Name: fabrication of custom agarose wells for cell seeding and tissue ring self-assembly using 3d-printed molds
Uploaded: 2018-04-02T12:30:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds at JoVE.com

हम आभार डॉ एरिका Stults (अकादमिक अनुसंधान और आवेदन वैज्ञानिक, WPI सूचना प्रौद्योगिकी सेवाओं) 3d प्रिंटिंग, Amanda Zoë Reidinger, पीएच. डी., क्रिस Nycz, और करेन लेवी, एमई के साथ उसकी सहायता के लिए स्वीकार करते हैं, मोल्ड डिजाइन पर अपने इनपुट के लिए, कैथी Suqui और जेनिफर मान उनकी सहायता परीक्षण मोल्ड डिजाइन के लिए, और माइकल O'Keefe फिल्माने के साथ उनकी सहायता के लिए ।  यह काम NSF IGERT डीजीई ११४४८०४ (MWR, has), NIH R15 HL097332 (MWR, टः), NSF रीउ EEC0754996 (बा), NIH 1R01 EB023907 (MWR, has) और NIH R15 HL137197 (MWR, has) द्वारा समर्थित किया गया ।
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1.3d-प्रिंटेड मोल्ड तैयार करना
<ol><li>वांछित आयाम में मोल्ड के एक सीएडी ड्राइंग तैयार करें ।</li>
	<li>एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3d प्रिंटर के लिए CAD फ़ाइल भेजें । उपयुक्त प्लास्टिक मुद्रण सामग्री का चयन करें, चमकदार खत्म के साथ ।</li>
	<li>छपाई के बाद, अच्छी तरह से डिटर्जेंट और पानी के साथ मोल्ड धो लो ।</li>
</ol>2. कास्टिंग PDMS निगेटिव
<ol><li>एक संतुलन पर PDMS आधार की वांछित राशि को मापने । एक 60 मिमी व्यास और 2 मिमी अच्छी तरह से पदों के साथ एक मोल्ड के लिए, 25 जी का उपयोग करें ।</li>
	<li>एक 1:10 पर इलाज एजेंट जोड़ें (डब्ल्यू/PDMS आधार पर अनुपात/</li>
	<li>जोरदार हलचल जब तक दो घटकों को अच्छी तरह से संयुक्त कर रहे हैं । अपर्याप्त मिश्रण PDMS का अधूरा इलाज में परिणाम, एक "चिपचिपा" सतह में जिसके परिणामस्वरूप हो सकता है ।</li>
	<li>मुद्रित कुओं के ऊपर एक PDMS आधार परत के गठन को सक्षम करने के लिए, 3 डी-मुद्रित molds की सीमा के आसपास प्रयोगशाला टेप का एक टुकड़ा प्लेस ।</li>
	<li>मोल्ड में PDMS मिश्रण डालो और एक वैक्यूम कक्ष में मोल्ड प्लेस करने के लिए गैस डे जब तक सभी बुलबुले जारी कर रहे हैं ।</li>
	<li>2 के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर PDMS इलाज-4 एच, या जब तक जम काफी दूर करने के लिए ।</li>
	<li>लैब टेप निकालें और ध्यान से PDMS नकारात्मक निकालें ।</li>
	<li>एक अतिरिक्त 1 एच के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर PDMS मशीन (3d मुद्रित मोल्ड से हटाने के बाद) मोल्ड पूरी तरह ठीक हो गया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए ।</li>
	<li>किसी भी अवशेष को हटाने के लिए डिटर्जेंट और पानी के साथ अच्छी तरह से PDMS धो लें । अपर्याप्त धोने PDMS नकारात्मक के पहले का उपयोग करता है के लिए गरीब अंगूठी गठन में परिणाम हो सकता है ।</li>
</ol>3. गढ़े Agarose वेल्स
<ol><li>तैयार agarose वेल्स 1 दिन पहले बीज बोने की कोशिकाओं के लिए ।</li>
	<li>DMEM और आटोक्लेव में 2% (w/v) agarose समाधान करें ।</li>
	<li>प्लास्टिक 4 मिलीलीटर पिघला हुआ agarose एक autoclaved PDMS नकारात्मक में । इसके बाद प्लास्टिक agarose सीधे PDMS निगेटिव के पदों पर हैं । एक प्लास्टिक टिप के साथ किसी भी हवा में बुलबुले निकालें, के रूप में बुलबुले अच्छी तरह से आयामों में सजातीयता के कारण हो सकता है ।</li>
