Name: immunofluorescence microscopy of &#947;h2ax and 53bp1 for analyzing the formation and repair of dna double-strand breaks
Uploaded: 2017-11-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Microscopy of ÃŽÂ³H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks at JoVE.com

O projeto foi apoiado pela Fundação de leucemia do alemão José Carreras (14 DJCLS R/2017).

todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê ética II de a Mannheim faculdade médica da Universidade de Heidelberg. Escrito foi obtido o consentimento de todos os indivíduos.
 1. preparação de materiais <ol><li>solução anticoagulante: preparar uma solução anticoagulante de 200 heparina UI / mL de cloreto de sódio 0,9%. Encha cada um dos tubos de coleta (desenhar volume 9 mL) com 2 mL da solução anticoagulante antes da retirada das amostras de sa...

<ol>
	<li>Hoeijmakers, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+maintenance+mechanisms+for+preventing+cancer.">Genome maintenance mechanisms for preventing cancer.</a> Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).</li><li>Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instability+and+decay+of+the+primary+structure+of+DNA.">Instability and decay of the primary structure of DNA.</a> Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).</li><li>Zeman, M. K., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+replication+stress.">Causes and consequences of replication stress.</a> Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).</li><li>. Biological effects of low doses of ionizing radiation: A fuller picture Available from: <a target="_blank" href="https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf">https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf</a> (1994)</li><li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+DNA+double-strand+breaks:+production,+fidelity+of+repair,+and+induction+of+cancer.">Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12871-12876 (2003).</li><li>Simsek, D., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+end-joining+is+suppressed+by+the+canonical+NHEJ+component+Xrcc4-ligase+IV+during+chromosomal+translocation+formation.">Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation.</a> Nat Struct Mol Biol. 17 (4), 410-416 (2010).</li><li>Weinstock, D. M., Brunet, E., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+NHEJ-derived+reciprocal+chromosomal+translocations+does+not+require+Ku70.">Formation of NHEJ-derived reciprocal chromosomal translocations does not require Ku70.</a> Nat Cell Biol. 9 (8), 978-981 (2007).</li><li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139.">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li><li>Scully, R., Xie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+strand+break+repair+functions+of+histone+H2AX.">Double strand break repair functions of histone H2AX.</a> Mutat Res. 750 (1-2), 5-14 (2013).</li><li>Walters, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+ongoing+DNA+damage+in+multiple+myeloma+cells+as+revealed+by+constitutive+phosphorylation+of+H2AX.">Evidence for ongoing DNA damage in multiple myeloma cells as revealed by constitutive phosphorylation of H2AX.</a> Leukemia. 25 (8), 1344-1353 (2011).</li><li>Yu, T., MacPhail, S. H., Banath, J. P., Klokov, D., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+expression+of+phosphorylated+histone+H2AX+in+tumors+in+relation+to+DNA+double-strand+breaks+and+genomic+instability.">Endogenous expression of phosphorylated histone H2AX in tumors in relation to DNA double-strand breaks and genomic instability.</a> DNA Repair (Amst). 5 (8), 935-946 (2006).</li><li>Sedelnikova, O. A., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GammaH2AX+in+cancer+cells:+a+potential+biomarker+for+cancer+diagnostics,+prediction+and+recurrence.">GammaH2AX in cancer cells: a potential biomarker for cancer diagnostics, prediction and recurrence.</a> Cell Cycle. 5 (24), 2909-2913 (2006).</li><li>Chen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAK2V617F+promotes+replication+fork+stalling+with+disease-restricted+impairment+of+the+intra-S+checkpoint+response.">JAK2V617F promotes replication fork stalling with disease-restricted impairment of the intra-S checkpoint response.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15190-15195 (2014).</li><li>Popp, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+of+DNA+damage+and+alteration+of+the+DNA+damage+response+in+myelodysplastic+syndromes+and+acute+myeloid+leukemias.">Increase of DNA damage and alteration of the DNA damage response in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias.</a> Leuk Res. 57, 112-118 (2017).</li><li>Panier, S., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+break+repair:+53BP1+comes+into+focus.">Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (1), 7-18 (2014).</li><li>Escribano-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+cycle-dependent+regulatory+circuit+composed+of+53BP1-RIF1+and+BRCA1-CtIP+controls+DNA+repair+pathway+choice.">A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice.</a> Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).</li><li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+White+Blood+Cells.">Separation of White Blood Cells.</a> Nature. 204, 793-794 (1964).</li><li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood.+Isolation+of+monuclear+cells+by+one+centrifugation,+and+of+granulocytes+by+combining+centrifugation+and+sedimentation+at+1+g.">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g.</a> Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).</li><li>Bain, B., Pshyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+reactivity+in+mixed+leukocyte+cultures+after+separation+of+mononuclear+cells+on+Ficoll-Hypaque.">Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque.</a> Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).</li><li>Popp, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+DNA+damage+after+reduced+and+conventional+absorbed+radiation+doses+using+3rd+generation+dual-source+CT+technology.">Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology.</a> Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).</li><li>Rothkamm, K., Balroop, S., Shekhdar, J., Fernie, P., Goh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+DNA+damage+after+multi-detector+row+CT:+a+quantitative+biomarker+of+low-level+radiation+exposure.">Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure.</a> Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).</li><li>Lobrich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+formation+and+repair+of+DNA+double-strand+breaks+after+computed+tomography+examinations.">In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (25), 8984-8989 (2005).</li><li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fixatives+for+immunostaining.">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods Mol Biol. 588, 55-61 (2010).</li><li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+cell+membranes.">Permeabilization of cell membranes.</a> Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).</li><li>Rothkamm, K., Lobrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+lack+of+DNA+double-strand+break+repair+in+human+cells+exposed+to+very+low+x-ray+doses.">Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5057-5062 (2003).</li></ol>

Microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1 é um método útil para analisar a formação e reparação de ORL em um amplo espectro de domínios de investigação. Parâmetros críticos que influenciam o resultado dos experimentos são a fase do ciclo celular, os agentes utilizados para a fixação e permeabilização das células, a escolha dos anticorpos e o hardware e software, o microscópio de fluorescência.
A influência do ciclo celular em padrões de focos γH2AX foi demonst...

O DNA é danificado continuamente por endógenos (por exemplo, estresse de replicação, espécies reativas de oxigênio, instabilidade intrínseca do DNA) e exógenos (por exemplo, os radicais químicos, irradiação) fontes (Figura 1)1,2 ,3,4. Entre os danos do DNA, DNA dupla quebras (DSB) são particularmente graves lesões e podem induzir a morte celular ou carcinogênese. Cerca de 50 DSB pode surgir por célula e ciclo celular5. Em células de mamíferos, recombinação homóloga (HR) e não-homólogos final-adesão (NHEJ) desenvolveram-se como principais vias para a reparação de ORL (Figura 2). RH ocorre no final da fase S/G2 e usa uma irmã intacta cromátides irmãs como um modelo para reparação potencialmente livre de erros. Em comparação, NHEJ é ativo ao longo do ciclo celular e potencialmente mutagénicas como pares de base pode ser adicionados ou ressecados antes da ligadura das extremidades quebradas. Além disso, final alternativo-adesão pode ser contratado como um mecanismo lento mutagénicas backup reparação em caso de deficiência NHEJ6,7.
DSB induzir a fosforilação da histona H2AX em serina 139 em uma região de vários pares de megabase ao redor de cada DSB. Os focos de formação nucleares são denominados focos de γH2AX e são detectáveis por microscopia de imunofluorescência8. ΓH2AX promove o recrutamento de mais proteínas DSB-responsiva e está envolvido na cromatina remodelação, reparação de DNA e de transdução de sinal9. Como cada foco de γH2AX é considerado para representar um único DSB, a quantificação do DSB por microscopia de imunofluorescência é possível, que tem sido demonstrada em linhas de células de câncer e espécimes paciente10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (p53 binding protein 1) é outra proteína-chave na mediação reparação de ORL. Está envolvido no recrutamento de DSB-responsivo proteínas, sinalização de ponto de verificação e a sinapse de ORL termina15. Além disso, 53BP1 desempenha um papel crítico na escolha de caminho de reparação de ORL. Ele aciona a reparação de ORL para NHEJ enquanto HR é impedido de16. Considerando as funções genuínas de γH2AX e 53BP1 no reparo DSB, a análise simultânea de γH2AX e 53BP1 por microscopia de imunofluorescência pode ser um método útil para a análise precisa da formação e reparação de ORL.
Este manuscrito fornece um protocolo passo a passo para a realização de microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1 no núcleo de células. Especificamente, a técnica é aplicada em fibroblastos normais da linha celular NHDF, em linfócitos de raio-x irradiado de um indivíduo saudável e em células CD34 + de um paciente com leucemia mieloide aguda. Os detalhes do método são apontados no contexto dos resultados apresentados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="630">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">RPMI medium</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">R0883</td>
			<td style="width:200px;">Medium for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:119px;">ratiopharm</td>
			<td style="width:104px;">PZN 3029843</td>
			<td style="width:200px;">&#160;Heparin 5,000 I.U. / mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sodium chloride solution 0.9%</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td style="width:104px;">PZN 1957154</td>
			<td style="width:200px;">Component of the anticoagulant stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Ficoll-Paque Premium</td>
			<td style="width:119px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:104px;">17-5442-02</td>
			<td style="width:200px;">Medium for isolation of mononuclear cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Trypsin solution 10X</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">59427C</td>
