Name: fabrication of custom agarose wells for cell seeding and tissue ring self-assembly using 3d-printed molds
Uploaded: 2018-04-02T12:30:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds at JoVE.com

Wij nogmaals mijn dankbaarheid uitspreken Dr. Erica Stults (academisch onderzoek & toepassing wetenschapper, WPI Information Technology Services) voor haar hulp met 3D printing, Amanda Zoë Reidinger, Ph.D., Chris Nycz en Karen Levi, M.E., voor hun inbreng op schimmel ontwerp, Kathy Suqui en Jennifer Mann voor hun hulp testen schimmel ontwerpen en Michael O'Keefe voor zijn hulp met filmen.  Dit werk werd gesteund door de NSF IGERT DGE 1144804 (MWR, HAS), NIH R15 HL097332 (MWR, TAH), NSF REU EEC0754996 (BA), NIH 1R01 EB023907 (MWR, HAS) en NIH R15 HL137197 (MWR, HAS).
<div></div>

1. voorbereiding van de mal 3D-afgedrukt
<ol><li>Een CAD-tekening van de schimmel in de gewenste afmetingen voor te bereiden.</li>
	<li>Het CAD-bestand verzenden in een hoge resolutie 3D-printer. Selecteer de juiste afdrukken kunststof, met glanzende afwerking.</li>
	<li>Na het afdrukken de mal met wasmiddel en water grondig te wassen.</li>
</ol>2. casting PDMS negatieven
<ol><li>Meet de gewenste hoeveelheid PDMS basis op een evenwicht. Voor een schimmel met een 60 mm diameter en 2 mm goed posten, gebruik van 25 g.</li>
	<li>Uithardende agent toevoegen op een 1:10 (w/w) in verhouding tot de PDMS base.</li>
	<li>Roer krachtig tot de twee componenten grondig worden gecombineerd. Onvoldoende mengen kan leiden tot onvolledige uitharding van PDMS, resulterend in een "plakkerig" oppervlak.</li>
	<li>Plaats een stukje laboratorium tape rond de grens van 3D-gedrukte mallen, om de vorming van een basislaag PDMS boven de gedrukte putten.</li>
	<li>Giet het PDMS mengsel in de mal en leg de mal in een vacuuemcel ambtshalve gas tot alle bubbels zijn vrijgegeven.</li>
	<li>Genezen het PDMS bij 50 ° C gedurende 2-4 uur of totdat gestold genoeg om te verwijderen.</li>
	<li>Verwijder de tape lab en zorgvuldig het PDMS negatief uitpakken.</li>
	<li>Incubeer de PDMS bij 60 ° C voor een extra 1 h (na verwijdering uit de mal 3D-afgedrukt) om ervoor te zorgen dat schimmel volledig is uitgehard.</li>
	<li>Wassen het PDMS grondig met wasmiddel en water aan een residu te verwijderen. Onvoldoende wassen kan resulteren in slechte ring vorming voor het eerste gebruik van het PDMS negatief.</li>
</ol>3. het fabriceren van Agarose Wells
<ol><li>Bereiden agarose putten 1 dag vóór het zaaien van de cellen.</li>
	<li>Maak een oplossing van 2% (g/v) agarose in DMEM en autoclaaf.</li>
	<li>Pipetteer 4 mL gesmolten agarose in een gesteriliseerde met autoclaaf PDMS negatief. Daarna negatieven Pipetteer agarose rechtstreeks in de posten van PDMS. Verwijder eventuele luchtbellen met een pipet tip, zoals bubbels inhomogeneities in de goed dimensies veroorzaken kunnen.</li>
	<li>Opmerking: Niet overvol mallen; de bovenkant van het agarose moet plat, zodat agarose putten niveau op PDMS afgehaald en plaatsing in 6-well cultuur platen. Overgebleven agarose kunnen re-gesteriliseerde met autoclaaf en gebruikte weer, hoewel niet meer dan eens.</li>
	<li>Nadat de agarose cools (ongeveer 10 min. voor 4 mL agarose; grotere mallen wellicht meer koeling keer), zorgvuldig de agarose putten scheiden van de negatieven van de PDMS met botte pincet en breng kwantitatief over in een putje van de plaat van een 6-well.</li>
	<li>De agarose putten in volledige kweekmedium dompelen, en equilibreer 's nachts in een 37 ° C incubator voorafgaand aan het gebruiken.</li>
</ol>4. het zaaien van weefsel ringen
<ol><li>Cultuur rat aorta vlotte spier cellen21 (RaSMCs) in DMEM met 10% foetale runderserum (FBS), 1% L-glutamine, 1% niet-essentiële aminozuren, 1% natrium pyruvaat en 1% penicilline-streptomycine totdat zij 70% samenvloeiing. Opmerking: Cellen moeten worden gekweekt op 5% CO2 en 37 ° C in 15 cm weefselkweek platen.</li>
	<li>Na mallen zijn geëquilibreerd (afdeling 3), RaSMCs voor te bereiden voor het zaaien.</li>
	<li>Spoel de platen tweemaal met 5 mL per plaat fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
	<li>Voeg 3 mL 0,25% trypsine per 15 cm petrischaal. Verplaats de platen naar een incubator van de 37 ° C gedurende 2-3 min of totdat cellen hebben getild aan de plaat.</li>
	<li>Neutraliseer trypsine met een gelijk volume (3 mL per plaat) volledige kweekmedium. Resuspendeer de cellen grondig te breken van de bosjes.</li>
	<li>Verdun een hoeveelheid celsuspensie 1:1 met trypan blauwe kleurstof en tellen van de cellen met een hemocytometer.</li>
	<li>Centrifugeer het totale volume van de celsuspensie gedurende 5 min. op 200 x g tot pellet cellen.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen bij een concentratie van 10 miljoen cellen per mL; Dit zal leiden tot 500.000 cellen per 50 µL. Opmerking: Verschillende soorten cellen wellicht verschillende cel concentraties.</li>
	<li>Alle medium uit de mal agarose gecombineerd. Wees voorzichtig alle medium verwijderen uit afzonderlijke putten, maar niet het doorprikken van de bodems van de putten.</li>
	<li>Pipetteer 50 µL van schorsing in elk putje.</li>
	<li>Voeg 2 mL verse voedingsbodem rond de buitenkant van de mal agarose. Wees voorzichtig niet te laten middellange overloop in de putten van het agarose. Plaats de platen in de incubator's nachts (ongeveer 16 h).</li>
	<li>Na een incubatieperiode van de overnachting, het medium van buiten de mallen gecombineerd en 4.5 mL verse medium toevoegen aan elk putje van de plaat 6-well, zodat schimmels en ringen zijn volledig ondergedompeld. Verandering medium dagelijks.</li>
</ol>