	<li>नोट: मोल्डों को न भरें; agarose के शीर्ष सतह फ्लैट होना चाहिए, ताकि agarose कुओं PDMS और प्लेसमेंट से 6 में अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट हटाने पर स्तर होगा । बचे हुए agarose पुनः autoclaved और फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि एक बार से अधिक नहीं है ।</li>
	<li>बाद agarose ठंडा (4 मिलीलीटर agarose के लिए लगभग 10 मिनट; बड़े molds अब ठंडा समय की आवश्यकता हो सकती है), ध्यान से PDMS कुंद संदंश का उपयोग कर नकारात्मक से agarose कुओं को अलग और एक अच्छी तरह से प्लेट के एक कुआं में स्थानांतरण ।</li>
	<li>पूरा संस्कृति माध्यम में agarose कुओं जलमग्न है, और एक 37 डिग्री सेल्सियस में रातोंरात equilibrate का उपयोग करने से पहले ।</li>
</ol>4. ऊतक के छल्ले बोने
<ol><li>संस्कृति चूहा महाधमनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं21 (RaSMCs) DMEM में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1% L-glutamine, 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, 1% सोडियम पाइरूवेट, और 1% पेनिसिलिन-streptomycin से युक्त वे 70% संगम तक पहुँचने. नोट: कोशिकाओं को 5% CO2 और 37 डिग्री सेल्सियस में 15 सेमी टिशू कल्चर प्लेट्स में कल्चरित किया जाना चाहिए ।</li>
	<li>मोल्ड्स के बाद equilibrated (सेक्शन 3) होते हैं, सीडिंग के लिए RaSMCs तैयार करते हैं.</li>
	<li>कुल्ला प्लेटें फॉस्फेट की थाली प्रति 5 मिलीलीटर के साथ दो बार-खारा (पंजाब) ।</li>
	<li>इसमें 3 एमएल 0.25% trypsin प्रति 15 सेमी पेट्री डिश डालें । 2-3 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस मशीन के लिए प्लेटों हटो, या जब तक कोशिकाओं से प्लेट उठा लिया है ।</li>
	<li>पूर्ण संस्कृति माध्यम की एक बराबर मात्रा (प्लेट प्रति 3 मिलीलीटर) के साथ trypsin बेअसर । कोशिकाओं के झुरमुट को तोड़ने के लिए अच्छी तरह से reसस्पेंड ।</li>
	<li>trypan ब्लू डाई के साथ सेल निलंबन 1:1 के एक aliquot पतला, और एक hemocytometer के साथ कोशिकाओं की गिनती ।</li>
	<li>200 एक्स जी में 5 मिनट के लिए सेल निलंबन की कुल मात्रा की गोली कोशिकाओं को केंद्रापसारक ।</li>
	<li>१०,०००,००० कोशिकाओं प्रति मिलीलीटर की एकाग्रता पर कोशिकाओं reसस्पेंड; यह 50 µ प्रति 500,000 कोशिकाओं में परिणाम होगा l नोट: भिन्न कक्ष प्रकारों के लिए विभिन्न कक्ष सांद्रता की आवश्यकता हो सकती है.</li>
	<li>agarose मोल्ड से सभी मीडियम महाप्राण. व्यक्तिगत कुओं से सभी माध्यमों को हटाने के लिए सावधानी बरतें, लेकिन कुएँ के नीचे की ओर पंक्चर न होने दें.</li>
	<li>प्लास्टिक प्रत्येक कुआं में सस्पेंशन का 50 µ l</li>
	<li>ध्यान से agarose मोल्ड के बाहर के आसपास ताजा मध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें । agarose के कुओं में मध्यम ओवरफ्लो न होने देने के लिए सावधान रहें । रात भर मशीन में प्लेट प्लेस (लगभग 16 एच) ।</li>
	<li>रात भर की गर्मी के बाद, मोल्ड्स के बाहर से मीडियम को महाप्राण, और 6-वेल प्लेट के प्रत्येक चहेतों को 4.5 mL फ्रेश मीडियम जोड़ें ताकि मोल्ड्स और रिंग्स पूरी तरह से जलमग्न हो जाएं । मध्यम दैनिक बदलें ।</li>
