom poly (etylen dioxythiophene) (PEDOT), och Polypyrrol (PPy)26,27,28,29,30,31. Bioaktiva beläggningar har också använts för att ge ledtrådar för neural vävnadstillväxt med hjälp av ligander som härrör från extracellulära matriser inklusive kollagen, fibronectins och hyaluronsyror32,33,34 ,35,36,37. Bioaktiviteten av dessa beläggningar har utforskats vidare med tillväxtfaktor release system att efterlikna naturliga cell sekret30,38,39,40,41 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50. samtidigt, vissa forskargrupper har valt för att renovera den elektrod geometri, flexibilitet och sammansättning för att minska den mekaniska obalansen mellan enheten och vävnad51,52,53 ,54,55,56,57. Sammantaget har dessa strategier lett till många lovande förbättringar i nästa generations neurala gränsskiktspänning enheter, men de långsiktiga kompatibiliteten är ett pågående problem och framsteg kan hämmas av komplexa och tidskrävande i vivo modeller .
Djur modell-baserade metoder kan begränsa den experimentella genomströmningen och öka kostnaderna för testning elektrod biokompatibilitet. Närmar sig med konventionell cellkultur tekniker erbjuda ett mer kostnadseffektivt alternativ men misslyckas med att sammanfatta mycket av komplexiteten i interaktionen mellan enheten och vävnad58 in vitro . I synnerhet testning av ytbeläggningar som använder 2D cell kultur gränser modellering av elektroden geometri och mekaniska obalans och mikrorörelse tros bidra till att generera en värdrespons bidrar till enheten misslyckande59 inflytande , 60.
För att övervinna problemen med 2D cellkultur, har hydrogel kulturer av neurala celler utvecklats för en mängd olika applikationer, farmakologiska studier61, för direkt neurala cell differentiering62, att förstå sjukdomen vägar63,64, eller skiktad i samtidig kultur med andra celltyper modell cellmigration, neuroprotektion, eller modell vävnad mikromiljö61. Hydrogeler bildas lätt i olika storlekar och geometrier kan införliva många typer av primär eller förevigade cellkulturer, och är mycket mottagliga för analys av vanliga tekniker såsom confocal fluorescensmikroskopi. För att skapa en modell av gliaceller ärrbildning processen, har vi nyligen utvecklat och kännetecknas ett hyaluronsyra baserat 3D hydrogel system för hög genomströmning tester av gliaceller svar till implanterade elektroder (figur 1)65. Detta system har flera tydliga fördelar: 1) primära gliaceller (mikroglia, astrocyter och oligodendrocyter) är inkapslade i en 3D matrix består av polymerer av hyaluronsyra, som är en endogen extracellulärmatrix komponent; (2) matrix styvheten kan ställas 'in' för att återskapa de mekaniska egenskaperna av hjärnan eller ryggmärgsvävnad; och 3) celler kan vara inkapslade i matrisen i en snabb bänk strategi med fotopolymerisation med grönt ljus, begränsar toxicitet under inkapsling. Detta system möjliggör nyckel dragen av i vivo biokompatibilitet: enheter infogas i hydrogel på ett jämförbart sätt att vävnad och cellulära svaret på implantat ska övervakas för en rad olika parametrar65. Dessa inkluderar mekaniska mismatch mellan enheter och hydrogel beläggningar av olika strukturer och elektrisk stimulering pulser. Detta system innehåller också oligodendrocyte och relaterade prekursorer, som ofta närvarande och rekryterade i gliaceller ärr. Deras skador, dödsfall och fagocytos av mikroglia är ett starkt tecken på inflammatorisk skada och som en modell minskar ärrbildning eller återhämtning, de har kapacitet att demonstrera re-myelinisering av nervceller66.
Häri beskriver vi en metod för syntes och bildandet av hybrid hyaluronsyra hydrogels kombinerat med kommersiellt tillgängliga basalmembranet formuleringar att förbättra cell inkorporering. Vidare kommer vi att Visa införlivandet av primära odlade gliaceller (mikroglia, astrocyter och oligodendrocyter) och analys av kultur tillväxt med hjälp av immuncytokemi och konfokalmikroskopi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Materials for HAMA synthesis and photopolymerization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronic acid (HA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>53747-10G</td>
			<td>Streptococcus equi, MW: 1.5 - 1.8 X 10^6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride (MA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>275585-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Commerical Alcohols Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Anhydrous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (pH 7.4) tablets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine (TEA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90279-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Vinyl-2pyrrolidinone (NVP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V3409-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EosinY (EY)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6003-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440159-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (100 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (500 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1000-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH paper (Labstick)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Materials for glial cell isolation and cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1-2 Sprague Dawley rat pups</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>CD Sprague Dawley rat strain code 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissector scissors - slim blades (small)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14081-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors - Toughcut (large)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14130-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11521-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved fine forceps (Dumont #7)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium and Ham&#39;s nutrient mixture F-12 (DMEM/F12)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (PS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine (PLL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-6282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well Tissue culture treated plates (Cellstar)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665 108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-676-10K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (60 mm X 15 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100 mm X 15 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Coverslip (18 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-100 18CIR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Materials for microscopy (confocal and scanning electron microscopy)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-CNPase</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab6319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Iba1</td>
			<td>Wako Laboratory Chemicals</td>
			<td>019-17741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFAP</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab4674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td>Buffered (10%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>157-8</td>
			<td>Buffered (8%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guteraldehyde</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>16019</td>
			<td>Buffered (8%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetraoxide</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>19152</td>
			<td>Buffered (2%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldilazane (HMDS)</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>16700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Electon Microscopy Sciences</td>
			<td>15055</td>
			<td>Anhydrous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide (25 X 75 X 1 mm)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved 3d hydrogel cultures of primary glial cells for in vitro modelling of neuroinflammation