<ol>
	<li>L'Heureux, N., Paquet, S., Labbe, R., Germain, L., Auger, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+completely+biological+tissue-engineered+human+blood+vessel.">A completely biological tissue-engineered human blood vessel.</a> FASEB J. 12 (1), 47-56 (1998).</li><li>Adebayo, O., Hookway, T. A., Hu, J. Z., Billiar, K. L., Rolle, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+smooth+muscle+cell+tissue+rings+exhibit+greater+tensile+strength+than+cell-seeded+fibrin+or+collagen+gel+rings.">Self-assembled smooth muscle cell tissue rings exhibit greater tensile strength than cell-seeded fibrin or collagen gel rings.</a> J Biomed Mater Res A. 101 (2), 428-437 (2013).</li><li>Hayashi, K., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+stem+cell+aggregates+with+gelatin+microspheres+to+enhance+biological+functions.">Preparation of stem cell aggregates with gelatin microspheres to enhance biological functions.</a> Acta Biomater. 7 (7), 2797-2803 (2011).</li><li>Kelm, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+concept+for+scaffold-free+vessel+tissue+engineering:+self-assembly+of+microtissue+building+blocks.">A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks.</a> J Biotechnol. 148 (1), 46-55 (2010).</li><li>McAllister, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+haemodialysis+access+with+an+autologous+tissue-engineered+vascular+graft:+a+multicentre+cohort+study.">Effectiveness of haemodialysis access with an autologous tissue-engineered vascular graft: a multicentre cohort study.</a> Lancet. 373, 1440-1446 (2009).</li><li>Svoronos, A. A., Tejavibulya, N., Schell, J. Y., Shenoy, V. B., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-mold+design+controls+the+3D+morphological+evolution+of+self-assembling+multicellular+microtissues.">Micro-mold design controls the 3D morphological evolution of self-assembling multicellular microtissues.</a> Tissue Eng Part A. 20 (7-8), 1134-1144 (2014).</li><li>Gwyther, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+vascular+tissue+fabricated+from+aggregated+smooth+muscle+cells.">Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells.</a> Cells Tissues Organs. 194 (1), 13-24 (2011).</li><li>Mehesz, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+robotic+biofabrication+of+tissue+spheroids.">Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids.</a> Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).</li><li>Laterreur, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+direct+burst+pressure+and+the+ring+tensile+test+methods+for+mechanical+characterization+of+tissue-engineered+vascular+substitutes.">Comparison of the direct burst pressure and the ring tensile test methods for mechanical characterization of tissue-engineered vascular substitutes.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 34, 253-263 (2014).</li><li>L'Heureux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tissue-engineered+blood+vessels+for+adult+arterial+revascularization.">Human tissue-engineered blood vessels for adult arterial revascularization.</a> Nat Med. 12 (3), 361-365 (2006).</li><li>Dash, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Engineered+Vascular+Rings+from+Human+iPSC-Derived+Smooth+Muscle+Cells.">Tissue-Engineered Vascular Rings from Human iPSC-Derived Smooth Muscle Cells.</a> Stem Cell Reports. 7 (1), 19-28 (2016).</li><li>Heureux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+tissue-engineered+vascular+media:+a+new+model+for+pharmacological+studies+of+contractile+responses.">A human tissue-engineered vascular media: a new model for pharmacological studies of contractile responses.</a> FASEB J. 15, 515-524 (2001).</li><li>Dikina, A. D., Strobel, H. A., Lai, B. P., Rolle, M. W., Alsberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+cartilaginous+tubes+for+tracheal+tissue+replacement+via+self-assembly+and+fusion+of+human+mesenchymal+stem+cell+constructs.">Engineered cartilaginous tubes for tracheal tissue replacement via self-assembly and fusion of human mesenchymal stem cell constructs.</a> Biomaterials. 52, 452-462 (2015).</li><li>Twal, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellularized+microcarriers+as+adhesive+building+blocks+for+fabrication+of+tubular+tissue+constructs.">Cellularized microcarriers as adhesive building blocks for fabrication of tubular tissue constructs.</a> Ann Biomed Eng. 42 (7), 1470-1481 (2014).</li><li>Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+vascular+tissue+engineering+using+bioprinting.">Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting.</a> Biomaterials. 30 (30), 5910-5917 (2009).</li><li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+facilitated+scaffold-free+tissue+unit+fabrication.">3D printing facilitated scaffold-free tissue unit fabrication.</a> Biofabrication. 6 (2), 1-11 (2014).</li><li>Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rods,+tori,+and+honeycombs:+the+directed+self-assembly+of+microtissues+with+prescribed+microscale+geometries.">Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries.</a> The FASEB Journal. 21 (14), 4005-4012 (2007).</li><li>Gwyther, T. A., Hu, J. Z., Billiar, K. L., Rolle, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cellular+self-assembly+to+fabricate+cell-derived+tissue+rings+for+biomechanical+analysis+and+tissue+engineering.">Directed cellular self-assembly to fabricate cell-derived tissue rings for biomechanical analysis and tissue engineering.</a> J Vis Exp. (57), e3366 (2011).</li><li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+functional+biomaterials+for+tissue+engineering.">3D printing of functional biomaterials for tissue engineering.</a> Curr Opin Biotechnol. 40, 103-112 (2016).</li><li>Jakab, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+by+self-assembly+and+bio-printing+of+living+cells.">Tissue engineering by self-assembly and bio-printing of living cells.</a> Biofabrication. 2 (2), 022001 (2010).</li><li>Lemire, J. M., Potter-Perigo, S., Hall, K. L., Wight, T. N., Schwartz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Rat+Aortic+Smooth+Muscle+Cells+Differ+in+Versican/PG-M+Expression.">Distinct Rat Aortic Smooth Muscle Cells Differ in Versican/PG-M Expression.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 16 (6), 821-829 (1996).</li><li>Strobel, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+self-assembly+with+microsphere+incorporation+for+growth+factor+delivery+within+engineered+vascular+tissue+rings.">Cellular self-assembly with microsphere incorporation for growth factor delivery within engineered vascular tissue rings.</a> Tissue Eng Part A. 23 (3-4), 143-155 (2017).</li><li>Strobel, H. A., Calamari, E. L., Beliveau, A., Jain, A., Rolle, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+characterization+of+electrospun+polycaprolactone+and+gelatin+composite+cuffs+for+tissue+engineered+blood+vessels.">Fabrication and characterization of electrospun polycaprolactone and gelatin composite cuffs for tissue engineered blood vessels.</a> JBMR Part B. , (2017).</li><li>Napolitano, A. P., Chai, P., Dean, D. M., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+self-assembly+of+complex+cellular+aggregates+on+micromolded+nonadhesive+hydrogels.">Dynamics of the self-assembly of complex cellular aggregates on micromolded nonadhesive hydrogels.</a> Tissue Eng. 13 (8), 2087-2094 (2007).</li><li>Gwyther, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Engineered Vascular Tissue Generated by Cellular Self-Assembly. , (2012).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier hebben we een veelzijdige methode voor de snelle fabricage van zelf geassembleerde weefsel ringen aangeboden met gemakkelijk aangepaste afmetingen met behulp van 3D printen. Onze methode is vergelijkbaar met die gerapporteerd in Svoronos et al. 6 , waar 3D-gedrukte honingraat en hond-bot gevormd wax mallen te werpen PDMS negatieven werden gebruikt. Echter hebben de mallen zijn aangepast verscheidene unieke design functies bevatten. Een inkeping (figuur 4A(1)) biedt oriëntatie van de mal om elke ring label en individueel gecontroleerd worden. Het centrale gat (figuur 4A(2)) helpt te verbeteren van de verspreiding van medium in de putjes. CAD bestandsnummers worden afgedrukt rechtstreeks op de mal; Daarom PDMS negatieven worden elk aangeduid met versienummer en post diameter (Figuur 4A3). De taps toelopende buitenmuren en (Figuur 3(1), 5 °), aan de bovenkant van de goed troggen (Figuur 3(2), 45 °), en gat in het midden (Figuur 3(3), 5 °) gemakkelijker te verwijderen PDMS negatieven uit de 3D-gedrukte mallen , en agarose putten zijn gemakkelijker te verwijderen uit de PDMS negatieven (figuur 4A(2), A(4)).