</ol>

<ol>
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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Engineered+Vascular+Rings+from+Human+iPSC-Derived+Smooth+Muscle+Cells.">Tissue-Engineered Vascular Rings from Human iPSC-Derived Smooth Muscle Cells.</a> Stem Cell Reports. 7 (1), 19-28 (2016).</li><li>Heureux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+tissue-engineered+vascular+media:+a+new+model+for+pharmacological+studies+of+contractile+responses.">A human tissue-engineered vascular media: a new model for pharmacological studies of contractile responses.</a> FASEB J. 15, 515-524 (2001).</li><li>Dikina, A. D., Strobel, H. A., Lai, B. P., Rolle, M. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+characterization+of+electrospun+polycaprolactone+and+gelatin+composite+cuffs+for+tissue+engineered+blood+vessels.">Fabrication and characterization of electrospun polycaprolactone and gelatin composite cuffs for tissue engineered blood vessels.</a> JBMR Part B. , (2017).</li><li>Napolitano, A. P., Chai, P., Dean, D. M., Morgan, J. 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लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

यहां हम स्वयं के तेजी से निर्माण के लिए एक बहुमुखी विधि प्रस्तुत किया है, आसानी से अनुकूलित 3 डी मुद्रण का उपयोग आयामों के साथ इकट्ठा ऊतक के छल्ले । हमारा तरीका है कि Svoronos एट अलमें सूचना के समान है । ६ , जहां 3d मुद्रित छत्ते और कुत्ते की हड्डी के आकार का मोम मोल्ड PDMS नकारात्मक कास्ट करने के लिए इस्तेमाल किया गया । हालांकि, कई अद्वितीय डिज़ाइन सुविधाओं को शामिल करने के लिए मोल्ड्स को संशोधित किया गया है । एक पायदान (चित्र 4a(1)) मोल्ड के अभिविंयास प्रदान करता है प्रत्येक अंगूठी को लेबल और व्यक्तिगत रूप से निगरानी की अनुमति देते हैं । सेंट्रल होल (चित्रा 4a(2)) कुओं में मध्यम के प्रसार में सुधार में मदद करता है. सीएडी फ़ाइल संख्या सीधे मोल्ड पर मुद्रित कर रहे हैं; इसलिए, PDMS नकारात्मक प्रत्येक संस्करण संख्या और पोस्ट व्यास के साथ लेबल (चित्रा 4A3) हैं । पतला बाहरी दीवारों (चित्रा 3(1), 5 °), अच्छी तरह से गर्त के शीर्ष पर (चित्रा 3(2), 45 °), और सेंट्रल होल (चित्रा 3(3), 5 °) 3 डी-प्रिंटेड मोल्ड्स से PDMS निगेटिव को दूर करना आसान बनाएं , और agarose कुओं को PDMS नकारात्मक (चित्र 4a(2), एक (4)) से निकालने के लिए आसान कर रहे हैं ।
हमने इस प्रणाली की बहुमुखी प्रतिभा का प्रदर्शन किया है, जिसमें प्राथमिक मानव चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (SMCs)18,22, चूहे महाधमनी SMCs7 सहित व्यास और कोशिका प्रकार की विभिन्न प्रकार के ऊतकों के आकार के ऊतक इकट्ठे किए गए हैं । , 23, मानव mesenchymal स्टेम सेल (hMSCs)13, और SMCs प्रेरित pluripotent स्टेम सेल से व्युत्पंन (iPSCs)11 (तालिका 1) । चल रहे काम में, हम ऐसे endothelial कोशिकाओं के रूप में अतिरिक्त सेल प्रकार