			<td style="width:200px;">Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">CD34 MicroBead Kit</td>
			<td style="width:119px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:104px;">130-046-702</td>
			<td style="width:200px;">Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Diagnostic microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER-203B-CE24</td>
			<td style="width:200px;">Microscope slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Megafuge 1.0 R</td>
			<td style="width:119px;">Heraeus</td>
			<td style="width:104px;">75003060</td>
			<td style="width:200px;">&#160;Tabletop centrifuge&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cytospin device</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Lid</td>
			<td style="width:119px;">Heraeus</td>
			<td>76003422</td>
			<td style="width:200px;">Lid for working without micro-tubes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Cyto container</td>
			<td style="width:119px;">Heraeus</td>
			<td style="width:104px;">75003416</td>
			<td style="width:200px;">Cyto container with 2 conical bores</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Clip carrier</td>
			<td style="width:119px;">Heraeus</td>
			<td style="width:104px;">75003414</td>
			<td style="width:200px;">Carrier for holding a cyto container and a slide</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Support insert</td>
			<td style="width:119px;">Heraeus</td>
			<td style="width:104px;">75003417</td>
			<td style="width:200px;">Support insert for holding a clip carrier</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Triton X-100 (Octoxinol 9)</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;">85112</td>
			<td style="width:200px;">Detergent for permeabilization of cell membranes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Potassium hydroxide solution 1M</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:104px;">109107</td>
			<td style="width:200px;">Necessary for preparing the paraformaldehyde solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">P6148</td>
			<td style="width:200px;">Fixation agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">D8537</td>
			<td style="width:200px;">Balanced salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Chemiblocker</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:104px;">2170</td>
			<td style="width:200px;">Blocking agent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Mouse monoclonal anti-&#947;H2AX antibody (JBW301)</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:104px;">05-636</td>
			<td style="width:200px;">Primary antibody for detection of &#947;H2AX</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304)</td>
			<td style="width:119px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:104px;">NB100-304</td>
			<td style="width:200px;">Primary antibody for detection of 53BP1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:119px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;">A-11001</td>
			<td style="width:200px;">Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Alexa Fluor 555-conjugated goat anti-rabbit antibody</td>
			<td style="width:119px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;">A-21428</td>
			<td style="width:200px;">Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Vectashield mounting medium</td>
			<td style="width:119px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:104px;">H-1200</td>
			<td style="width:200px;">Contains DAPI for staining of DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Axio Scope.A1</td>
			<td style="width:119px;">Zeiss</td>
			<td style="width:104px;">490035</td>
			<td style="width:200px;">Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Cool Cube 1 CCD camera</td>
			<td style="width:119px;">Metasystems</td>
			<td style="width:104px;">H-0310-010-MS</td>
			<td style="width:200px;">Camera system for digital recording</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Isis software</td>
			<td style="width:119px;">Metasystems</td>
			<td style="width:104px;">Not applicable</td>
			<td style="width:200px;">Microscope software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence microscopy of &#947;h2ax and 53bp1 for analyzing the formation and repair of dna double-strand breaks