We hebben laten zien van de veelzijdigheid van dit systeem door het fabriceren van zelf geassembleerde ringvormige weefsels van een scala aan diameters en celtypes, met inbegrip van de primaire mens vlotte spier cellen (SMCs)18,22, rat aorta SMCs7 , 23, menselijke mesenchymale stamcellen (hMSCs)13en SMCs afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs)11 (tabel 1). In de lopende werkzaamheden, zijn we de vorming van ringen van extra celtypes zoals endotheliale cellen evalueren en smelten van kraakbeen ringen van verschillende groottes voor potentiële toepassingen in tracheale vervanging. Naast volledig cel-afgeleide constructies, hebben wij ook dit systeem gebruikt voor het fabriceren van ringen met opgenomen kruislings gekoppelde gelatine microsferen13,22. Microbolletjes binnen weefsel ringen tijdens zelf-assemblage voor extra mechanische sterkte kunnen worden opgenomen, of gelokaliseerd voor levering van groeifactoren13,22.
Wanneer het fabriceren van weefsel ringen, kan optimalisatie van celaantal worden vereist voor verschillende soorten cellen. Minimumgrootte voor een cel nummers kan variëren op basis van de grootte en het type van cellen. Bijvoorbeeld, hSMCs iPSCs afgeleid worden overgeënt op 600.000 cellen/ring11, hMSCs en primaire hSMCs worden overgeënt op 400.000 cellen/ring13,22, en rat die aorta SMCs worden overgeënt op 500.000 cellen/ring18. Trog afmetingen kunnen ook invloed hebben op ring vorming en het minimum aantal cellen die nodig zijn voor ring vorming24. Voor studies met menselijke cellen en 3D-gedrukte mallen, werd een trog breedte van 2 mm gebruikt. De originele mallen van polycarbonaat had een trog breedte van 3,75 mm, die 750.000 hSMCs vereist vormen een 2 mm cel ring18. Met de breedte van de verminderde trog konden we aan het verminderen van het aantal cellen die nodig zijn voor de vorming van de ring met 46%, tot 400.000 cellen per ring25. Hoeveelheden cellen zaadjes per ring zijn samengevat in tabel 1.
Bij het kiezen van een 3D-drukwerk, vele factoren moeten worden overwogen. Omdat PDMS meestal bij 60 ° C genezen is, de 3D-drukwerk moet beschikken over een hoog genoeg smelttemperatuur om schade te voorkomen tijdens het PDMS genezen. De smelttemperatuur van het gebruikte materiaal in deze studie (een merkgebonden materiaal, Zie Tabel of Materials) is niet beschikbaar. Echter wanneer gebakken bij 60 ° C gedurende 1 uur, vastgesteld we hebben dat het materiaal begon te produceren een geur. Dus besloten we om het verlagen van de uithardende temperatuur tot 50 ° C en de uithardingstijd te verhogen om het PDMS bakken zonder beschadiging van de 3D-drukwerk. Aanpassingen in het genezen van tijd wellicht nodig als mallen zijn aangepast aan de vorm groter PDMS negatieven. Een extra uithardende periode bij 60 ° C na PDMS verwijdering uit de 3D-gedrukte mallen voorkomt dat de definitieve PDMS negatieve resterende smakeloos, terwijl het beperken van de temperatuur die de mal 3D-afgedrukt wordt blootgesteld aan. Merk op dat sommige materialen remmen voor PDMS genezen, dus zorg ervoor dat het geselecteerde materiaal is compatibel met de PDMS. Ten slotte is de schimmel materiële toxiciteit moet ook worden overwogen. Terwijl de mal 3D-afgedrukt niet in direct contact met cellen zijn zal, is het mogelijk dat sommige residu van de mal kan worden overgedragen aan de PDMS negatieve tijdens de uithardende procedure. We vonden dat zeer grondig wassen met afwasmiddel voldoende om alle residuen van het PDMS negatief was. Echter vastgesteld we hebben eerder dat onvoldoende wassen heeft geleid tot arme ring vorming in agarose putten voor de eerste paar toepassingen van het PDMS negatieve. Het gebruik van PDMS cast van andere 3D-gedrukte materialen mogelijk extra onderzoek om te verifiëren dat wasmiddel voldoende is voor het verwijderen van schimmel residuen, met inbegrip van alle mogelijke leachates. Periodieke testen kan ook nodig, als het mogelijk dat herhaald verwarming cycli (zelfs tot 50 ° C) kan de schimmel na verloop van tijd schade, en veroorzaken verhogingen in residu na herhaald gebruik zijn. Tot op heden hebben we een enkele 3D-gedrukte schimmel gebruikt voor de productie van meer dan 30 PDMS negatieven die zijn gebruikt voor het met succes het genereren van weefsel ringen.
Algemene, 3D printen kunt grotere veelzijdigheid voor de fabrikatie van agarose mallen dan verspanen van polycarbonaat. Het biedt een hogere resolutie dan mogelijk is met tooling, en schimmel ontwerp wordt niet beperkt door de afmetingen van de beschikbare instrumenten. Dit zorgt voor een grotere aanpassing, en de toevoeging van functies zoals stiftschroeven die wellicht niet mogelijk zijn met verspanen. Dit systeem kan worden toegepast op het fabriceren van zelf geassembleerde weefsels in andere vormen, naast ringen6,17. Gebruik de ringmethode fabricage, hebben we ontwikkeld weefsel ringen uit een verscheidenheid van celtypen en maten voor potentiële toepassingen in de trachea weefsel engineering13, gemanipuleerde bloedvaten7en modellering vasculaire ziekten11.