से छल्ले के गठन का मूल्यांकन कर रहे हैं, और सांस प्रतिस्थापन में संभावित अनुप्रयोगों के लिए अलग आकार के उपास्थि छल्ले से इनकार । पूरी तरह से सेल व्युत्पंन निर्माण के अलावा, हम भी इस प्रणाली का इस्तेमाल किया है शामिल पार से जुड़ा हुआ जिलेटिन microspheres13,22के साथ छल्ले बनाना । Microspheres के दौरान ऊतक के छल्ले के भीतर शामिल किया जा सकता है स्वयं विधानसभा के दौरान अतिरिक्त यांत्रिक शक्ति प्रदान करने के लिए, या विकास कारकों के स्थानीयकृत प्रसव के लिए13,22।
जब ऊतक के छल्ले गढ़े, सेल संख्या का अनुकूलन विभिंन प्रकार के सेल के लिए आवश्यक हो सकता है । कक्षों के आकार और प्रकार के आधार पर ंयूनतम कक्ष संख्याएं भिंन हो सकती हैं । उदाहरण के लिए, iPSCs से व्युत्पंन hSMCs ६००,००० कोशिकाओं पर वरीयता प्राप्त कर रहे है/अंगूठी11, hMSCs और प्राथमिक hSMCs गल्ले कोशिकाओं/अंगूठी13,22, और चूहे महाधमनी SMCs में बीज के लिए कर रहे है 500,000/ गर्त आयाम भी अंगूठी गठन और अंगूठी गठन के लिए आवश्यक कोशिकाओं की ंयूनतम संख्या24प्रभावित हो सकता है । मानव कोशिकाओं और 3d-मुद्रित मोल्ड के साथ अध्ययन के लिए, 2 मिमी के गर्त चौड़ाई का इस्तेमाल किया गया था । मूल पाली कार्बोनेट मोल्ड 3.75 mm, जो ७५०,००० hSMCs की आवश्यकता के गर्त चौड़ाई था एक 2 मिमी सेल की अंगूठी18फार्म । कम गर्त चौड़ाई के साथ, हम को 46% से अंगूठी गठन के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या को कम करने में सक्षम थे, अंगूठी25प्रति गल्ले कोशिकाओं के लिए । प्रति रिंग वरीयता प्राप्त कक्षों की मात्रा तालिका 1में सारांशित की जाती है ।
जब एक 3d मुद्रित सामग्री का चयन, कई कारकों पर विचार करने की आवश्यकता है । क्योंकि PDMS आम तौर पर 60 डिग्री सेल्सियस पर ठीक हो जाता है, 3d-मुद्रित सामग्री PDMS इलाज के दौरान क्षति से बचने के लिए एक उच्च पर्याप्त पिघलने तापमान होना चाहिए । इस अध्ययन में प्रयुक्त सामग्री के पिघलने तापमान (एक मालिकाना सामग्री, सामग्री की तालिकादेखें) उपलब्ध नहीं है । हालांकि, जब 1 घंटे के लिए 60 ° c पर बेक किया हुआ, हम सामग्री एक गंध का उत्पादन करने के लिए शुरू हुआ कि मनाया । इस प्रकार, हम 50 डिग्री सेल्सियस के लिए इलाज के तापमान को कम करने और 3 डी मुद्रित सामग्री को नुकसान पहुंचाए बिना PDMS सेंकना करने के लिए इलाज के समय में वृद्धि करने का फैसला किया । अगर molds बड़ा PDMS नकारात्मक फार्म के लिए संशोधित कर रहे है इलाज के समय में समायोजन आवश्यक हो सकता है । 3 डी-मुद्रित molds से PDMS हटाने के बाद 60 ° c पर एक अतिरिक्त इलाज की अवधि शेष चिपचिपा से अंतिम PDMS नकारात्मक रोकता है, जबकि तापमान 3 डी-मुद्रित मोल्ड को उजागर है सीमित । ध्यान दें कि कुछ सामग्री PDMS के इलाज को बाधित है, तो सुनिश्चित करें कि चयनित सामग्री PDMS के साथ संगत है । अंत में, मोल्ड सामग्री विषाक्तता पर भी विचार किया जाना चाहिए । जबकि 3 डी-मुद्रित मोल्ड कोशिकाओं के साथ सीधे संपर्क में नहीं होगा, यह संभव है कि मोल्ड से कुछ अवशेषों इलाज प्रक्रिया के दौरान PDMS नकारात्मक को हस्तांतरित किया जा सकता है । हमने पाया है कि बहुत पूरी तरह से डिटर्जेंट के साथ धोने के लिए PDMS नकारात्मक से किसी भी अवशेषों को दूर