Name: fabrication of custom agarose wells for cell seeding and tissue ring self-assembly using 3d-printed molds
Uploaded: 2018-04-02T12:30:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds at JoVE.com

Vi anerkender taknemmeligt Dr. Erica Stults (akademisk forskning & ansøgning videnskabsmand, WPI informationsteknologi) for hendes hjælp med 3D printing, Amanda Zoë Reidinger, Ph.D., Chris Nycz og Karen Levi, M.E., for deres bidrag til skimmel design, Kathy Suqui og Jennifer Mann for deres bistand, test skimmel design, og Michael O'Keefe for hans hjælp med optagelserne.  Dette arbejde blev støttet af NSF IGERT DGE 1144804 (MWR, HAS), NIH R15 HL097332 (MWR, TAH), NSF REU EEC0754996 (BA), NIH 1R01 EB023907 (MWR, har) og NIH R15 HL137197 (MWR, har).
<div></div>

1. forberede 3D-trykt skimmel
<ol><li>Forberede en CAD-tegning af mug i de ønskede dimensioner.</li>
	<li>Send CAD-filen til en høj opløsning 3D printer. Vælg den passende plast trykning materiale, med blank finish.</li>
	<li>Efter udskrivning, grundigt vaske formen med rengøringsmiddel og vand.</li>
</ol>2. støbning PDMS negativer
<ol><li>Måle den ønskede mængde af PDMS base på en balance. For en mold med en 60 mm diameter og 2 mm indlæg godt, skal du bruge 25 g.</li>
	<li>Tilføje hærder på en 1:10 (w/w) forholdet til PDMS base.</li>
	<li>Rør kraftigt indtil de to komponenter er grundigt kombineret. Utilstrækkelige blanding kan resultere i ufuldstændig hærdning af PDMS, hvilket resulterer i en "klistret" overflade.</li>
	<li>Placer et stykke laboratorium tape omkring grænsen af 3D-trykt forme, hen til muliggøre dannelsen af en PDMS base lag over trykte brøndene.</li>
	<li>Hæld PDMS blandingen i formen og placerer formen i en vakuumkammer til nedtrapning gas indtil alle bobler er frigivet.</li>
	<li>Helbrede PDMS ved 50 ° C i 2-4 timer, eller indtil størknede nok til at fjerne.</li>
	<li>Fjern lab tape og omhyggeligt uddrag PDMS negativ.</li>
	<li>Inkuber PDMS ved 60 ° C i en yderligere 1 h (efter fjernelse fra formen 3D-trykt) for at sikre, at mug er fuldt hærdet.</li>
	<li>Vask PDMS grundigt med rengøringsmiddel og vand for at fjerne eventuelle rester. Utilstrækkelig vask kan resultere i dårlig ring dannelse for de første anvendelser af PDMS negative.</li>
</ol>3. opdigte Agarosen brønde
<ol><li>Forberede Agarosen wells 1 dag før såning celler.</li>
	<li>Gøre en 2% (w/v) Agarosen løsning i DMEM og autoklave.</li>
	<li>Med pipette overfoeres 4 mL smeltet Agarosen i en autoklaveres PDMS negative. Derefter negativer afpipetteres Agarosen direkte ind i stillinger som PDMS. Fjern eventuelle luftbobler med en pipette spids, som bobler kan forårsage inhomogeneities i godt dimensioner.</li>
	<li>Bemærk: Fyld ikke for meget forme; oversiden af Agarosen skal være flad, så Agarosen brønde bliver niveau efter fjernelse fra PDMS og placering i 6-og kultur plader. Sidesten Agarosen kan være re-autoklaveres og brugt igen, men ikke mere end én gang.</li>
	<li>Efter Agarosen køler (ca 10 min for 4 mL Agarosen; større forme muligvis længere afkøling gange), omhyggeligt adskille Agarosen wells fra PDMS negativer ved hjælp af stump pincet og overføre til et godt af en 6-godt plade.</li>
	<li>Dykke Agarosen brøndene komplet dyrkningsmedium, og Blandingen henstår natten over i et 37 ° C inkubator før brug.</li>
</ol>4. såning væv ringe
<ol><li>Kultur rotte aorta glat muskel celler21 (RaSMCs) i DMEM med 10% føtal bovin serum (FBS), 1% L-glutamin, 1% ikke-essentielle aminosyrer, 1% natrium pyruvat og 1% penicillin-streptomycin indtil de når 70% sammenløb. Bemærk: Celler bør være kulturperler på 5% CO2 og 37 ° C i 15 cm vævskultur plader.</li>
	<li>Efter at forme er ekvilibreres (afsnit 3), forberede RaSMCs for såning.</li>
	<li>Skyl plader to gange med 5 mL pr. plade af fosfatbufferet saltopløsning (PBS).</li>
	<li>Tilføj 3 mL 0,25% trypsin pr. 15 cm petriskål. Flytte pladerne til 37 ° C inkubator for 2-3 min, eller indtil cellerne har løftet ud på pladen.</li>
	<li>Neutralisere trypsin med en tilsvarende mængde (3 mL pr. plade) komplet næringssubstratet. Resuspend celler grundigt at bryde op klumper.</li>
	<li>Fortynde en alikvot af cellesuspension 1:1 med trypan blå farvestof, og tælle cellerne med en hemocytometer.</li>
	<li>Der centrifugeres den samlede mængde af cellesuspension i 5 min på 200 x g at sammenpresse cellerne.</li>
	<li>Resuspend celler i en koncentration på 10 millioner celler pr. mL; Dette vil resultere i 500.000 celler pr. 50 µL. Bemærk: Forskellige celletyper kan kræve forskellige celle koncentrationer.</li>
	<li>Opsug alle medium fra formen agarosegelelektroforese. Være omhyggelig med at fjerne alle medium fra individuelle brønde, men at ikke punktere bunden af brøndene.</li>
	<li>Med pipette overfoeres 50 µL af suspension i hver brønd.</li>
	<li>Omhyggeligt tilsættes 2 mL frisk medium omkring ydersiden af formen agarosegelelektroforese. Pas på ikke at lade medium overløb i wells af agarosegelelektroforese. Placer plader i rugemaskinen natten over (ca. 16 h).</li>
	<li>Efter natten inkubation, Aspirér medium fra uden for forme og føje 4,5 mL frisk medium til hver brønd af 6-godt plade, så forme og ringe er helt nedsænket. Ændre medium dagligt.</li>
</ol>