Cellulaire zelf-assemblage benaderingen voor het fabriceren van weefsel ontworpen bloedvaten zijn een alternatief voor steiger-gebaseerde benaderingen. Zelf geassembleerd, steiger-gratis weefsels wellicht grotere celdichtheid, verbeterde matrix afzetting en kracht en verbeterde biologische functie ten opzichte van steiger gebaseerde weefsels1,2,3,4 . Vorming van 3D weefsel zonder het gebruik van exogene steiger ondersteuning met specifieke maten en vormen echter een uitdaging. Sommige methoden smelten samen lagen van cel vellen vormen dikker constructies, hoewel dit proces kan tijdrovend en arbeid intensieve5. U kunt ook cellen kunnen worden uitgezaaid in niet-klevende mallen en toegestaan tot totaal in spheroïden, ringen en andere weefsels vormen6,7,8.
Zelf geassembleerde weefsel ringen vereisen minder cellen, kortere tijden van de cultuur, en minder reagentia dan grotere buisvormige ontworpen weefsels, maar kunnen nog steeds worden mechanisch getest, satellietgroepen, of gebruikt voor contractility en andere functionele testen7 , 9 , 10 , 11. omdat ze kunnen worden vervaardigd snel en gemakkelijk getest, weefsel ringen zijn ideaal voor het screenen van grote aantallen cultuur parameters, en potentieel voor gebruik als ziekte modellen11 of hulpmiddelen voor drug screening van12. Daarnaast ringen kunnen in meer complexe weefsel structuren zoals bloedvaten of luchtpijp7,13worden gesmolten en ringen meer volledig dan andere vormen zoals spheroïden14,15kunnen smelten.
Agarose wordt veel gebruikt als een schimmel materiaal voor het fabriceren van zelf geassembleerde weefsels als gevolg van de biocompatibiliteit, permeabiliteit en adhesieve eigenschappen van de niet-cel. Bijvoorbeeld, Norotte et al. gefabriceerd agarose mallen van geëxtrudeerde staven, die beperkte controle over de vorm van de mal en vereist speciale apparatuur15ingeschakeld. Tan et al. gestort alginaat druppels als gebouw eenheden om aangepaste hydrogel mallen in verschillende vormen (piramide, plein)16. Echter, de grote diameter van de alginaat spheroïden (300 µm) resulteerde in functies met een lage resolutie. Zo'n lage resolutie kan leiden tot ongelijke schimmel oppervlakken die cel aggregatie consistentie nadelig kunnen beïnvloeden. Als alternatief kan de agarose in polymeer negatieven niet-klevende mallen maken met gladde functies en specifieke afmetingen6,7,17geworpen te worden.
Eerder meldden wij een systeem voor het fabriceren van aangepaste ringvormige agarose cel-zaaien putten van een PDMS negatieve cast in een gefreesde polycarbonaat schimmel7,18. Agarose werd gegoten in de PDMS negatieve en toegestaan om7,18. Cellen werden vervolgens zaadjes in agarose wells, waar ze samengevoegd naar formulier zelf geassembleerd, steiger-vrije weefsel ringen in minder dan 24 h7,18. PDMS negatieven zijn autoclaaf kunnen vele malen worden hergebruikt en zijn zacht en flexibel, waardoor het gemakkelijk te verwijderen van de gestolde agarose putten. Wanneer dit systeem werd aanvankelijk gemeld in Gwyther et al. 7, PDMS negatieven werden gegoten uit gemalen polycarbonaat mallen (figuur 1A). Na agarose gieten, waren de cel seeding putten individueel uitgesneden en geplaatst in putjes van een 12-well plaat7,18. Het ontwerp is meer recent bewerkt zodat een enkele agarose schimmel 5 ringen produceert en in een put van een 6-well-plaat past, eliminerend de behoefte om individuele wells uitknippen en het verminderen van de hoeveelheid PDMS en agarose nodig voor de productie van elke ring (figuur 1B). Een kleinere cel zaaien trog breedte werd gebruikt ter vermindering van het aantal geplaatste cellen moeten bereiken ring vorming. Ondanks deze veranderingen, kan de resolutie en de aanpassing van mallen waren beperkt tot de afmetingen van de beschikbare standaard endmill, en micromilling onbetaalbaar. Bovendien, computer numerieke besturing (CNC) bewerking kan tijdrovend en omslachtig als gevolg van de noodzaak om tijd reserveren op zwaar gebruikt aangepaste apparatuur, extra computer-aided manufacturing (CAM) software voor het converteren van de (computer aided design CAD-) bestand naar een programmeerbare hulpmiddel pad, en een betrouwbare fixturing van het deel van de polycarbonaat tijdens het verspanen.
In de huidige studie onderzochten we het gebruik van 3D printen als alternatief voor CNC verspaning. 3D printen wordt veel gebruikt voor engineering aangepaste implantaten, steiger materialen, fabriceren en direct printen van cellen en weefsel spheroïden15,19,20. We gebruikten een high-resolution 3D-printer, en gespecialiseerde 3D printen materiaal waardoor ons om af te drukken een stijve mal met een gladde, glanzende oppervlak matteren (Zie Tabel van materialen). Onze techniek maakt het mogelijk voor de fabricage van hoogst klantgerichte, high-resolution plastic mallen die kunnen worden gebruikt voor het gieten van PDMS negatieven en agarose wells. Ontwerp iteraties worden samengevat in Figuur 1. Het ontwerp van de schimmel is verder bewerkt in de mal 3D-gedrukte versie met taps toelopende buitenmuren en een center-gat te verlichten van de verwijdering van zowel de PDMS negatieven van 3D-gedrukte mallen en de agarose putten uit PDMS negatieven. Deze spits toelopende functies worden niet bereikt met standaard verspanen van processen. De afstand van de onderkant van de putten naar de bodem van de mal werd verhoogd in deze iteratie, resulterend in een dikkere agarose basis onder de posten om het risico van posten breken tijdens het agarose goed verwijderen. De schimmel en ring fabricage-procedure is schematisch weergegeven in Figuur 2.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>15-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroWhite</td>
			<td>StrataSys</td>
			<td>RGD835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>StrataSys</td>
			<td>Objet 260 Connex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>15-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16000069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-015-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-000-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-strep</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-900-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WKY 3M-22 rat aortic smooth muscle cells</td>
			<td>Provided by T. Wight [ref 21]</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of custom agarose wells for cell seeding and tissue ring self-assembly using 3d-printed molds

