Name: fabrication of custom agarose wells for cell seeding and tissue ring self-assembly using 3d-printed molds
Uploaded: 2018-04-02T12:30:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds at JoVE.com

Nous tenons à souligner le Dr Erica Stults (recherche universitaire & Application scientifique, Services informatiques WPI) pour son aide avec l’impression 3D, Amanda Zoë Reidinger, Ph.d., Chris Nycz et Karen Levi, M.E., pour leur contribution à la conception du moule, Kathy Suqui et Jennifer Mann pour leur aide test dessins de moule et Michael O'Keefe pour son aide avec le tournage.  Ce travail a été soutenu par NSF IGERT DGE 1144804 (MWR, HAS), NIH R15 HL097332 (MWR, TAH), NSF REU EEC0754996 (BA), NIH 1R01 EB023907 (MWR, AP) et NIH R15 HL137197 (MWR, AP).
<div></div>

1. préparer le moule 3D-imprimé
<ol><li>Préparer un dessin du moule dans les dimensions désirées de CAO.</li>
	<li>Envoyer le fichier CAO à une imprimante 3D haute résolution. Choisir le matériel d’impression en plastique approprié, avec une finition brillante.</li>
	<li>Après l’impression, laver soigneusement le moule à l’eau et de détergent.</li>
</ol>2. moulage PDMS négatifs
<ol><li>Mesurer la quantité désirée de PDMS base sur une balance. Pour un moule avec un 60 mm de diamètre et 2 mm bien messages, utilisez 25 g.</li>
	<li>Ajouter de salaison à un 01:10 (p/p) rapport à la base PDMS.</li>
	<li>Remuer vigoureusement jusqu'à ce que les deux composants sont soigneusement combinés. Une homogénéisation insuffisante peut entraîner la polymérisation incomplète du PDMS, ayant pour résultat une surface « visqueux ».</li>
	<li>Placez un morceau de ruban de laboratoire autour de la bordure de moules 3D-imprimés, pour permettre la formation d’une couche de base PDMS au-dessus des puits imprimées.</li>
	<li>Versez le mélange PDMS dans le moule et placez le moule dans une chambre à vide au dé-gaz jusqu'à ce que toutes les bulles sont libérés.</li>
	<li>Guérir le PDMS à 50 ° C pendant 2 à 4 heures, ou jusqu'à ce que suffisamment solidifiée à supprimer.</li>
	<li>Retirez le ruban de lab et extraire avec précaution le négatif PDMS.</li>
	<li>Incuber le PDMS à 60 ° C pendant 1 h supplémentaire (après extraction du moule 3D-imprimés) afin d’assurer cette moule est complètement guéri.</li>
	<li>Laver le PDMS soigneusement avec un détergent et d’eau pour enlever tout résidu. Lavage insuffisant peut entraîner pauvre anneau de formation pour les premières utilisations du PDMS négatif.</li>
</ol>3. confection d’Agarose Wells
<ol><li>Préparer d’agarose puits 1 jour avant l’ensemencement de cellules.</li>
	<li>Faire une solution d’agarose à 2 % (p/v) dans DMEM et autoclave.</li>
	<li>Pipette 4 mL agarose fondu dans un autoclave PDMS négatif. Puis agarose pipette directement dans les poteaux du PDMS négatifs. Enlever les bulles d’air avec un embout de la pipette, bulles peuvent causer des inhomogénéités dans les dimensions bien.</li>
	<li>Remarque : Ne pas trop remplir les moules ; la surface supérieure de l’agarose doit être plate, afin que l’agarose puits sera niveau retrait de PDMS et placement en plaques 6 puits culture. Agarose reste peut-être être re-stérilisés à l’autoclave et utilisé encore une fois, bien que pas plus d’une fois.</li>
	<li>Après refroidisse de l’agarose (environ 10 min pour 4 mL d’agarose ; grandes moules pourraient avoir besoin de temps de refroidissement plus), soigneusement séparer les puits du gel d’agarose de PDMS négatifs avec une pincette émoussé et transférer dans un puits d’une plaque de 6 puits.</li>
	<li>Submerger les puits d’agarose dans le milieu de culture complet et équilibrer toute la nuit dans une étuve de 37 ° C avant utilisation.</li>
</ol>4. semis anneaux de tissu
<ol><li>Cellules musculaires lisses aortiques de culture rat21 (CMLAR) DMEM contenant 10 % sérum bovin fœtal (SVF), 1 % L-glutamine, 1 % des acides aminés non essentiels, pyruvate de sodium 1 % et 1 % la pénicilline-streptomycine jusqu'à ce qu’ils atteignent 70 % confluence. Remarque : Les cellules doivent être cultivées à 5 % de CO2 et 37 ° C en plaques de culture de tissu de 15 cm.</li>
	<li>Après les moules soient équilibrés (article 3), préparer CMLAR pour l’amorçage.</li>