Quebras de DNA dobro-Costa (DSB) são graves lesões do ADN. Análise da formação e reparação do DSB é relevante em um amplo espectro de domínios de investigação, incluindo a integridade do genoma, genotoxicidade, biologia da radiação, envelhecimento, câncer e desenvolvimento de drogas. Em resposta ao ORL, o histona H2AX é fosforilado em serina 139 em uma região de vários pares de megabase formando discretos focos nucleares detectáveis pela microscopia de imunofluorescência. Além disso, 53BP1 (p53 binding protein 1) é outra importante proteína DSB-responsivo promover a reparação de DSB, juntando-se não-homólogos final-evitando a recombinação homóloga. De acordo com as funções específicas de γH2AX e 53BP1, a análise combinada de γH2AX e 53BP1 por microscopia de imunofluorescência pode ser uma abordagem razoável para uma análise detalhada de ORL. Este manuscrito fornece um protocolo passo a passo, complementado com notas metódicas para executar a técnica. Especificamente, a influência do ciclo celular em padrões de focos γH2AX é demonstrada em fibroblastos normais da linha celular NHDF. Além disso, o valor dos focos de γH2AX como um biomarcador é retratado em linfócitos de raio-x irradiado de um indivíduo saudável. Finalmente, a instabilidade genética é investigada em células CD34 + de um paciente com leucemia mieloide aguda por microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1.

Análise dos focos de γH2AX nas células é mais preciso na fase G0/G1 e a G2 fase quando γH2AX focos aparecem como distintos pontos fluorescentes (Figura 5A). Em contraste, análise dos focos de γH2AX nas células durante a fase S é complicado por manchas dispersas γH2AX pan-nuclear causadas pelo processo de replicação (Figura 5B).
Fixação das células foi rea...

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Immunofluorescence Microscopy of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

Este manuscrito fornece um protocolo de análise de quebras de DNA dobro-costa pela microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1.

Microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1 para analisar a formação e reparação do DNA Double-strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Aplicação de Laser Microirradiação para exame de Single e Double Strand reparação em células de mamíferos

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

Pesquisa do câncer

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Caracterização de células tumorais, usando um fio de médico para a captura de células tumorais de circulação: uma abordagem 3D baseado no DNA peixe e imunofluorescência

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

Caracterizando os processos de reparação do DNA no transitório e duradouro dobro-Costa quebras de DNA pela microscopia de imunofluorescência

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Deteção e monitoração do ADN de circulação associado do tumor em Biofluids pacientes

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Analisando tumor e distribuição de tecidos de anticorpo terapêutico específico de antígeno alvo

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Imagens de imunofluorescência de dna dano e reparo de focos em células cancerígenas de cólon humano

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Detecção de DNA livre de células em amostras de plasma de sangue de pacientes com câncer

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Monitoring Breast Cancer Growth and Metastatic Colony Formation in Mice using Bioluminescence

Monitoramento do crescimento do câncer de mama e formação de colônia metastática em camundongos usando bioluminescência

Breast cancer is a frequent heterogeneous malignancy and the second leading cause of mortality in women, mainly due to distant organ metastasis. Several ...

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizando proteínas de reparo de danos ao DNA em organoides de câncer de ovário derivados do paciente por meio de ensaios de imunofluorescência

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

Multiplex Immunofluorescence and Spatial Image Analysis of the Tumor Microenvironment

Multiplex Immunofluorescence Combined with Spatial Image Analysis for the Clinical and Biological Assessment of the Tumor Microenvironment

Multiplex Immunofluorescence Combined with Spatial Image Analysis for the Clinical and Biological Assessment of the Tumor Microenvironment (Video) | JoVE 

Imunofluorescência Multiplex Combinada com Análise Espacial de Imagens para Avaliação Clínica e Biológica do Microambiente Tumoral

The tumor microenvironment (TME) is composed of a plethora of different cell types, such as cytotoxic immune cells and immunomodulatory cells. Depending ...