Gemodificeerde weefsels worden klinisch gebruikt voor weefselherstel en vervanging, en worden ontwikkeld als instrument voor de drug screening en modellering van ziekten bij de mens. Zelf geassembleerde weefsels bieden voordelen ten opzichte van de steiger gebaseerde weefselengineering, zoals verbeterde matrix depositie, kracht en functie. Er zijn echter enkele beschikbare methoden voor het fabriceren van 3D weefsel zonder cellen op of in een ondersteunende steiger zaaien. Eerder, ontwikkelden we een systeem voor het fabriceren van zelf geassembleerde weefsel ringen door het zaaien van de cellen in niet-klevende agarose wells. Een Polydimethylsiloxaan (PDMS) negatieve werd eerst in een machinaal polycarbonaat mal gegoten, en vervolgens agarose was gegeleerde in de negatieve PDMS maken ringvormige cel zaaien wells. De veelzijdigheid van deze aanpak was echter beperkt door de resolutie van de tools beschikbaar voor de bewerking van de mal van polycarbonaat. Hier, we laten zien dat 3D-gedrukte kunststof kan worden gebruikt als alternatief voor machinaal polycarbonaat voor het fabriceren van PDMS negatieven. De 3D-gedrukte schimmel en de schimmel van de herziene ontwerp is eenvoudiger te gebruiken, goedkoop te produceren, en vereist aanzienlijk minder agarose en PDMS per cel zaaien goed. We hebben aangetoond dat de resulterende agarose putten kunnen worden gebruikt voor het maken van zelf geassembleerde weefsel ringen met aangepaste diameters uit een verscheidenheid van verschillende celtypes. Ringen kunnen vervolgens worden gebruikt voor histologisch, mechanische en functionele analyse, of voor het fabriceren van grotere en complexere buisvormige weefsels.