पर्याप्त था । हालांकि, हमने पहले देखा है कि अपर्याप्त धोने agarose कुओं में गरीब अंगूठी गठन के लिए नेतृत्व में पहले कुछ का उपयोग करता है के लिए नकारात्मक PDMS । अंय 3d-मुद्रित सामग्री से PDMS कास्ट का उपयोग अतिरिक्त जांच की आवश्यकता को सत्यापित करने के लिए कि डिटर्जेंट मोल्ड अवशेषों को हटाने के लिए पर्याप्त है, किसी भी संभावित leachates सहित हो सकता है । आवधिक परीक्षण भी आवश्यक हो सकता है, के रूप में यह संभव है कि दोहराया हीटिंग चक्र (यहां तक कि 50 डिग्री सेल्सियस) मोल्ड नुकसान हो सकता है समय के साथ, और कारण के अवशेषों में दोहराया उपयोग के बाद बढ़ जाती है । तारीख करने के लिए, हम एक एकल 3d मुद्रित मोल्ड का उपयोग किया है अधिक से अधिक 30 PDMS नकारात्मक है कि सफलतापूर्वक ऊतक के छल्ले उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है उपज ।
कुल मिलाकर, 3 डी मुद्रण पाली की मशीनिंग से agarose molds के निर्माण के लिए अधिक से अधिक बहुमुखी प्रतिभा की अनुमति देता है । यह टूलींग के साथ संभव है की तुलना में एक उच्च संकल्प प्रदान करता है, और मोल्ड डिजाइन उपलब्ध उपकरणों के आयामों द्वारा सीमित नहीं है । यह अधिक से अधिक अनुकूलन के लिए अनुमति देता है, और ऐसे पतला है कि मशीनिंग के साथ संभव नहीं हो सकता है के रूप में सुविधाओं के अलावा । इस प्रणाली के रूप में अच्छी तरह से अंय आकार में आत्म इकट्ठे ऊतकों, के छल्ले के अलावा6,17के निर्माण के लिए लागू किया जा सकता है । अंगूठी निर्माण विधि का प्रयोग, हम सेल प्रकार और आकार की एक किस्म से सांस ऊतक इंजीनियरिंग में संभावित अनुप्रयोगों के लिए ऊतक के छल्ले विकसित किया है13, इंजीनियर रक्त वाहिकाओं7, और मॉडलिंग संवहनी रोगों11.

सेलुलर स्वयं विधानसभा ऊतक इंजीनियर रक्त वाहिकाओं के निर्माण के लिए दृष्टिकोण पाड़ के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण आधारित हैं । स्व इकट्ठे, पाड़-मुक्त ऊतकों अधिक से अधिक सेल घनत्व, बढ़ाया मैट्रिक्स जमाव और शक्ति हो सकता है, और बेहतर जैविक समारोह पाड़ आधारित ऊतकों की तुलना में1,2,3,4 . हालांकि, विशिष्ट आकार और आकार के साथ exogenous पाड़ समर्थन के उपयोग के बिना 3 डी ऊतकों के गठन एक चुनौती बनी हुई है । कुछ तरीकों को एक साथ सेल शीट की परतों फ्यूज को मोटा निर्माण फार्म, हालांकि इस प्रक्रिया को समय लगता है और श्रम गहन5हो सकता है । वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को गैर चिपकने वाले मोल्ड में वरीयता प्राप्त किया जा सकता है और spheroids, अंगूठियां, और अंय ऊतक आकार6,7,8में समग्र करने की अनुमति दी ।
स्व-इकट्ठे ऊतक के छल्ले कम कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, कम संस्कृति बार, और बड़ा ट्यूबलर इंजीनियर ऊतकों की तुलना में कम रिएजेंट, लेकिन अभी भी यांत्रिक परीक्षण किया जा सकता है, histologically की जांच, या सिकुड़ना और अंय कार्यात्मक परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया7 , 9 , 10 , 11. क्योंकि वे तेजी से गढ़े और आसानी से परीक्षण किया जा सकता है, ऊतक के छल्ले संस्कृति मापदंडों की बड़ी संख्या स्क्रीनिंग के लिए आदर्श होते हैं, और रोग मॉडल11 या दवा स्क्रीनिंग12के लिए उपकरण के रूप में उपयोग के लिए संभावित है । इसके अतिरिक्त, छल्ले रक्त वाहिकाओं या श्वासनली7,13के रूप में और अधिक जटिल ऊतक संरचनाओं में इनकार किया जा सकता है, और छल्ले spheroids14,15जैसे अंय आकृतियों की तुलना में अधिक पूरी तरह से फ्यूज कर सकते हैं ।