<ol>
	<li>L'Heureux, N., Paquet, S., Labbe, R., Germain, L., Auger, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+completely+biological+tissue-engineered+human+blood+vessel.">A completely biological tissue-engineered human blood vessel.</a> FASEB J. 12 (1), 47-56 (1998).</li><li>Adebayo, O., Hookway, T. A., Hu, J. Z., Billiar, K. L., Rolle, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+smooth+muscle+cell+tissue+rings+exhibit+greater+tensile+strength+than+cell-seeded+fibrin+or+collagen+gel+rings.">Self-assembled smooth muscle cell tissue rings exhibit greater tensile strength than cell-seeded fibrin or collagen gel rings.</a> J Biomed Mater Res A. 101 (2), 428-437 (2013).</li><li>Hayashi, K., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+stem+cell+aggregates+with+gelatin+microspheres+to+enhance+biological+functions.">Preparation of stem cell aggregates with gelatin microspheres to enhance biological functions.</a> Acta Biomater. 7 (7), 2797-2803 (2011).</li><li>Kelm, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+concept+for+scaffold-free+vessel+tissue+engineering:+self-assembly+of+microtissue+building+blocks.">A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks.</a> J Biotechnol. 148 (1), 46-55 (2010).</li><li>McAllister, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+haemodialysis+access+with+an+autologous+tissue-engineered+vascular+graft:+a+multicentre+cohort+study.">Effectiveness of haemodialysis access with an autologous tissue-engineered vascular graft: a multicentre cohort study.</a> Lancet. 373, 1440-1446 (2009).</li><li>Svoronos, A. A., Tejavibulya, N., Schell, J. Y., Shenoy, V. B., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-mold+design+controls+the+3D+morphological+evolution+of+self-assembling+multicellular+microtissues.">Micro-mold design controls the 3D morphological evolution of self-assembling multicellular microtissues.</a> Tissue Eng Part A. 20 (7-8), 1134-1144 (2014).</li><li>Gwyther, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+vascular+tissue+fabricated+from+aggregated+smooth+muscle+cells.">Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells.</a> Cells Tissues Organs. 194 (1), 13-24 (2011).</li><li>Mehesz, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+robotic+biofabrication+of+tissue+spheroids.">Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids.</a> Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).</li><li>Laterreur, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+direct+burst+pressure+and+the+ring+tensile+test+methods+for+mechanical+characterization+of+tissue-engineered+vascular+substitutes.">Comparison of the direct burst pressure and the ring tensile test methods for mechanical characterization of tissue-engineered vascular substitutes.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 34, 253-263 (2014).</li><li>L'Heureux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tissue-engineered+blood+vessels+for+adult+arterial+revascularization.">Human tissue-engineered blood vessels for adult arterial revascularization.</a> Nat Med. 12 (3), 361-365 (2006).</li><li>Dash, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Engineered+Vascular+Rings+from+Human+iPSC-Derived+Smooth+Muscle+Cells.">Tissue-Engineered Vascular Rings from Human iPSC-Derived Smooth Muscle Cells.</a> Stem Cell Reports. 7 (1), 19-28 (2016).</li><li>Heureux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+tissue-engineered+vascular+media:+a+new+model+for+pharmacological+studies+of+contractile+responses.">A human tissue-engineered vascular media: a new model for pharmacological studies of contractile responses.</a> FASEB J. 15, 515-524 (2001).</li><li>Dikina, A. D., Strobel, H. A., Lai, B. P., Rolle, M. W., Alsberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+cartilaginous+tubes+for+tracheal+tissue+replacement+via+self-assembly+and+fusion+of+human+mesenchymal+stem+cell+constructs.">Engineered cartilaginous tubes for tracheal tissue replacement via self-assembly and fusion of human mesenchymal stem cell constructs.</a> Biomaterials. 52, 452-462 (2015).</li><li>Twal, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellularized+microcarriers+as+adhesive+building+blocks+for+fabrication+of+tubular+tissue+constructs.">Cellularized microcarriers as adhesive building blocks for fabrication of tubular tissue constructs.