Dit systeem zorgt voor de eenvoudige, aangepaste fabricage van agarose cel zaaien wells, waarmee de cel zelf-assemblage van ringvormige 3D ontworpen weefsels. 3D printen kan betere resolutie en meer flexibiliteit in ontwerp van de schimmel dan verspanen van polycarbonaat, waar afmetingen worden beperkt door de beschikbare tool maten. Met een hoge resolutie 3D-printer, wanden zo dun als 0.254 mm kunnen worden afgedrukt, en via dimensies worden alleen beperkt door de resolutie van de printer (15.2 µm resolutie voor deze studies). Typisch, CNC endmills minder dan 0.3 mm zijn niet commercieel beschikbaar, dus het is niet mogelijk te maken van de troggen van kleinere breedtes. Micro-frezen kleinere functies kan produceren, hoewel de apparatuur vereist kan worden onbetaalbaar duur of ontoegankelijk voor veel biomedisch onderzoek labs. Trog afmetingen en kromtestraal zijn ook beperkt door de vorm van het endmill. Bovendien functies zoals schuin of taps toelopende muren zijn niet mogelijk, en kleine elementen kunnen breken tijdens het verspanen.
CAD-tekeningen kunnen eenvoudig worden aangepast voor de productie van de 3D-gedrukte mallen en PDMS negatieven van aanpasbare afmetingen. Figuur 3 beschrijft de afmetingen van onze huidige 2 mm post 3D-gedrukte mallen, in vergelijking met voorgaande ontwerp iteraties. Het proces is goedkoop; de 2 mm, 5-ring 3D-gedrukte schimmel kosten 44.67 USD naar 3D print en elk onderdeel kunnen worden gebruikt te maken van meerdere PDMS negatieven. Tot op heden hebben we meer dan 30 PDMS negatieven uit een enkele 3D-gedrukte schimmel. Elke negatieve vereist PDMS 0.11 USD 25 g / g (2.75 / USD per PDMS negatieve). Elke PDMS negatief kan worden gereinigd met wasmiddel, gesteriliseerde met autoclaaf, en hergebruikt voor tot jaren, afhankelijk van de frequentie van gebruik. In vergelijking met het oorspronkelijke ontwerp18, de compacte 3D-gedrukte mal gebruikt aanzienlijk minder PDMS en de agarose per 2 mm weefsel ring (figuur 1E).
Cellen zaadjes in de agarose geëquilibreerd putten samenvoegen toe aan het formulier weefsel ringen in minder dan 24 h. Ring afmetingen zijn afhankelijk van de afmetingen van de agarose putten. Hier, we laten zien dat zelf geassembleerde rat glad spierweefsel cel ringen kunnen worden vervaardigd in putjes met 2, 4 of 12 mm diameter berichten (Figuur 4). Terwijl ringen in deze studie alleen voor 3 dagen gekweekt werden, we hebben eerder hSMC ringen gedurende maximaal 2 weken22gekweekt, en hMSC-kraakbeen ringen voor maximaal 3 weken13. Zoals eerder gemeld, kunnen ringen functioneren zoals 3D in vitro modellen van menselijke weefsels voor kwantitatieve beoordeling van weefsel11 en mechanische sterkte13,22 functioneren, en ook dienen als modulaire gebouw eenheden kunnen buis-vormige weefsel constructies7,13te genereren. Cel seeding voorwaarden en functionele kenmerken van weefsel ringen ontworpen vanaf deze celtypes zijn samengevat in tabel 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig1.jpg"> Figuur 1: polycarbonaat schimmel ontwerpen. Aanvankelijk werden 15-well mallen machinaal in polycarbonaat (A). Een meer compact ontwerp (B), latere versies uitgerust met 5 putten die zijn ontworpen om te passen in een enkele polycarbonaat mal, en binnen één putje van de plaat van een 6-well. Hier, bewerkt we dit ontwerp gebruiken 3D-gedrukte kunststof als een beter aanpasbaar alternatief voor machinaal polycarbonaat (C). Weergegeven in (D) zijn agarose wells vervaardigd uit de eerste ontwerpen18 (links) in vergelijking met de huidige compacte ontwerp (rechts), die aanzienlijk minder agarose vereist, en vereist geen handmatige scheiding van putten. Hoeveelheden PDMS en agarose vereist voor elke iteratie ontwerp staan in (E). Centrum posten zijn 2 mm in diameter. Schimmel in()is 6 cm x 12 cm, (B) heeft een diameter van 5 cm, en (C) heeft een diameter van 6 cm. Schaal bar in (D) = 3 cm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig2.jpg"> Figuur 2: fabricage van zelf geassembleerde weefsel ringen. Een 3D-gedrukte schimmel wordt gebruikt om te werpen een PDMS negatief, die vervolgens wordt gebruikt om te werpen de agarose putten (A). Cellen worden vervolgens rechtstreeks in de agarose putten, waar ze in minder dan 24 h van formulier weefsel ringen (B) totale overgeënt. Onderbroken lijnen in (B) weergeven het goed overzicht. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig3.jpg"> Figuur 3: transversale weergave van 3D-gedrukte schimmel CAD tekening. Afmetingen voor trog breedte (A), trog hoogte (B), center gat (C), totale doorsnede (D), buitenste lip (E) en buitenmuur hoogte (F) worden weergegeven. De buitenmuren (1), bovenste gedeelte van de putten (2), en centrum gat (3) zijn kegelvormige (onder een hoek van 5 ° voor 1 en 3, 45 ° voor 2) ter verbetering van gebruiksgemak PDMS negatieve verwijdering. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig4.jpg"> Figuur 4: CAD tekeningen met bijbehorende PDMS negatieven en zelf geassembleerde SMC ringen met 2 (A), 4 (B) en 12 (C) mm post diameters. In(),(1) geeft aan een inkeping voor het verstrekken van oriëntatie, (2) geeft aan een centraal boorgat ter verbetering van de perfusie, (3) is een dossiernummer, die rechtstreeks op de negatieven PDMS stempelt, en (4) weergave van de buitenste muur, die kegelvormige is om te verlichten PDMS negatieve verwijdering. Schaal van balken in de agarose wells = 1 cm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Celtype</td>
			<td>Cellen zaadjes per ring</td>
			<td>De diameter van de ring</td>
			<td>Duur van de cultuur</td>
			<td>Functionele analyse uitgevoerd</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rat SMC</td>
			<td>0.5, 1 of 3 x 106
</td>
			<td>2, 4 of 12 mm</td>
			<td>3 dagen</td>
			<td>Huidige studie; N/B</td>
		</tr>
<tr>
<td>
iPSC afgeleid SMC 11
</td>
			<td>0,6 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>17 dagen</td>
			<td>Contractility testen, eenassige treksterkte test, histologisch analyse</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Menselijke SMC 22
</td>
			<td>0,4 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>2, 7 of 14 dagen</td>
			<td>Eenassige treksterkte test, histologisch analyse</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Menselijke MSC 14
</td>
			<td>0,4 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>21 dagen</td>
			<td>Eenassige treksterkte test, histologisch analyse, ring fusion en buis compressie testen, differentiatie in kraakbeen weefsel</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Cel nummers die nodig zijn voor de fabricage van de ring van verschillende celtypes.

