Name: immunofluorescence microscopy of &#947;h2ax and 53bp1 for analyzing the formation and repair of dna double-strand breaks
Uploaded: 2017-11-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Microscopy of ÃŽÂ³H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks at JoVE.com

הפרויקט נתמך על ידי קרן לוקמיה קאררס חוסה (DJCLS 14 R/2017) הגרמני.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי ה השני ועדת האתיקה של מנהיים בפקולטה לרפואה של אוניברסיטת היידלברג. נכתב מדעת הושג מאנשים כל.
 1. הכנה של חומרים <ol><li>פתרון מניות קרישה: להכין פתרון מניות קרישה של הפארין I.U. 200 לכל מ ב- 0.9% נתרן כלורי. למלא כל אחד הצינורות אוסף (לצייר ...

<ol>
	<li>Hoeijmakers, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+maintenance+mechanisms+for+preventing+cancer.">Genome maintenance mechanisms for preventing cancer.</a> Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).</li><li>Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instability+and+decay+of+the+primary+structure+of+DNA.">Instability and decay of the primary structure of DNA.</a> Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).</li><li>Zeman, M. K., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+replication+stress.">Causes and consequences of replication stress.</a> Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).</li><li>. Biological effects of low doses of ionizing radiation: A fuller picture Available from: <a target="_blank" href="https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf">https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf</a> (1994)</li><li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+DNA+double-strand+breaks:+production,+fidelity+of+repair,+and+induction+of+cancer.">Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12871-12876 (2003).</li><li>Simsek, D., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+end-joining+is+suppressed+by+the+canonical+NHEJ+component+Xrcc4-ligase+IV+during+chromosomal+translocation+formation.">Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation.</a> Nat Struct Mol Biol. 17 (4), 410-416 (2010).</li><li>Weinstock, D. M., Brunet, E., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+NHEJ-derived+reciprocal+chromosomal+translocations+does+not+require+Ku70.">Formation of NHEJ-derived reciprocal chromosomal translocations does not require Ku70.</a> Nat Cell Biol. 9 (8), 978-981 (2007).</li><li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139.">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li><li>Scully, R., Xie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+strand+break+repair+functions+of+histone+H2AX.">Double strand break repair functions of histone H2AX.</a> Mutat Res. 750 (1-2), 5-14 (2013).</li><li>Walters, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+ongoing+DNA+damage+in+multiple+myeloma+cells+as+revealed+by+constitutive+phosphorylation+of+H2AX.">Evidence for ongoing DNA damage in multiple myeloma cells as revealed by constitutive phosphorylation of H2AX.</a> Leukemia. 25 (8), 1344-1353 (2011).</li><li>Yu, T., MacPhail, S. H., Banath, J. P., Klokov, D., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+expression+of+phosphorylated+histone+H2AX+in+tumors+in+relation+to+DNA+double-strand+breaks+and+genomic+instability.">Endogenous expression of phosphorylated histone H2AX in tumors in relation to DNA double-strand breaks and genomic instability.</a> DNA Repair (Amst). 5 (8), 935-946 (2006).</li><li>Sedelnikova, O. A., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GammaH2AX+in+cancer+cells:+a+potential+biomarker+for+cancer+diagnostics,+prediction+and+recurrence.">GammaH2AX in cancer cells: a potential biomarker for cancer diagnostics, prediction and recurrence.</a> Cell Cycle. 5 (24), 2909-2913 (2006).</li><li>Chen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAK2V617F+promotes+replication+fork+stalling+with+disease-restricted+impairment+of+the+intra-S+checkpoint+response.">JAK2V617F promotes replication fork stalling with disease-restricted impairment of the intra-S checkpoint response.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15190-15195 (2014).</li><li>Popp, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+of+DNA+damage+and+alteration+of+the+DNA+damage+response+in+myelodysplastic+syndromes+and+acute+myeloid+leukemias.">Increase of DNA damage and alteration of the DNA damage response in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias.</a> Leuk Res. 57, 112-118 (2017).</li><li>Panier, S., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+break+repair:+53BP1+comes+into+focus.">Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (1), 7-18 (2014).</li><li>Escribano-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+cycle-dependent+regulatory+circuit+composed+of+53BP1-RIF1+and+BRCA1-CtIP+controls+DNA+repair+pathway+choice.">A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice.</a> Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).</li><li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+White+Blood+Cells.">Separation of White Blood Cells.</a> Nature. 204, 793-794 (1964).</li><li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood.+Isolation+of+monuclear+cells+by+one+centrifugation,+and+of+granulocytes+by+combining+centrifugation+and+sedimentation+at+1+g.">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g.</a> Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).</li><li>Bain, B., Pshyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+reactivity+in+mixed+leukocyte+cultures+after+separation+of+mononuclear+cells+on+Ficoll-Hypaque.">Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque.</a> Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).</li><li>Popp, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+DNA+damage+after+reduced+and+conventional+absorbed+radiation+doses+using+3rd+generation+dual-source+CT+technology.">Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology.</a> Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).</li><li>Rothkamm, K., Balroop, S., Shekhdar, J., Fernie, P., Goh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+DNA+damage+after+multi-detector+row+CT:+a+quantitative+biomarker+of+low-level+radiation+exposure.">Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure.</a> Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).</li><li>Lobrich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+formation+and+repair+of+DNA+double-strand+breaks+after+computed+tomography+examinations.">In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (25), 8984-8989 (2005).</li><li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fixatives+for+immunostaining.">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods Mol Biol. 588, 55-61 (2010).</li><li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+cell+membranes.">Permeabilization of cell membranes.</a> Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).</li><li>Rothkamm, K., Lobrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+lack+of+DNA+double-strand+break+repair+in+human+cells+exposed+to+very+low+x-ray+doses.">Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5057-5062 (2003).</li></ol>

מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX, 53BP1 היא שיטה שימושית לניתוח היווצרות ותיקון של DSB, בקשת רחבה של תחומי מחקר. פרמטרים קריטיים המשפיעים על התוצאה של הניסויים הם השלב של מחזור התא, הסוכנים המשמש את הקיבעון ואת permeabilization של התאים, הבחירה של הנוגדנים, ורכיבי חומרה ותוכנה של המיקרוסקופ זריחה.
<p class="jove...

הדנ א פגום באופן רציף על ידי אנדוגני (למשל, השכפול מתחים, מינים חמצן תגובתי, חוסר יציבות פנימי של ה-DNA), אקסוגני (למשל, רדיקלים כימי, הקרנה) מקורות (איור 1)1,2 3, ,4. בין נזק לדנ א, מעברי כפול-גדיל ה-DNA (DSB) נגעים רציני במיוחד, עשוי לגרום מוות של תאים או carcinogenesis. כ-50 DSB שעלולים להתעורר לכל מחזור התא ותא.5. בתרבית של תאים, רקומבינציה הומולוגית (HR) והצטרפות nonhomologous סוף-(NHEJ) פיתח כמו מסלולים עיקריים עבור התיקון של DSB (איור 2). HR מתרחשת בשלב מאוחר S/G2 ומשתמש אחות שלם כרומטידה כתבנית לתיקון פוטנציאלי ללא שגיאות. לשם השוואה, NHEJ הוא פעיל במהלך מחזור התא, פוטנציאל מוטגניות כפי בסיסי זוגות ניתן להוסיף או resected לפני מצדו של הקצוות השבורים. בנוסף, סוף-הצטרפות אלטרנטיבית עשויים להיות עסוקים כמנגנון איטי מוטגניות גיבוי תיקון במקרה של NHEJ מחסור6,7.
DSB לגרום זירחון של היסטון H2AX-סרין 139 באזור של כמה זוגות megabase סביב כל DSB. מוקדים הגרעין ויוצרים נקראים γH2AX מוקדים, ניתן לזהות על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence8. ΓH2AX מקדמת את גיוס נוסף DSB מגיב חלבונים, ומעורב כרומטין שיפוץ, תיקון ה-DNA, ואת האות התמרה חושית9. כמו כל פוקוס γH2AX נחשב לייצוג של DSB יחיד, כימות של DSB על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence הוא אפשרי, אשר הוכח שורות תאים סרטן, דגימות מטופלים10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (איגוד p53 חלבון 1) הוא חלבון מפתח אחר במתווכים DSB תיקון. . מעורב בלשכת הגיוס של DSB מגיב חלבונים, מחסום איתות את synapsis של DSB קצוות15. בנוסף, 53BP1 ממלאת תפקיד קריטי בבחירת מסלול תיקון DSB. זה מפעיל התיקון של DSB לכיוון NHEJ אמנם HR מנעו16. בהתחשב בפונקציות מקורית של γH2AX ו- 53BP1 תיקון DSB, ניתוח בו זמנית של γH2AX ו- 53BP1 על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence עשוי להיות שיטה שימושית עבור ניתוח מדויק של היווצרות והתיקון של DSB.
כתב יד זה מספק פרוטוקול צעד אחר צעד לביצוע immunofluorescence מיקרוסקופיה של γH2AX ושל 53BP1 בתוך גרעין התא. באופן ספציפי, השיטה מיושמת fibroblasts נורמלי של קו תא NHDF, רנטגן מוקרן לימפוציטים של אדם בריא, תאי CD34 + של חולה עם לוקמיה מיאלואידית חריפה. הפרטים של השיטה הם הצביע בהקשר של התוצאות שהוצגו.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="630">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">RPMI medium</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">R0883</td>
			<td style="width:200px;">Medium for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:119px;">ratiopharm</td>
			<td style="width:104px;">PZN 3029843</td>
			<td style="width:200px;">&#160;Heparin 5,000 I.U. / mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sodium chloride solution 0.9%</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td style="width:104px;">PZN 1957154</td>
			<td style="width:200px;">Component of the anticoagulant stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Ficoll-Paque Premium</td>
			<td style="width:119px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:104px;">17-5442-02</td>
			<td style="width:200px;">Medium for isolation of mononuclear cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Trypsin solution 10X</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">59427C</td>
			<td style="width:200px;">Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">CD34 MicroBead Kit</td>
			<td style="width:119px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:104px;">130-046-702</td>
			<td style="width:200px;">Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Diagnostic microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER-203B-CE24</td>
			<td style="width:200px;">Microscope slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Megafuge 1.0 R</td>