Agarose व्यापक रूप से स्व-इकट्ठे अपनी असंगति, पारगम्यता, और गैर-कोशिका चिपकने वाले गुणों के कारण ऊतकों के निर्माण के लिए एक सांचे में ढालना सामग्री के रूप में प्रयोग किया जाता है । उदाहरण के लिए, Norotte एट अल. गढ़े agarose molds से बाहर निकाला छड़, जो मोल्ड आकार और आवश्यक विशेष उपकरण15पर सीमित नियंत्रण सक्षम होना चाहिए । टैन एट अल. विभिंन आकार (पिरामिड, स्क्वायर)16में कस्टम hydrogel molds बनाना करने के लिए निर्माण इकाइयों के रूप में जमा alginate बूंदें । हालांकि, alginate spheroids (300 µm) के बड़े व्यास कम संकल्प के साथ सुविधाओं के परिणामस्वरूप । ऐसा कम रिज़ॉल्यूशन असमान मोल्ड सतहों में परिणाम दे सकता है जो कोशिका एकत्रीकरण संगति को प्रतिकूल रूप से प्रभावित कर सकते हैं । वैकल्पिक रूप से, agarose बहुलक नकारात्मक में चिकनी सुविधाओं और विशिष्ट आयाम6,7,17के साथ गैर चिपकने वाला molds बनाने के लिए डाली जा सकता है ।
हम पहले कस्टम कुंडलाकार agarose सेल के निर्माण के लिए एक प्रणाली की सूचना दी एक PDMS नकारात्मक डाली से कुओं बोने की एक चक्की पाली कार्बोनेट मोल्ड में7,18। Agarose PDMS नकारात्मक में डाल दिया गया था और7,18सेट करने की अनुमति दी । कोशिकाओं को तो agarose वेल्स, जहां वे स्वयं के रूप में इकट्ठे, पाड़-मुक्त ऊतक 24 ज7,18से कम समय में छल्ले में वरीयता प्राप्त थे । PDMS नकारात्मक autoclavable हैं, कई बार reused किया जा सकता है, और नरम और लचीला कर रहे हैं, यह आसान जम agarose कुओं को दूर करने के लिए बना । जब इस सिस्टम को शुरू में Gwyther एट अल में रिपोर्ट किया गया था । 7, PDMS नकारात्मक (चित्रा 1a) milled पॉली मोल्ड्स से डाली गई । agarose कास्टिंग के बाद, सेल बीज वाले कुओं व्यक्तिगत रूप से काट रहे थे और एक 12 अच्छी प्लेट7,18के कुओं में रखा । डिजाइन और हाल ही में इस तरह के संशोधित किया गया था कि एक एकल agarose मोल्ड 5 के छल्ले का उत्पादन और एक कुआं में फिट बैठता है एक 6-अच्छी तरह से प्लेट, बाहर व्यक्तिगत कुओं में कटौती और PDMS और agarose की मात्रा को कम करने की आवश्यकता को नष्ट करने के लिए प्रत्येक अंगूठी (चित्र 1b) का उत्पादन । एक छोटे कोशिका बोने की गर्त चौड़ाई के लिए अंगूठी गठन को प्राप्त करने के लिए आवश्यक बीज वाले कोशिकाओं की संख्या को कम करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । इन परिवर्तनों के बावजूद, संकल्प और मोल्ड के अनुकूलन उपलब्ध मानक endmill आयामों को प्रतिबंधित किया गया है, और micromilling नकारात्मक स्तर तक महंगा हो सकता है । इसके अतिरिक्त, कंप्यूटर संख्यात्मक नियंत्रण (सीएनसी) मशीनिंग समय लेने और बोझिल भारी उपयोग कस्टम उपकरणों पर समय आरक्षित करने की आवश्यकता के कारण हो सकता है, अतिरिक्त कंप्यूटर सहायता प्राप्त विनिर्माण (सांचा) सॉफ्टवेयर को कंप्यूटर सहायता प्राप्त डिजाइन कंवर्ट ( सीएडी) एक प्रोग्राम उपकरण पथ के लिए फ़ाइल, और मशीनिंग के दौरान पाली कार्बोनेट भाग के विश्वसनीय fixturing ।