</a> Ann Biomed Eng. 42 (7), 1470-1481 (2014).</li><li>Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+vascular+tissue+engineering+using+bioprinting.">Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting.</a> Biomaterials. 30 (30), 5910-5917 (2009).</li><li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+facilitated+scaffold-free+tissue+unit+fabrication.">3D printing facilitated scaffold-free tissue unit fabrication.</a> Biofabrication. 6 (2), 1-11 (2014).</li><li>Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rods,+tori,+and+honeycombs:+the+directed+self-assembly+of+microtissues+with+prescribed+microscale+geometries.">Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries.</a> The FASEB Journal. 21 (14), 4005-4012 (2007).</li><li>Gwyther, T. A., Hu, J. Z., Billiar, K. L., Rolle, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cellular+self-assembly+to+fabricate+cell-derived+tissue+rings+for+biomechanical+analysis+and+tissue+engineering.">Directed cellular self-assembly to fabricate cell-derived tissue rings for biomechanical analysis and tissue engineering.</a> J Vis Exp. (57), e3366 (2011).</li><li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+functional+biomaterials+for+tissue+engineering.">3D printing of functional biomaterials for tissue engineering.</a> Curr Opin Biotechnol. 40, 103-112 (2016).</li><li>Jakab, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+by+self-assembly+and+bio-printing+of+living+cells.">Tissue engineering by self-assembly and bio-printing of living cells.</a> Biofabrication. 2 (2), 022001 (2010).</li><li>Lemire, J. M., Potter-Perigo, S., Hall, K. L., Wight, T. N., Schwartz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Rat+Aortic+Smooth+Muscle+Cells+Differ+in+Versican/PG-M+Expression.">Distinct Rat Aortic Smooth Muscle Cells Differ in Versican/PG-M Expression.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 16 (6), 821-829 (1996).</li><li>Strobel, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+self-assembly+with+microsphere+incorporation+for+growth+factor+delivery+within+engineered+vascular+tissue+rings.">Cellular self-assembly with microsphere incorporation for growth factor delivery within engineered vascular tissue rings.</a> Tissue Eng Part A. 23 (3-4), 143-155 (2017).</li><li>Strobel, H. A., Calamari, E. L., Beliveau, A., Jain, A., Rolle, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+characterization+of+electrospun+polycaprolactone+and+gelatin+composite+cuffs+for+tissue+engineered+blood+vessels.">Fabrication and characterization of electrospun polycaprolactone and gelatin composite cuffs for tissue engineered blood vessels.</a> JBMR Part B. , (2017).</li><li>Napolitano, A. P., Chai, P., Dean, D. M., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+self-assembly+of+complex+cellular+aggregates+on+micromolded+nonadhesive+hydrogels.">Dynamics of the self-assembly of complex cellular aggregates on micromolded nonadhesive hydrogels.</a> Tissue Eng. 13 (8), 2087-2094 (2007).</li><li>Gwyther, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Engineered Vascular Tissue Generated by Cellular Self-Assembly. , (2012).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Her har vi præsenteret en alsidig metode til hurtig fremstilling af selvsamlede væv ringe med let tilpassede dimensioner ved hjælp af 3D-printning. Vores metode er den samme som rapporteret i Svoronos mfl. 6 , hvor 3D-trykt honeycomb og hund-ben formet voks forme blev brugt til at kaste PDMS negativer. Dog er formene blevet ændret til at indeholde flere unikke designfunktioner. Et hak (figur 4A(1)) giver orientering af formen til at tillade hver ring skal være mærket og overvåges individuelt. Den centrale hul (figur 4A(2)) hjælper med at forbedre udbredelsen af medium i brøndene. CAD-filen numre udskrives direkte på formen; Derfor, PDMS negativer er hver mærket med versionsnummer og bogføre diameter (figur 4A3). De koniske ydervægge (figur 3(1), 5 °), på toppen af godt trug (figur 3(2), 45 °), og centrale hul (figur 3(3), 5 °) gør det lettere at fjerne PDMS negativer fra 3D-trykt forme , og Agarosen brønde er lettere at fjerne fra PDMS negativer (figur 4A(2), A(4)).