	<li>Rincer les plaques deux fois avec 5 mL par plaque de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).</li>
	<li>Ajouter trypsine 0,25 % 3 mL par 15 cm boîte de Pétri. Déplacez les plaques dans un incubateur à 37 ° C pendant 2 à 3 min ou jusqu'à ce que les cellules ont décollé de la plaque.</li>
	<li>Neutraliser la trypsine avec un volume égal (3 mL par plaque) du milieu de culture complet. Remettre en suspension les cellules soigneusement pour briser les mottes.</li>
	<li>Diluer une aliquote de suspension cellulaire 1:1 avec le colorant bleu trypan et compter les cellules avec un hémocytomètre.</li>
	<li>Centrifuger le volume total de suspension cellulaire pendant 5 min à 200 x g pour granuler des cellules.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules à une concentration de 10 millions de cellules par millilitre ; Cela se traduira par 500 000 cellules / µL 50. Remarque : Les différents types de cellules peuvent nécessiter des concentrations cellulaires différentes.</li>
	<li>Aspirer toutes les moyennes du moule d’agarose. Veillez à supprimer tous les moyen de puits individuels, mais à ne pas percer le fond des puits.</li>
	<li>Pipetter 50 µL de suspension dans chaque puits.</li>
	<li>Ajouter 2 mL de milieu frais autour de l’extérieur du moule d’agarose avec précaution. Veillez à ne pas faire de dépassement de capacité moyenne dans les puits de l’agarose. Placer les plaques dans l’incubateur pendant la nuit (environ 16 h).</li>
	<li>Après incubation pendant la nuit, aspirez le milieu de l’extérieur les moules et ajouter 4,5 mL de milieu frais dans chaque puits de la plaque 6 puits, afin que les moules et les anneaux est complètement immergés. Moyen de changement tous les jours.</li>
</ol>

<ol>
	<li>L'Heureux, N., Paquet, S., Labbe, R., Germain, L., Auger, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+completely+biological+tissue-engineered+human+blood+vessel.">A completely biological tissue-engineered human blood vessel.</a> FASEB J. 12 (1), 47-56 (1998).</li><li>Adebayo, O., Hookway, T. A., Hu, J. Z., Billiar, K. L., Rolle, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+smooth+muscle+cell+tissue+rings+exhibit+greater+tensile+strength+than+cell-seeded+fibrin+or+collagen+gel+rings.">Self-assembled smooth muscle cell tissue rings exhibit greater tensile strength than cell-seeded fibrin or collagen gel rings.</a> J Biomed Mater Res A. 101 (2), 428-437 (2013).</li><li>Hayashi, K., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+stem+cell+aggregates+with+gelatin+microspheres+to+enhance+biological+functions.">Preparation of stem cell aggregates with gelatin microspheres to enhance biological functions.</a> Acta Biomater. 7 (7), 2797-2803 (2011).</li><li>Kelm, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+concept+for+scaffold-free+vessel+tissue+engineering:+self-assembly+of+microtissue+building+blocks.">A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks.</a> J Biotechnol. 148 (1), 46-55 (2010).</li><li>McAllister, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+haemodialysis+access+with+an+autologous+tissue-engineered+vascular+graft:+a+multicentre+cohort+study.">Effectiveness of haemodialysis access with an autologous tissue-engineered vascular graft: a multicentre cohort study.</a> Lancet. 373, 1440-1446 (2009).</li><li>Svoronos, A. A., Tejavibulya, N., Schell, J. Y., Shenoy, V. B., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-mold+design+controls+the+3D+morphological+evolution+of+self-assembling+multicellular+microtissues.">Micro-mold design controls the 3D morphological evolution of self-assembling multicellular microtissues.</a> Tissue Eng Part A. 20 (7-8), 1134-1144 (2014).</li><li>Gwyther, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+vascular+tissue+fabricated+from+aggregated+smooth+muscle+cells.">Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells.</a> Cells Tissues Organs. 194 (1), 13-24 (2011).</li><li>Mehesz, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+robotic+biofabrication+of+tissue+spheroids.">Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids.</a> Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).