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds at JoVE.com

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Dit protocol beschrijft een platform voor het fabriceren van zelf geassembleerde weefsel ringen in verschillende afmetingen met behulp van een aangepaste 3D-gedrukte kunststof schimmel. PDMS negatieven worden genezen in de 3D-gedrukte mal; vervolgens is agarose gegoten in de uitgeharde PDMS negatieven. Cellen worden overgeënt in de resulterende agarose putten waar ze in weefsel ringen aggregaat.

Fabricage van aangepaste Agarose putten voor het zaaien van de cellen en weefsel Ring zelf-assemblage met behulp van 3D-gedrukte mallen

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Gericht Cellular Self-Assembly to Cell-Derived weefsel Rings fabriceren voor Biomechanische Analyse en Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-contact, Label-free monitoring van cellen en extracellulaire matrix met behulp van Raman spectroscopie

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Human kraakbeenweefsel Fabrication behulp van drie-dimensionale Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Rapid and Low-cost Prototyping of Medical Devices Using 3D Printed Molds for Liquid Injection Molding

Snelle en Low-cost Prototyping van medische hulpmiddelen met behulp van 3D-Gedrukt Mallen voor Liquid Injection Molding

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Synthese van gekationiseerde Magnetoferritin voor ultrasnelle magnetisatie van Cells

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Het schalen van Engineered Vascular Enten Met behulp van 3D-Gedrukt Gidsen en de Ring Stapelen Method

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, ...

Custom Engineered Tissue Culture Molds from Laser-etched Masters

Aangepaste ontworpen weefselkweek mallen van Laser-geëtst meesters

As the field of tissue engineering has continued to mature, there has been increased interest in a wide range of tissue parameters, including tissue ...

Agarose-based Tissue Mimicking Optical Phantoms for Diffuse Reflectance Spectroscopy

Agarose gebaseerde weefsel nabootsen van optische Phantoms voor Diffuse reflectie spectroscopie

This protocol describes how to make agarose-based tissue-mimicking phantoms and demonstrates how to determine their optical properties using a ...

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Zaaien en implantatie van een Biosynthetic weefsel-engineered tracheale Graft in een muismodel

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

3D afgedrukt poreuze Cellulose nanocomposietmaterialen Hydrogel steigers

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...