वर्तमान अध्ययन में, हम सीएनसी मशीनिंग के लिए एक विकल्प के रूप में 3 डी मुद्रण के उपयोग की जांच की । 3 डी मुद्रण व्यापक रूप से इंजीनियरिंग कस्टम प्रत्यारोपण के लिए प्रयोग किया जाता है, पाड़ सामग्री बनाना, और कोशिकाओं और ऊतक spheroids के प्रत्यक्ष मुद्रण के लिए15,19,20। हम एक उच्च संकल्प 3 डी प्रिंटर का इस्तेमाल किया, और विशेष 3 डी मुद्रण सामग्री है कि हमें एक चिकनी, चमकदार सतह खत्म ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ एक कठोर मोल्ड मुद्रित करने के लिए सक्षम होना चाहिए । हमारी तकनीक अत्यधिक अनुकूलन, उच्च संकल्प प्लास्टिक molds कि कास्टिंग PDMS नकारात्मक और agarose कुओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के निर्माण के लिए अनुमति देता है । डिज़ाइन पुनरावृत्तियां चित्र 1में सारांशित की जाती हैं । मोल्ड डिजाइन और 3 डी-मुद्रित मोल्ड संस्करण में संशोधित किया गया था पतला बाहरी दीवारों और एक केंद्र छेद में शामिल करने के क्रम में 3 डी-मुद्रित molds और PDMS नकारात्मक से agarose कुओं से दोनों PDMS नकारात्मक के हटाने को कम करने के लिए । इन पतला सुविधाओं मानक मशीनिंग प्रक्रियाओं के साथ प्राप्त नहीं किया जा सकता है । कुओं के नीचे से मोल्ड के नीचे की दूरी इस चलना में वृद्धि हुई थी, पदों के नीचे एक मोटा agarose आधार में agarose अच्छी तरह से हटाने के दौरान तोड़ने के पदों के जोखिम को कम करने के लिए जिसके परिणामस्वरूप । मोल्ड और अंगूठी निर्माण प्रक्रिया योजनाबद्ध रूप से चित्रा 2में दिखाया गया है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>15-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroWhite</td>
			<td>StrataSys</td>
			<td>RGD835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>StrataSys</td>
			<td>Objet 260 Connex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>15-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16000069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-015-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-000-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-strep</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-900-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WKY 3M-22 rat aortic smooth muscle cells</td>
			<td>Provided by T. Wight [ref 21]</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of custom agarose wells for cell seeding and tissue ring self-assembly using 3d-printed molds

इंजीनियर ऊतकों नैदानिक ऊतक की मरंमत और प्रतिस्थापन के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, और दवा स्क्रीनिंग और मानव रोग मॉडलिंग के लिए उपकरणों के रूप में विकसित किया जा रहा है । स्व-इकट्ठे ऊतक पाड़ पर लाभ की पेशकश-आधारित ऊतक इंजीनियरिंग, बढ़ाया मैट्रिक्स जमाव, शक्ति, और समारोह के रूप में । हालांकि, वहां पर या एक सहायक पाड़ के भीतर कोशिकाओं बोने के बिना 3 डी ऊतकों के निर्माण के लिए कुछ उपलब्ध तरीके हैं । इससे पहले, हम गैर-चिपकने वाला agarose कुओं में कोशिकाओं सीडिंग द्वारा स्वयं इकट्ठे ऊतक के छल्ले के निर्माण के लिए एक