</li><li>Laterreur, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+direct+burst+pressure+and+the+ring+tensile+test+methods+for+mechanical+characterization+of+tissue-engineered+vascular+substitutes.">Comparison of the direct burst pressure and the ring tensile test methods for mechanical characterization of tissue-engineered vascular substitutes.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 34, 253-263 (2014).</li><li>L'Heureux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tissue-engineered+blood+vessels+for+adult+arterial+revascularization.">Human tissue-engineered blood vessels for adult arterial revascularization.</a> Nat Med. 12 (3), 361-365 (2006).</li><li>Dash, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Engineered+Vascular+Rings+from+Human+iPSC-Derived+Smooth+Muscle+Cells.">Tissue-Engineered Vascular Rings from Human iPSC-Derived Smooth Muscle Cells.</a> Stem Cell Reports. 7 (1), 19-28 (2016).</li><li>Heureux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+tissue-engineered+vascular+media:+a+new+model+for+pharmacological+studies+of+contractile+responses.">A human tissue-engineered vascular media: a new model for pharmacological studies of contractile responses.</a> FASEB J. 15, 515-524 (2001).</li><li>Dikina, A. D., Strobel, H. A., Lai, B. P., Rolle, M. W., Alsberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+cartilaginous+tubes+for+tracheal+tissue+replacement+via+self-assembly+and+fusion+of+human+mesenchymal+stem+cell+constructs.">Engineered cartilaginous tubes for tracheal tissue replacement via self-assembly and fusion of human mesenchymal stem cell constructs.</a> Biomaterials. 52, 452-462 (2015).</li><li>Twal, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellularized+microcarriers+as+adhesive+building+blocks+for+fabrication+of+tubular+tissue+constructs.">Cellularized microcarriers as adhesive building blocks for fabrication of tubular tissue constructs.</a> Ann Biomed Eng. 42 (7), 1470-1481 (2014).</li><li>Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+vascular+tissue+engineering+using+bioprinting.">Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting.</a> Biomaterials. 30 (30), 5910-5917 (2009).</li><li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+facilitated+scaffold-free+tissue+unit+fabrication.">3D printing facilitated scaffold-free tissue unit fabrication.</a> Biofabrication. 6 (2), 1-11 (2014).</li><li>Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rods,+tori,+and+honeycombs:+the+directed+self-assembly+of+microtissues+with+prescribed+microscale+geometries.">Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries.</a> The FASEB Journal. 21 (14), 4005-4012 (2007).</li><li>Gwyther, T. A., Hu, J. Z., Billiar, K. L., Rolle, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cellular+self-assembly+to+fabricate+cell-derived+tissue+rings+for+biomechanical+analysis+and+tissue+engineering.">Directed cellular self-assembly to fabricate cell-derived tissue rings for biomechanical analysis and tissue engineering.</a> J Vis Exp. (57), e3366 (2011).</li><li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+functional+biomaterials+for+tissue+engineering.">3D printing of functional biomaterials for tissue engineering.</a> Curr Opin Biotechnol. 40, 103-112 (2016).</li><li>Jakab, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+by+self-assembly+and+bio-printing+of+living+cells.">Tissue engineering by self-assembly and bio-printing of living cells.</a> Biofabrication. 2 (2), 022001 (2010).</li><li>Lemire, J. M., Potter-Perigo, S., Hall, K. L., Wight, T. N., Schwartz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Rat+Aortic+Smooth+Muscle+Cells+Differ+in+Versican/PG-M+Expression.">Distinct Rat Aortic Smooth Muscle Cells Differ in Versican/PG-M Expression.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 16 (6), 821-829 (1996).</li><li>Strobel, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+self-assembly+with+microsphere+incorporation+for+growth+factor+delivery+within+engineered+vascular+tissue+rings.">Cellular self-assembly with microsphere incorporation for growth factor delivery within engineered vascular tissue rings.</a> Tissue Eng Part A. 23 (3-4), 143-155 (2017).