I det centrala nervsystemet, många akuta skador och neurodegenerativa sjukdomar, samt som inopererade enheter eller biomaterial konstruerad för att förbättra funktion leder till samma resultat: överskott inflammation leder till gliosis, cytotoxicitet, eller bildandet av ett gliaceller ärr som kollektivt förvärra skadan eller förhindra hälsosam återhämtning. Med avsikt att skapa ett system att modellera gliaceller ärr bildning och studie inflammatoriska processer, vi har genererat en 3D cell byggnadsställning kan bostäder primära odlade gliaceller: mikroglia som reglerar främmande kropp svaret och initiera den inflammatorisk händelse, astrocyter som svarar på bildar ett fibröst ärr och oligodendrocyter som är vanligtvis sårbara för inflammatorisk skada. Den nuvarande arbetet ger en detaljerad steg för steg metod för tillverkning, kultur och mikroskopisk karakterisering av en hyaluronsyra-baserat 3D hydrogel Rullställning med inkapslade rat brain-derived gliaceller. Ytterligare, protokoll för karakterisering av cell inkapsling och hydrogel ställningen av confocal immunofluorescens och svepelektronmikroskopi styrkas samt kapacitet att ändra ställningen med bioaktiva substrat, med införlivandet av en kommersiell basala lamina blandning till förbättrad cell integration.

För att modellera nervvävnad värd svaret och gliaceller ärret i en hög genomströmning, kräver in vitro system en 3D cell byggnadsställning med ett matrismaterial som är biokompatibla och medför en cytotoxisk händelse under i situ bildandet är modifierbara med bioaktiva komponenter att vägleda välvilliga svar. Därför har vi skapat en 3D cell byggnadsställning baserat på hyaluronsyra, och inkapslade en primär blandad glial cell befolkningen för att stud...

Watch this Scientific Journal Video about Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation at JoVE.com

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Häri, presenterar vi ett protokoll för 3D kulturen i rat brain-derived gliaceller, inklusive astrocyter, mikroglia och oligodendrocyter. Vi visar primär cellkultur, methacrylated (HAMA) hydrogel hyaluronsyresyntesen, HAMAphoto-polymerisation och cell inkapsling och prov bearbetning för confocal och scanning electron mikroskopbilder.

Förbättrad 3D Hydrogel kulturer av primära gliaceller för In Vitro modellering av Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

Odling av mänskliga neurala stamceller i en 3-dimensionell självorganiserande Peptide Hydrogel

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Utveckling av Amelogenin-chitosan Hydrogel för<em&gt; In Vitro</em&gt; Emalj Återväxt med en Tät gränssnitt

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Ögonirritationstest (EIT) för Hazard Identifiering av Eye irriterande kemikalier med hjälp av rekonstruerad Human Cornea liknande Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D Hydrogel Byggnadsställningar för Articular kondrocyt kultur och brosk Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Konstruktion av Modular hydrogel Skivor för Micropatterned Makro skalas 3D Cellular Architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Mikroflödes Flow Chambers Använda Beredd blod till modell Hemostas och trombocyttransfusion<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

Bioprintable alginat/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro modellsystem framkalla Cell sfäroid bildas

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

3D tryckta porösa cellulosa Nanocomposite Hydrogel ställningar

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Protokoll för 3D Bioprinning av gelatin Methacryloyl hydrogel baserade Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Avancerade 3D-levermodeller för in vitro-genotoxicitytestning efter långvarig nanomaterialexponering

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...