			<td style="width:119px;">Heraeus</td>
			<td style="width:104px;">75003060</td>
			<td style="width:200px;">&#160;Tabletop centrifuge&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cytospin device</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Lid</td>
			<td style="width:119px;">Heraeus</td>
			<td>76003422</td>
			<td style="width:200px;">Lid for working without micro-tubes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Cyto container</td>
			<td style="width:119px;">Heraeus</td>
			<td style="width:104px;">75003416</td>
			<td style="width:200px;">Cyto container with 2 conical bores</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Clip carrier</td>
			<td style="width:119px;">Heraeus</td>
			<td style="width:104px;">75003414</td>
			<td style="width:200px;">Carrier for holding a cyto container and a slide</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Support insert</td>
			<td style="width:119px;">Heraeus</td>
			<td style="width:104px;">75003417</td>
			<td style="width:200px;">Support insert for holding a clip carrier</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Triton X-100 (Octoxinol 9)</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;">85112</td>
			<td style="width:200px;">Detergent for permeabilization of cell membranes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Potassium hydroxide solution 1M</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:104px;">109107</td>
			<td style="width:200px;">Necessary for preparing the paraformaldehyde solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">P6148</td>
			<td style="width:200px;">Fixation agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">D8537</td>
			<td style="width:200px;">Balanced salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Chemiblocker</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:104px;">2170</td>
			<td style="width:200px;">Blocking agent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Mouse monoclonal anti-&#947;H2AX antibody (JBW301)</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:104px;">05-636</td>
			<td style="width:200px;">Primary antibody for detection of &#947;H2AX</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304)</td>
			<td style="width:119px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:104px;">NB100-304</td>
			<td style="width:200px;">Primary antibody for detection of 53BP1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:119px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;">A-11001</td>
			<td style="width:200px;">Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Alexa Fluor 555-conjugated goat anti-rabbit antibody</td>
			<td style="width:119px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;">A-21428</td>
			<td style="width:200px;">Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Vectashield mounting medium</td>
			<td style="width:119px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:104px;">H-1200</td>
			<td style="width:200px;">Contains DAPI for staining of DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Axio Scope.A1</td>
			<td style="width:119px;">Zeiss</td>
			<td style="width:104px;">490035</td>
			<td style="width:200px;">Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Cool Cube 1 CCD camera</td>
			<td style="width:119px;">Metasystems</td>
			<td style="width:104px;">H-0310-010-MS</td>
			<td style="width:200px;">Camera system for digital recording</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Isis software</td>
			<td style="width:119px;">Metasystems</td>
			<td style="width:104px;">Not applicable</td>
			<td style="width:200px;">Microscope software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence microscopy of &#947;h2ax and 53bp1 for analyzing the formation and repair of dna double-strand breaks