</li><li>Strobel, H. A., Calamari, E. L., Beliveau, A., Jain, A., Rolle, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+characterization+of+electrospun+polycaprolactone+and+gelatin+composite+cuffs+for+tissue+engineered+blood+vessels.">Fabrication and characterization of electrospun polycaprolactone and gelatin composite cuffs for tissue engineered blood vessels.</a> JBMR Part B. , (2017).</li><li>Napolitano, A. P., Chai, P., Dean, D. M., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+self-assembly+of+complex+cellular+aggregates+on+micromolded+nonadhesive+hydrogels.">Dynamics of the self-assembly of complex cellular aggregates on micromolded nonadhesive hydrogels.</a> Tissue Eng. 13 (8), 2087-2094 (2007).</li><li>Gwyther, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Engineered Vascular Tissue Generated by Cellular Self-Assembly. , (2012).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, nous avons présenté une méthode polyvalente pour la fabrication rapide d’anneaux de tissu auto-assemblés avec dimensions facilement personnalisées en utilisant l’impression 3D. Notre méthode est similaire à celle rapportée dans Svoronos et al. 6 , où 3D-imprimé en nid d’abeille et moules de cire en forme d’os chien ont été utilisés pour effectuer un cast PDMS négatifs. Toutefois, les moules ont été modifiés pour inclure plusieurs fonctionnalités de conception unique. Une encoche (Figure 4 a(1)) fournit de l’orientation du moule pour permettre à chaque anneau d’être étiqueté et contrôlé individuellement. Le trou central (Figure 4 a(2)) permet d’améliorer la diffusion du milieu dans les puits. Les numéros de fichier CAD sont imprimées directement sur le moule ; donc, PDMS négatifs sont chacune marquées avec numéro de version et poster de diamètre (Figure 4A3). Les murs extérieurs coniques (Figure 3(1), 5 °), dans la partie supérieure du puits creux (Figure 3(2), 45 °) et le trou central (Figure 3(3), 5 °) le rendent plus facile de retirer les moules 3D-imprimés de négatifs PDMS , et puits d’agarose sont plus faciles à retirer les négatifs PDMS (Figure 4 a(2), a (4)).
Nous avons démontré la polyvalence de ce système de fabrication auto-assemblés tissus en forme d’anneau d’une variété de diamètres et de types de cellules, y compris le principal muscle lisse humain cellules (CML)18,22, rat aortique CML7 , 23, des cellules souches mésenchymateuses (CSM) humaines13et CML dérivé pluripotentes induites des cellules souches (CISP)11 (tableau 1). Dans les travaux en cours, nous évaluer la formation des anneaux de types de cellules supplémentaires telles que les cellules endothéliales et fusion des anneaux de cartilage de différentes tailles pour des applications potentielles en remplacement trachéale. En plus des constructions complètement culture cellulaire, nous avons également utilisé ce système pour fabriquer des anneaux avec gélatine réticulé incorporé microsphères13,22. Microsphères peuvent être incorporés dans les anneaux de tissu pendant l’auto-assemblage pour fournir une résistance mécanique supplémentaire, ou pour localisées livraison de facteurs de croissance13,22.
Lorsque la fabrication d’anneaux de tissu, optimisation du nombre de cellules peut-être être nécessaire pour différents types de cellules. Cellule minimale numéros peuvent varier basée sur la taille et le type de cellules. Par exemple, hSMCs, dérivés de CISP sont injectées à 600 000 cellules/anneau11, CSM et hSMCs primaire sont injectées à 400 000 cellules/anneau13,22et rat que smcs aortiques sont injectées à 500 000 cellules/anneau18. Dimensions de la cuve peuvent également affecter formation d’anneau et le nombre minimum de cellules nécessaires pour anneau formation24. Pour les études avec des cellules humaines et moules 3D-imprimé, une largeur de creux de 2 mm a été utilisée. Les moules en polycarbonate original avaient une largeur de creux de 3,75 mm, qui exigeait des 750 000 hSMCs pour former un anneau de cellule 2 mm18. Avec la largeur de la fosse réduite, nous avons pu réduire le nombre de cellules nécessaires à la formation d’anneau de 46 %, à 400 000 cellules / anneau25. Quantités de cellules ensemencées par anneau sont résumées dans le tableau 1.