Vi har vist alsidigheden af dette system ved opdigte selvsamlede ring-formet væv i forskellige diametre og celletyper, herunder primære menneskelige glat muskel celler (SMCs)18,22, rotte aorta SMCs7 , 23, humane mesenkymale stamceller (hMSCs)13og SMCs udvundet af induceret pluripotente stamceller (iPSCs)11 (tabel 1). I igangværende arbejde, er vi evaluere dannelsen af ringe fra yderligere celletyper såsom endotelceller, og fusing brusk ringe af varierende størrelser for potentielle anvendelser i luftrør udskiftning. Ud over helt celle-afledte konstruktioner, har vi også brugt dette system til at fabrikere ringe med indbygget krydsbundet gelatine mikrokugler13,22. Mikrokugler kan indarbejdes i væv ringe under samlesæt for at give ekstra mekanisk styrke, eller for lokaliseret levering af vækstfaktorer13,22.
Når opdigte væv ringe, kan optimering af celle nummer være påkrævet for forskellige celletyper. Minimum celle numre kan variere baseret på størrelse og type af celler. For eksempel, hSMCs stammer fra iPSCs udsås på 600.000 celler/ring11, hMSCs og primære hSMCs udsås på 400.000 celler/ring13,22, og rotte aorta SMCs udsås på 500.000 celler/ring18. Lavpunktet dimensioner kan også påvirke ring dannelse og det mindste antal celler kræves for ring dannelse24. For undersøgelser med humane celler og 3D-trykt forme, blev trug bredde 2 mm brugt. De oprindelige polycarbonat forme havde lavpunktet bredde 3.75 mm, som kræves 750.000 hSMCs til at danne en 2 mm celle ring18. Med reduceret lavpunktet bredde var vi i stand til at reducere antallet af celler, der er nødvendige for ring dannelsen af 46%, at 400.000 celler pr. ring25. Mængder af celler seedede per ring er sammenfattet i tabel 1.
Når du vælger et 3D-trykt materiale, skal mange faktorer tages i betragtning. Fordi PDMS er typisk helbredt ved 60 ° C, 3D-trykt materiale skal have en høj nok smelte temperatur for at undgå skader ved PDMS hærdning. Smeltepunktet af det materiale, der anvendes i denne undersøgelse (et proprietært materiale, se Tabel af materialer) er ikke tilgængelig. Men når bagt på 60 ° C i 1 time, vi observeret, at materialet begyndte at producere en lugt. Dermed, vi besluttede at sænke den hærdning temperatur til 50 ° C og øge den hærdetid for at bage PDMS uden at beskadige den 3D-trykt materiale. Justeringer til at kurere tid kan være nødvendigt hvis forme er ændret til form større PDMS negativer. En ekstra hærdning periode på 60 ° C efter PDMS fjernelse fra 3D-trykt forme forhindrer, at den endelige PDMS negative resterende tacky, samtidig begrænse temperaturen den 3D-trykt mug er udsat for. Bemærk, at nogle materialer hæmme hærdning af PDMS, så sørg for at det valgte materiale er kompatibel med PDMS. Endelig, mold materiale toksicitet skal også overvejes. Mens den 3D-trykt mug ikke vil være i direkte kontakt med cellerne, er det muligt, at nogle rester fra formen kan overføres til PDMS negative under proceduren hærdning. Vi fandt, at meget grundig vask med vaskemiddel var tilstrækkelige til at fjerne eventuelle rester fra PDMS negative. Men vi tidligere observeret at utilstrækkelig vask førte til dårlig ring dannelsen i Agarosen brønde for første par anvendelser af PDMS negative. Brug af PDMS stemmer fra andre 3D-trykte materialer kan kræve yderligere undersøgelser for at kontrollere, at vaskemidlet er tilstrækkelige til at fjerne mug rester, herunder eventuelle potentielle leachates. Regelmæssig afprøvning kan også være nødvendigt, som det muligt, at gentagne varme cykler (selv til 50 ° C) kan beskadige mug over tid, og forårsage stigninger i rester efter gentagen brug. Til dato, har vi brugt en enkelt 3D-trykt skimmel til at producere mere end 30 PDMS negativer, der har været brugt med held generere væv ringe.
Samlede, 3D udskrivning giver større alsidighed til fabrikation af Agarosen forme end bearbejdning af polycarbonat. Det giver en højere opløsning end det er muligt med værktøj, og skimmel design er ikke begrænset af dimensioner af de tilgængelige værktøjer. Dette giver mulighed for større tilpasning, og tilføjelsen af funktioner såsom tilspidset, kan ikke være muligt med bearbejdning. Dette system kan anvendes til at opdigte selvsamlede væv i andre figurer samt, ud over ringe6,17. Ved hjælp af metoden ring fabrikation, har vi udviklet væv ringe fra en række forskellige celletyper og størrelser for potentielle anvendelser i trakeale væv engineering13, manipuleret blodkar7og modellering Vaskulære sygdomme11.