מעברי כפול-גדיל ה-DNA (DSB) הם נגעים DNA רציני. ניתוח היווצרות ותיקון של DSB רלוונטי, בקשת רחבה של תחומי מחקר כולל גנום שלמות, genotoxicity, קרינה ביולוגיה, הזדקנות, סרטן של פיתוח תרופות. בתגובה DSB, היסטון H2AX הוא phosphorylated-סרין 139 באזור של כמה זוגות megabase ויוצרים foci גרעיני דיסקרטית לזיהוי על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence. בנוסף, 53BP1 (איגוד p53 חלבון 1) הוא עוד חלבון מגיב DSB חשוב בקידום תיקון של DSB ומצטרף nonhomologous סוף-תוך מניעת רקומבינציה הומולוגית. על פי הפונקציות ספציפית של γH2AX, 53BP1, ניתוח משולב של γH2AX ו- 53BP1 על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence עשוי להיות גישה סבירה עבור ניתוח מפורט של DSB. כתב יד זה מספק פרוטוקול מפורטות בתוספת הערות שיטתי על ביצוע הטכניקה. באופן ספציפי, ההשפעה של מחזור התא על דפוסי מוקדים γH2AX הוא הפגינו fibroblasts נורמלי של הקו תא NHDF. יתר על כן, הערך של מוקדים γH2AX כמו סמן מתואר רנטגן מוקרן לימפוציטים של אדם בריא. לבסוף, אי-יציבות גנטית ייחקר בתאים CD34 + של מטופל עם לוקמיה מיאלואידית חריפה על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ושל 53BP1.

ניתוח של מוקדים γH2AX בתאים הוא המדויק ביותר בין שלב G0/G1 לשלב G2 כאשר מוקדים γH2AX מופיעים כנקודות פלורסנט ברורים (איור 5A). לעומת זאת, ניתוח של מוקדים γH2AX בתאים במהלך שלב S הינו מסובך γH2AX פאן-גרעיני התפזרו ספאקלס הנגרמת על ידי תהליך השכפול (איור 5B)...

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Microscopy of ÃŽÂ³H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks at JoVE.com

Immunofluorescence Microscopy of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

כתב יד זה מספק פרוטוקול לניתוח של מעברי כפול-גדיל ה-DNA על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ושל 53BP1.

מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ו 53BP1 לניתוח את היווצרות והתיקון של מעברי כפול-גדיל ה-DNA

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

היישום של לייזר מיקרו-הקרנה בחינת יחיד ותיקון כפול Strand Break בתאים בתרבית

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

איפיון תאים סרטניים באמצעות חוט רפואי עבור לכידת מחזורי תאים סרטניים: בגישה 3D בהתבסס על Immunofluorescence ודגים דנ א

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

אפיון תהליכי תיקון DNA-ארעי ומעברי DNA ארוך כפול-strand על ידי מיקרוסקופ Immunofluorescence

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

איתור וניטור של DNA הקשורים במחזור הגידול ב ביולואידים חולה

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

ניתוח גידול ורקמות התפלגות של נוגדן טיפולי ספציפי אנטיגן היעד

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunofluorescence הדמיה של נזק לדנ א ותיקון Foci בתאי סרטן המעי הגס האנושי

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

איתור דנ"א ללא תאים בדגימות פלזמה בדם של חולי סרטן

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Monitoring Breast Cancer Growth and Metastatic Colony Formation in Mice using Bioluminescence

ניטור צמיחת סרטן השד והיווצרות מושבה גרורתית בעכברים באמצעות Bioluminescence

Breast cancer is a frequent heterogeneous malignancy and the second leading cause of mortality in women, mainly due to distant organ metastasis. Several ...

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

הדמיה של חלבונים לתיקון נזקי DNA באורגנואידים של סרטן השחלות שמקורם במטופל באמצעות בדיקות אימונופלואורסנציה

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

Multiplex Immunofluorescence and Spatial Image Analysis of the Tumor Microenvironment

Multiplex Immunofluorescence Combined with Spatial Image Analysis for the Clinical and Biological Assessment of the Tumor Microenvironment

Multiplex Immunofluorescence Combined with Spatial Image Analysis for the Clinical and Biological Assessment of the Tumor Microenvironment (Video) | JoVE 

מולטיפלקס אימונופלואורסנציה בשילוב עם ניתוח תמונה מרחבית להערכה קלינית וביולוגית של מיקרו-סביבה של הגידול

The tumor microenvironment (TME) is composed of a plethora of different cell types, such as cytotoxic immune cells and immunomodulatory cells. Depending ...