Lors du choix d’un matériau 3D-imprimé, plusieurs facteurs doivent être examinées. Parce que le PDMS est guéri généralement à 60 ° C, les imprimés à 3D doivent avoir une hauteur suffisante fusion température afin d’éviter des dommages pendant le durcissement du PDMS. La température de fusion du matériau utilisé dans cette étude (un matériau exclusif, voir Table des matières) n’est pas disponible. Toutefois, lorsque cuite au four à 60 ° C pendant 1 h, nous avons observé que le matériel a commencé à produire une odeur. Ainsi, nous avons décidé de baisser la température de durcissement à 50 ° C et augmenter le temps de durcissement pour cuire le PDMS sans endommager les imprimés à 3D. Ajustements dans le temps de durcissement peuvent être nécessaires si les moules sont modifiés pour les négatifs PDMS plus grandes forme. Une période de durcissement supplémentaire à 60 ° C, après le retrait de PDMS de moules 3D-imprimés empêche le PDMS final négatif restant poisseuse, tout en limitant la température à que le moule 3D-imprimé est exposé. Notez que certains matériaux inhibent la polymérisation du PDMS, donc vous assurer que le matériel choisi est compatible avec le PDMS. Enfin, la toxicité matière moule doit également considérer. Le moule 3D-imprimé ne sera pas en contact direct avec les cellules, mais il est possible que certains résidus du moule peuvent être transférée à la PDMS négative au cours de la procédure de traitement. Nous avons trouvé que très complet lavage avec détergent était suffisante pour enlever toute trace de résidu le PDMS négatif. Cependant, nous avons déjà observé que lavage insuffisant conduit à formation d’anneau pauvre dans les puits d’agarose pour le premier quelques utilisations de la PDMS négatif. L’utilisation de PDMS cast à partir d’autres matériaux imprimés 3D peut nécessiter investigation supplémentaire pour vérifier que le détergent est suffisant pour éliminer les résidus de moule, y compris des lixiviats potentiels. Des essais périodiques peuvent également être nécessaire, comme il possible qui répète des cycles (jusqu'à 50 ° C) de chauffage peut endommager le moule au fil du temps et provoquent des augmentations résidu après un usage répété. A ce jour, nous avons utilisé un moule 3D-imprimé unique pour produire plus de 30 négatifs PDMS qui ont servi à générer avec succès les anneaux de tissu.
L’impression globale, 3D permet une plus grande polyvalence pour la fabrication de moules d’agarose que l’usinage en polycarbonate. Il offre une résolution plus élevée qu’avec l’outillage et conception du moule n’est pas limitée par les dimensions des outils disponibles. Cela permet une plus grande personnalisation et l’ajout de fonctionnalités telles qu’effilée qui n’est pas possible avec l’usinage. Ce système peut être appliqué à la fabrication de tissus auto-assemblés en autres formes aussi bien, en plus des anneaux6,17. À l’aide de la méthode de fabrication de bague, nous avons développé des anneaux de tissu d’une variété de types de cellules et de tailles pour des applications potentielles dans l' ingénierie tissulaire trachéale13, ingénierie des vaisseaux sanguins7et modélisation des maladies vasculaires11.

Cellulaire auto-assemblage des approches à la fabrication de tissus conçus les vaisseaux sanguins sont une alternative aux approches axées sur l’échafaud. Tissus auto-assemblés, exempt d’échafaudage peuvent avoir une plus grande densité de cellules, le dépôt de la matrice améliorée et force et amélioration de la fonction biologique par rapport aux tissus axée sur l’échafaudage1,2,3,4 . Cependant, formant des tissus 3D sans l’utilisation d’échafaudage exogène de soutien avec des formes et des tailles spécifiques demeure un défi. Certaines méthodes fusionnent des couches de cellules feuilles pour former des constructions plus épaisses, bien que ce processus peut être beaucoup de temps et de main d’oeuvre intensive5. Alternativement, les cellules peuvent être ensemencées dans des moules non adhésive et autorisés à s’agréger en sphéroïdes, anneaux et autres tissus formes6,7,8.
Tissu auto-assemblés anneaux nécessite moins de cellules, de temps de culture plus court et moins réactifs que les plus grands tubulaires ingénierie des tissus, mais peuvent encore être mécaniquement testés, histologique ou utilisés pour contractilité et autres tests fonctionnels7 , 9 , 10 , 11. parce qu’ils peuvent être fabriquées rapidement et facilement mis à l’essai, anneaux de tissu sont idéales pour un grand nombre de paramètres de culture de dépistage et ont le potentiel d’utilisation comme modèles de maladies11 ou outils pour12de dépistage de drogue. En outre, les anneaux peut être fusionnés dans des structures plus complexes de tissus tels que les vaisseaux sanguins ou la trachée7,13, et anneaux peut fusionner plus complètement que les autres formes telles que des sphéroïdes14,15.
Gel d’agarose est largement utilisé comme matériau de moulage pour fabriquer des tissus auto-assemblés en raison de sa biocompatibilité, la perméabilité et les propriétés adhésives non cellules. Par exemple, Norotte et coll. fabriqué d’agarose moules de tiges extrudées, qui a permis un contrôle limité sur la forme du moule et de l’équipement spécialisé requis15. Tan et coll. dépôt de gouttelettes d’alginate comme construction des unités pour fabriquer des moules personnalisés hydrogel en diverses formes (pyramide, square)16. Cependant, le grand diamètre des sphéroïdes alginate (300 µm) entraîné caractéristiques à faible résolution. Surfaces inégales moule qui peuvent affecter négativement la cohérence agrégation cellulaire peut entraîner une telle résolution faible. Par ailleurs, agarose peut être casté en négatifs de polymères pour créer des moules non adhésive avec douceur caractéristiques et dimensions spécifiques6,7,17.