Cellulære samlesæt tilgange til at opdigte tissue Engineering blodkar er et alternativ til stillads-baserede tilgange. Selvsamlede, stillads-gratis væv kan have større celle tæthed, forbedret matrix deposition og styrke og forbedrede biologiske funktion i forhold til stillads-baserede væv1,2,3,4 . Imidlertid danner 3D væv uden brug af eksogene stillads støtte med særlige størrelser og former er fortsat en udfordring. Nogle metoder smelte sammen lag celle ark til at danne tykkere konstruktioner, selv om denne proces kan være tidskrævende og labor intensiv5. Alternativt, celler kan seeded i ikke-klæbende forme og tilladt at aggregat til spheroids, ringe og andre væv figurer6,7,8.
Selvsamlede væv ringe kræver færre celler, kortere kultur gange, og mindre reagenser end større rørformede manipuleret væv, men kan stadig være mekanisk testet, undersøgt Histologisk, eller anvendes til kontraktilitet og andre funktionelle test7 , 9 , 10 , 11. fordi de kan hurtigt fabrikeret og let testet, væv ringe er ideelle til screening stort antal kultur parametre, og har potentiale til brug som sygdom modeller11 eller værktøjer til stof screening12. Derudover ringe kan være smeltet ind i mere komplekse strukturer såsom blodkar eller luftrør7,13, og ringene kan sammensmelte mere helt end andre figurer såsom spheroids14,15.
Agarosen er almindeligt anvendt som en mold materiale for at fabrikere selvsamlede væv på grund af sin biokompatibilitet, permeabilitet og ikke-celle klæbende egenskaber. For eksempel, fabrikeret Norotte et al. Agarosen forme fra ekstruderet stænger, som aktiveret begrænset kontrol over skimmel form og kræves specialudstyr15. Tan et al. deponeret calciumalginat dråber som bygningsenheder for at fabrikere brugerdefinerede hydrogel forme i forskellige former (pyramide, square)16. Men den store diameter af natriumalginat spheroids (300 µm) resulterede i funktioner med lav opløsning. Sådan en lav opløsning kan resultere i ujævn skimmel overflader, der kan påvirke celle sammenlægning konsistens. Alternativt, Agarosen kan blive kastet i polymer negativer til at oprette ikke-klæbende forme med glat funktioner og specifikke dimensioner6,7,17.
Vi har tidligere rapporteret et system for at fabrikere brugerdefinerede ringformede Agarosen celle-seeding wells fra en PDMS negative stemmer i en sleben polycarbonat skimmel7,18. Agarosen blev hældt i PDMS negative og tilladt at sætte7,18. Celler blev derefter seedet til Agarosen brønde, hvor de samles til at danne selvstændige samlet, stillads-fri væv ringe i mindre end 24 h7,18. PDMS negativer er autoklaverbart, kan genbruges mange gange, og er blød og bøjelig, gør det let at fjerne de størknede Agarosen brønde. Da dette system blev oprindeligt rapporteret i Gwyther et al. 7, PDMS negativer blev kastet fra sleben polycarbonat forme (figur 1A). Efter Agarosen casting, var celle seeding brønde individuelt skåret ud og placeret i wells af en 12-godt plade7,18. Designet blev for nylig ændret således, at en enkelt Agarosen mug producerer 5 ringe og passer i et godt af en 6-godt plade, eliminerer behovet for at skære individuelle brønde og reducere mængden af PDMS og Agarosen kræves for at producere hver ring (figur 1B). En mindre celle såning lavpunktet bredde blev brugt til at reducere antallet af seedede celler skal opnå ring dannelse. Trods disse ændringer, opløsning og tilpasning af forme blev begrænset til rådighed standard pindfræser dimensioner og micromilling kan være uoverkommeligt dyre. Derudover computer numerisk kontrol (CNC) bearbejdning kan være tidskrævende og besværlig på grund af behovet for at reservere tid på udnyttet stærkt brugerdefinerede udstyr, ekstra computer aided manufacturing (CAM) software til at konvertere computerstøttet design ( CAD) fil til en programmerbar værktøj sti, og pålidelige fastspænding af polycarbonat del under bearbejdning.
I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi brugen af 3D udskrivning som et alternativ til CNC bearbejdning. 3D-printning er almindeligt anvendt til engineering brugerdefinerede implantater, opdigte stillads materialer, og til direkte udskrivning for celler og væv spheroids15,19,20. Vi brugte en høj opløsning 3D printer, og specialiserede 3D printing materiale, der gjorde det muligt at udskrive en stiv mug med en glat, blank overflade finish (Se Tabel af materialer). Vores teknik giver mulighed for fremstilling af meget tilpasselig, høj opløsning plast forme, der kan bruges til støbning PDMS negativer og Agarosen brønde. Design iterationer er sammenfattet i figur 1. Skimmel design blev yderligere ændret i 3D-trykt skimmel version til at omfatte koniske udvendige vægge og et center hul for at lette fjernelsen af begge PDMS negativer fra 3D-trykt forme og Agarosen brøndene fra PDMS negativer. Disse tilspidset funktioner kan ikke opnås med standard bearbejdningsprocesser. Afstanden fra bunden af brøndene til bunden af formen blev forøget i denne iteration, hvilket resulterer i en tykkere Agarosen base under indlæg til at reducere risikoen for stillinger bryde under Agarosen godt fjernelse. Mug og ring fabrikation proceduren er vist skematisk i figur 2.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>15-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroWhite</td>
			<td>StrataSys</td>
			<td>RGD835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>StrataSys</td>
			<td>Objet 260 Connex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>15-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16000069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-015-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-000-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-strep</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-900-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WKY 3M-22 rat aortic smooth muscle cells</td>
			<td>Provided by T. Wight [ref 21]</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of custom agarose wells for cell seeding and tissue ring self-assembly using 3d-printed molds