Nous avons déjà indiqué un système de fabrication personnalisée agarose annulaire ensemencement des cellules puits d’après un moulage négatif de PDMS dans un polycarbonate blanchi moule7,18. Agarose a été versé dans le négatif PDMS et autorisé à fixer7,18. Les cellules ont été ensuite ensemencées dans les puits du gel d’agarose, où elles agrégées pour former Self-assemblé, anneaux tissu exempte d’échafaudage en moins de 24h7,18. PDMS négatifs sont stérilisables en autoclave, peuvent être réutilisés plusieurs fois et sont doux et souple, rendant facile à enlever les puits d’agarose solidifiée. Lorsque ce système a été initialement signalé dans Gwyther et al. 7, PDMS négatifs furent jetés de blanchi moules en polycarbonate (Figure 1 a). Après d’agarose coulée, les puits de semis de cellule ont été individuellement découper et placés dans des puits d’une plaque de 12 puits7,18. La conception a été plus récemment modifiée de sorte qu’un moule unique d’agarose produit 5 feux et s’inscrit dans un puits d’une plaque 6 puits, éliminant le besoin de découper des puits individuels et en réduisant la quantité de PDMS et d’agarose pour produire chaque anneau (Figure 1 b). Une cellule plus petite largeur de creux l’ensemencement a été utilisée pour réduire le nombre de cellules ensemencées nécessaire pour obtenir la formation d’anneau. Malgré ces changements, la résolution et la personnalisation des moules se limitaient à la fraise standard disponibles dimensions et microfraisage peut être prohibitif. En outre, usinage de commande numérique (CNC) ordinateur peut prendre votre temps et encombrant en raison de la nécessité de réserver du temps sur fortement utilisé équipement personnalisé, logiciel supplémentaire fabrication assistée par ordinateur (FAO) pour convertir la conception assistée par ordinateur ( Fichier de CAO) vers une trajectoire d’outil programmable et une fixation fiable de la partie en polycarbonate lors de l’usinage.
Dans la présente étude, nous avons examiné l’utilisation de l’impression 3D comme alternative à l’usinage CNC. L’impression 3D est employé couramment pour des implants ingénieries personnalisés, fabrication de matériel d’échafaudage et pour l’impression directe des cellules et des tissus sphéroïdes15,19,20. Nous avons utilisé une imprimante haute résolution 3D et 3D spécialisés d’impression de matériel qui nous a permis d’imprimer un moule rigide avec une surface lisse, brillant finition (voir la Table des matières). Notre technique permet pour la fabrication de moules à matières plastiques hautement personnalisables, à haute résolution qui peut être utilisé pour effectuer le cast PDMS négatifs et les puits du gel d’agarose. Itérations de conception sont résumées dans la Figure 1. La conception du moule a été modifiée dans la version imprimée 3D moule afin d’inclure les murs extérieurs coniques et un trou central pour faciliter l’enlèvement de deux les négatifs PDMS de moules 3D-imprimés et les puits d’agarose de PDMS négatifs. Ces fonctionnalités coniques sont impossibles à norme procédés d’usinage. La distance entre le fond des puits au fond du moule a augmenté dans cette itération, résultant dans un gel d’agarose plus épaisse base ci-dessous les postes pour réduire le risque de rupture en cours d’agarose bien suppression de messages. La procédure de fabrication de moule et anneau montre schématiquement à la Figure 2.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>15-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroWhite</td>
			<td>StrataSys</td>
			<td>RGD835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>StrataSys</td>
			<td>Objet 260 Connex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>15-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16000069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-015-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-000-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-strep</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-900-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WKY 3M-22 rat aortic smooth muscle cells</td>
			<td>Provided by T. Wight [ref 21]</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of custom agarose wells for cell seeding and tissue ring self-assembly using 3d-printed molds

Ingénierie des tissus sont utilisés cliniquement pour le remplacement et la réparation des tissus et sont développées comme outils de dépistage des drogues et la modélisation des maladies humaines. Tissus auto-assemblés offrent des avantages sur l’ingénierie axée sur l’échafaud le tissu, tels que les dépôts de matrice améliorée, la force et la fonction. Cependant, il y a quelques méthodes disponibles pour la fabrication de tissus 3D sans ensemencement des cellules ou dans un échafaudage de prise en charge. Auparavant, nous avons développé un système de fabrication d’anneaux tissu auto-assemblés en ensemençant des cellules dans les puits d’agarose non-adhésifs. Un polydiméthylsiloxane (PDMS) négatif a été tout d’abord coulé dans un moule en polycarbonate usiné, et puis agarose a été gélifié dans le PDMS négatif pour créer la cellule en forme d’anneau, ensemencement des puits. Toutefois, la polyvalence de cette approche était limitée par la résolution des outils disponibles pour l’usinage du moule en polycarbonate. Ici, nous démontrons que plastique imprimés 3D peut servir comme alternative au polycarbonate usiné pour fabriquer des négatifs PDMS. Les moisissures 3D-imprimés et révisé la conception est plus simple à utiliser, peu coûteux à produire et nécessite beaucoup moins d’agarose et PDMS par cellule semis bien. Nous avons démontré que les puits d’agarose qui en résultent peuvent être utilisés pour créer des tissus auto-assemblés anneaux avec des diamètres personnalisés d’une variété de différents types de cellules. Anneaux puis peut être utilisé que pour l’analyse histologique, mécanique et fonctionnelle, ou pour la fabrication de tissus tubulaires plus grandes et plus complexes.

Ce système permet le simple, fabrication sur mesure de cellule d’agarose ensemencement des puits qui permet aux cellules auto-assemblage de 3D en forme d’anneau conçu des tissus. L’impression 3D permet de meilleure résolution et une plus grande flexibilité dans la conception du moule que l’usinage en polycarbonate, où les dimensions sont limitées par la taille de l’outil disponible. Avec une imprimante 3D à haute résolution, parois minces comme 0,254 mm peuvent être imprimés, et dimensions de la cuve sont limitées que par la résolution de l’imprimante (15,2 µm résolution pour ces études). En général, CNC endmills inférieur à 0,3 mm ne sont pas disponibles dans le commerce, n’est pas possible de créer des creux de plus petites largeurs. Micro-fraisage peut produire des petits éléments, même si l’équipement nécessaire peut être excessivement coûteux ou inaccessibles pour de nombreux laboratoires de recherche biomédicale. Courbure et les dimensions de la cuve sont également limitées par la forme de pointe de fraise. En outre, caractéristiques tels que coudé ou murs coniques ne sont pas possibles, et petits éléments peuvent se briser au cours du processus d’usinage.
Dessins CAO peuvent être facilement modifiés pour produire des moules 3D-imprimés et négatifs PDMS de dimensions personnalisables. La figure 3 décrit les dimensions de notre actuel 2 mm post imprimés 3D moules, par rapport aux précédentes itérations de conception. Le processus est peu coûteux ; le 2 mm, 5-bague imprimés 3D moule coût 44,67 USD à l’impression 3D et chaque partie peuvent servir à créer plusieurs négatifs PDMS. A ce jour, nous avons créé plus de 30 négatifs PDMS partir d’un seul moule 3D-imprimés. Chaque négatif nécessite 25 g de PDMS à 0,11 USD par g (2,75 USD par PDMS négatif). Chaque négatif PDMS peut être nettoyé avec un détergent, stérilisés à l’autoclave et réutilisé pour plusieurs années, selon la fréquence d’utilisation. Par rapport à l’original design18, le moule 3D-imprimé compact utilise considérablement moins PDMS et agarose par anneau de tissu de 2 mm (Figure 1E).