Manipuleret væv bliver brugt klinisk til væv reparation og udskiftning, og er ved at blive udviklet som redskaber for stof screening og menneskelig sygdom modellering. Selvsamlede væv tilbyde fordele i forhold til stillads-baserede tissue engineering, såsom forbedret matrix deposition, styrke og funktion. Men der er få tilgængelige metoder for at fabrikere 3D væv uden såning celler på eller inden for en støttende stillads. Tidligere, vi udviklet et system for at fabrikere selvsamlede væv ringe ved såning celler i ikke-klæbende Agarosen brønde. En Polydimethylsiloxan (PDMS) negative castet først i en bearbejdet polycarbonat skimmel, og derefter Agarosen var geléagtig i PDMS negative til at oprette ring-formet celle såning brønde. Dog blev alsidighed af denne tilgang begrænset af løsningen af de værktøjer til rådighed for bearbejdning polycarbonat skimmel. Vi viser her, at 3D-trykt plast kan bruges som et alternativ til bearbejdet polycarbonat til opdigte PDMS negativer. 3D-trykt mug og reviderede skimmel design er nemmere at bruge, billig at producere, og kræver markant mindre Agarosen og PDMS pr. celle såning godt. Vi har demonstreret, at de resulterende Agarosen brønde kan bruges til at oprette selvsamlede væv ringe med tilpassede diametre fra en række forskellige celletyper. Ringene kan derefter bruges, for mekanisk, funktionelle og histologiske analyse, eller for at fabrikere større og mere komplekse rørformede væv.

Dette system giver mulighed for enkel, tilpassede fabrikation af Agarosen celle såning brønde, der gør det muligt for celle samlesæt af ring-formet 3D manipuleret væv. 3D-printning giver mulighed for bedre opløsning og større fleksibilitet i skimmel design end bearbejdning polycarbonat, hvor dimensioner er begrænset af de tilgængelige værktøj størrelser. Med en høj opløsning 3D printer, vægge så tynd som 0.254 mm kan printes og lavpunktet dimensioner er kun begrænset af løsningen af printer (15,2 µm opløsning for disse undersøgelser). Typisk, CNC med mindre end 0,3 mm er ikke kommercielt tilgængelige, så det ikke er muligt at oprette lavpunkter af mindre bredder. Mikro-fræsning kan producere mindre funktioner, selv om udstyret, der kræves kan være uoverkommeligt dyre eller utilgængelige for mange biomedicinsk forskning labs. Lavpunktet dimensioner og krumning er også begrænset af pindfræser tip form. Derudover funktioner vinklet som eller koniske vægge er ikke muligt, og små features kan briste under den spåntagende proces.
CAD tegninger kan let modificeret til at producere 3D-trykt forme og PDMS negativer af tilpasselig dimensioner. Figur 3 beskriver dimensionerne af vores nuværende 2 mm indlæg 3D-trykt forme, i forhold til tidligere design iterationer. Processen er billig; 2 mm, 5-ring 3D-trykt mug omkostninger 44.67 USD til 3D print og hver del kan bruges til at oprette flere PDMS negativer. Til dato, har vi lavet mere end 30 PDMS negativer fra en enkelt 3D-trykt skimmel. Hver negativ kræver 25 g PDMS på 0,11 USD pr. g (2,75 USD pr PDMS negative). Hver PDMS negativ kan rengøres med vaskemiddel, autoklaveres, og genbruges til op til flere år afhængigt af brugshyppighed. I forhold til den oprindelige design18, bruger kompakte 3D-trykt formen betydeligt mindre PDMS og Agarosen pr. 2 mm væv ring (figur 1E).
Celler seedede i afbalancerede Agarosen wells samlede til form væv ringe i mindre end 24 h. Ring dimensioner afhænger dimensioner af Agarosen brønde. Her, viste vi at selvsamlede rotte glat muskel celle ringe kan være fremstillet i brønde med 2, 4 eller 12 mm diameter indlæg (figur 4). Mens ringene i denne undersøgelse var kun kulturperler for 3 dage, vi har tidligere kulturperler hSMC ringe for op til 2 uger22, og hMSC-brusk ringe for op til 3 uger13. Som rapporteret tidligere, kan ringe fungere som 3D in vitro- modeller af humane væv for kvantitativ vurdering af væv funktion11 og mekanisk styrke13,22, og kan også tjene som modulære bygning enheder til generere tube-formet væv konstruktioner7,13. Celle seeding betingelser og funktionelle attributter af væv ringe udviklet fra disse celletyper er sammenfattet i tabel 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig1.jpg"> Figur 1: polycarbonat skimmel design. I første omgang, blev 15-godt forme bearbejdet i polycarbonat (A). Senere versioner featured et mere kompakt design (B), med 5 brønde designet til at passe i en enkelt polycarbonat skimmel, og inden for et godt af en 6-godt plade. Her, har vi ændret dette design til at bruge 3D-trykt plast som en mere tilpasselig alternativ til bearbejdet polycarbonat (C). Vist i (D) er Agarosen wells fabrikeret fra oprindelige design18 (venstre) sammenlignet med den nuværende kompakt design (til højre), som kræver betydeligt mindre agarosegelelektroforese, og kræver ikke manuel adskillelse af brønde. Mængder PDMS og Agarosen kræves for hvert design iteration er vist i (E). Center indlæg er 2 mm i diameter. Mug i()er 6 cm x 12 cm, (B) har en 5 cm i diameter, og (C) har en 6 cm i diameter. Skalalinjen i (D) = 3 cm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig1large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig2.jpg"> Figur 2: fabrikation af selvsamlede væv ringe. En 3D-trykt skimmel bruges til at kaste en PDMS negativ, som derefter bruges til at afgive Agarosen wells (A). Cellerne udsås derefter direkte til Agarosen brønde, hvor de samlede i mindre end 24 h til form væv ringe (B). Stiplede linjer i (B) Vis godt dispositionen. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig3.jpg"> Figur 3: tværsnits visning af 3D-trykt skimmel CAD tegning. Dimensioner for lavpunktet bredde (A), trug højde (B), center hul (C), samlede diameter (D), ydre rand (E) og ydre væg højde (F) er vist. Ydervægge (1), øverste del af brønde (2), og center hul (3) er koniske (i en 5 ° vinkel for 1 og 3, 45 ° for 2) for at forbedre brugervenligheden PDMS negative fjernelse. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig4.jpg"> Figur 4: CAD tegninger med tilsvarende PDMS negativer og selvsamlede SMC ringe med 2 (A), 4 (B) og 12 c mm post diametre. I(),(1) angiver et hak for at give orientering, (2) angiver et centralt hul for at forbedre perfusion, (3) er et filnummer, der sikkerhedsmærker direkte på PDMS negativer, og (4) viser den ydre væg, som er tilspidset til at lette PDMS negative fjernelse. Skalere barer i Agarosen wells = 1 cm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig4large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Celletype</td>
			<td>Celler seedede per ring</td>
			<td>Ring diameter</td>
			<td>Kultur varighed</td>
			<td>Funktionel analyse udført</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rotte SMC</td>
			<td>0,5, 1 eller 3 x 106
</td>
			<td>2, 4 eller 12 mm</td>
			<td>3 dage</td>
			<td>Nuværende undersøgelse; NIELSEN</td>
		</tr>
<tr>
<td>
iPSC afledt SMC 11
</td>
			<td>0,6 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>17 dage</td>
			<td>Kontraktilitet test, enakset traekproevningen, histologiske analyse</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Menneskelige SMC 22
</td>
			<td>0,4 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>2, 7 eller 14 dage</td>
			<td>Enakset traekproevningen, histologiske analyse</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Menneskelige MSC 14
</td>
			<td>0,4 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>21 dage</td>
			<td>Enakset traekproevningen, histologiske analyse, ring fusion og tube kompression test, differentiering af brusk væv</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Celle numre kræves for ring fabrikation fra forskellige celletyper.