Les cellules ensemencées dans les puits d’agarose équilibré agrégées aux cercles de tissu de forme en moins de 24 h. anneau dimensions dépendent de la dimension des puits d’agarose. Ici, nous avons démontré que les anneaux de cellules musculaires lisses auto-assemblés rat peut être fabriqué dans les puits avec 2, 4 ou postes de diamètre 12 mm (Figure 4). Alors que les anneaux dans cette étude ont été seulement cultivés pendant 3 jours, nous avons précédemment cultivées hSMC anneaux pour jusqu'à 2 semaines22et hMSC-cartilage anneaux pour jusqu'à 3 semaines13. Comme indiqué précédemment, anneaux puisse fonctionner comme modèles de 3D in vitro de tissus humains pour une évaluation quantitative du tissu fonctionnent11 et résistance mécanique13,22et peuvent également servir comme unités de construction modulaire générer des tissus tubulaires constructions7,13. Conditions de semis de cellules et des attributs fonctionnels des anneaux de tissu conçu à partir de ces types de cellules sont résumées dans le tableau 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig1.jpg"> Figure 1 : dessins de moule Polycarbonate. Au départ, les moules de 15 puits ont été usinées en polycarbonate (A). Versions ultérieures a comporté une conception plus compacte (B), avec 5 puits conçus pour s’adapter dans un moule unique en polycarbonate et dans un puits d’une plaque de 6 puits. Ici, nous avons modifié cette conception à utiliser 3D-imprimés en plastique comme une alternative plus personnalisable à usinées en polycarbonate (C). Il est indiqué en (D) puits d’agarose fabriqués à partir de la première conçoivent18 (à gauche) par rapport à l’actuel format compact (à droite), qui nécessite beaucoup moins d’agarose et ne nécessite pas de séparation manuelle des puits. Quantités de PDMS et d’agarose requis pour chaque itération de conception sont indiquées dans (E). Centre de messages sont de 2 mm de diamètre. Moule à (A) est de 6 cm x 12 cm, (B) a un diamètre de 5 cm, et (C) a un diamètre de 6 cm. Barre d’échelle en (D) = 3 cm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig1large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig2.jpg"> Figure 2 : Fabrication d’anneaux de tissu auto-assemblés. Un moule 3D-imprimé est utilisé pour monter un négatif PDMS, qui est ensuite utilisé pour monter les puits du gel d’agarose (A). Les cellules sont alors semés directement dans les puits d’agarose, où ils se regroupent en moins de 24 h aux cercles de tissu de forme (B). Les lignes pointillées dans (B) montrent le contour bien. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig3.jpg"> Figure 3 : vue en coupe de dessin 3D-imprimé moule CAD. Dimensions pour la largeur de creux (A), hauteur (B) de la fosse, trou central (C), diamètre total (D), lèvre externe (E) et hauteur (F) de la paroi extérieure sont indiquées. Les murs extérieurs (1), la partie supérieure des puits (2) et trou central (3) sont effilés (à un angle de 5 ° pour 1 à 3, 45 ° pour 2) pour améliorer la facilité de retrait négatif de PDMS. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig4.jpg"> Figure 4 : dessins de CAO avec des correspondants PDMS négatifs et auto-assemblés anneaux SMC avec 2 (A) et 4 (B) 12 mm (C) poste diamètres. (A), (1) indique une encoche pour fournir de l’orientation, (2) indique un trou central pour améliorer la perfusion, (3) est un numéro de dossier qui imprime directement sur les négatifs PDMS, et (4) montre le cercle extérieur de mur, qui est effilé pour faciliter le retrait négatif de PDMS. Échelle des barres dans les puits du gel d’agarose = 1 cm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig4large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Type de cellule</td>
			<td>Cellules ensemencées par anneau</td>
			<td>Diamètre de l’anneau</td>
			<td>Durée de la culture</td>
			<td>Analyse fonctionnelle</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rat SMC</td>
			<td>0,5, 1 ou 3 x 106
</td>
			<td>2, 4 ou 12 mm</td>
			<td>3 jours</td>
			<td>Étude en cours ; N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>
iPSC dérivé SMC 11
</td>
			<td>0,6 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>17 jours</td>
			<td>Tests de contractilité, essai de traction uniaxiale, analyse histologique</td>
		</tr>
<tr>
<td>
SMC humaine 22
</td>
			<td>0,4 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>2, 7 ou 14 jours</td>
			<td>Essai de traction uniaxiale, analyse histologique</td>
		</tr>
<tr>
<td>
MSC humaine 14
</td>
			<td>0,4 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>21 jours</td>
			<td>Essai de traction uniaxiale, analyse histologique, fusion de l’anneau et compression tube stable, une différenciation du tissu cartilagineux</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Nombre de cellules nécessaires à la fabrication de la bague de différents types de cellules.

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Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Ce protocole décrit une plate-forme de fabrication d’anneaux de tissu auto-assemblés dans des tailles variables à l’aide d’un moule en plastique personnalisé imprimés 3D. PDMS négatifs sont guéris dans le moule 3D-imprimés ; puis agarose est coulé dans les négatifs PDMS durcis. Les cellules sont ensemencées dans les puits d’agarose qui en résulte, où ils agrègent des anneaux de tissu.

Fabrication de puits d’Agarose personnalisé pour l’ensemencement de la cellule et l’anneau de tissu auto-assemblage à l’aide de moules 3D-imprimé

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