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds at JoVE.com

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Denne protokol beskriver en platform for at fabrikere selvsamlede væv ringe i variabel størrelser ved hjælp af et tilpassede 3D-trykt plast skimmel. PDMS negativer er helbredt i formen 3D-trykt; Agarosen er støbt i de hærdede PDMS negativer. Cellerne udsås i de resulterende Agarosen brønd hvor de samlede i væv ringe.

Fabrikation af brugerdefinerede Agarosen Wells for celle såning og væv Ring samlesæt bruger 3D-trykt forme

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Instrueret Cellular saml-selv at fabrikere Cell-afledt Tissue Ringe til Biomekanisk analyse og Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Ikke-kontakt, Label-fri overvågning af celler og ekstracellulær matrix ved hjælp af Raman spektroskopi

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Menneskelige bruskvæv Fabrication Brug Tre-dimensionel Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Rapid and Low-cost Prototyping of Medical Devices Using 3D Printed Molds for Liquid Injection Molding

Hurtig og Lavprisselskaber Prototyping af Medical Devices Brug 3D Trykt støbeforme til flydende Injection Molding

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Syntese af kationiseret Magnetoferritin for Ultrahurtig magnetisering Celler

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Skalering af Engineered kargrafter Brug 3D Trykt Guides og Ring Stacking Method

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, ...

Custom Engineered Tissue Culture Molds from Laser-etched Masters

Custom manipuleret vævskultur forme fra Laser-ætset Masters

As the field of tissue engineering has continued to mature, there has been increased interest in a wide range of tissue parameters, including tissue ...

Agarose-based Tissue Mimicking Optical Phantoms for Diffuse Reflectance Spectroscopy

Agarosen-baserede væv efterligne optisk Phantoms for Diffuse Reflektionsgraden spektroskopi

This protocol describes how to make agarose-based tissue-mimicking phantoms and demonstrates how to determine their optical properties using a ...

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Såning og Implantation af en biosyntetiske væv-manipuleret trakeal Graft i en musemodel

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

3D trykt porøse Cellulose Nanocomposite Hydrogel stilladser

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...