प्रणाली विकसित की है । एक polydimethylsiloxane (PDMS) नकारात्मक पहले एक मशीनी पाली कार्बोनेट मोल्ड में डाली गई थी, और फिर agarose PDMS नकारात्मक में gelled अंगूठी के आकार का कोशिका बोने के कुओं बनाने के लिए किया गया था । हालांकि, इस दृष्टिकोण की बहुमुखी प्रतिभा पाली कार्बोनेट मोल्ड मशीन के लिए उपलब्ध उपकरणों के संकल्प द्वारा सीमित था । यहां, हम प्रदर्शित करते है कि 3 डी मुद्रित प्लास्टिक PDMS नकारात्मक गढ़े के लिए मशीनी पाली कार्बोनेट के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । 3d मुद्रित मोल्ड और संशोधित मोल्ड डिजाइन का उपयोग करने के लिए आसान है, उत्पादन करने के लिए सस्ती है, और अच्छी तरह से बोने की सेल प्रति काफी कम agarose और PDMS की आवश्यकता है । हमने दिखा दिया है कि जिसके परिणामस्वरूप agarose कुओं को स्वयं बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, अलग कोशिका प्रकार की एक किस्म से अनुकूलित व्यास के साथ ऊतक के छल्ले इकट्ठे । छल्ले तो यांत्रिक, कार्यात्मक, और ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण, या बड़े और अधिक जटिल ट्यूबलर ऊतकों के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

इस प्रणाली के सरल, अनुकूलित निर्माण के लिए अनुमति देता है agarose कोशिका बोने वाले कुओं है कि सेल आत्म-अंगूठी के आकार की विधानसभा 3d इंजीनियर ऊतकों को सक्षम बनाता है । 3 डी मुद्रण मशीनिंग पाली कार्बोनेट, जहां आयाम उपलब्ध उपकरण आकार से विवश कर रहे है से मोल्ड डिजाइन में बेहतर संकल्प और अधिक से अधिक लचीलापन की अनुमति देता है । एक उच्च संकल्प 3 डी प्रिंटर के साथ, दीवारों के रूप में पतली के रूप में ०.२५४ mm मुद्रित किया जा सकता है, और गर्त आयाम केवल प्रिंटर (इन अध्ययनों के लिए 15.2 µm संकल्प) के संकल्प के द्वारा ही सीमित हैं । आमतौर पर, सीएनसी endmills से कम 0.3 mm व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं, इसलिए यह संभव नहीं है छोटे चौड़ाई के गर्त बनाने के लिए । सूक्ष्म मिलिंग छोटे सुविधाओं का उत्पादन कर सकते हैं, हालांकि आवश्यक उपकरण नकारात्मक स्तर तक महंगी या कई जैव चिकित्सा अनुसंधान प्रयोगशालाओं के लिए दुर्गम हो सकता है । गर्त आयामों और वक्रता भी endmill टिप आकार द्वारा सीमित कर रहे हैं । इसके अतिरिक्त, जैसे angled या पतला दीवारों के रूप में सुविधाएं संभव नहीं हैं, और छोटे सुविधाओं मशीनिंग प्रक्रिया के दौरान टूट सकता है ।
सीएडी चित्र आसानी से 3 डी-मुद्रित molds और अनुकूलन आयामों के PDMS नकारात्मक उत्पादन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । चित्रा 3 पिछले डिजाइन पुनरावृत्तियों की तुलना में हमारे वर्तमान 2 मिमी पोस्ट 3 डी-मुद्रित molds के आयामों का वर्णन करता है । प्रक्रिया सस्ती है; 2 मिमी, 5-3 डी अंगूठी मुद्रित मोल्ड 3d प्रिंट के लिए ४४.६७ अमरीकी डालर की लागत, और प्रत्येक भाग के लिए कई PDMS नकारात्मक बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । तारीख करने के लिए, हम एक एकल 3d मुद्रित मोल्ड से अधिक 30 PDMS नकारात्मक बनाया है । प्रत्येक नकारात्मक प्रति जी 0.11 अमरीकी डालर पर PDMS के 25 ग्राम की आवश्यकता है (PDMS नकारात्मक के अनुसार 2.75 अमरीकी डालर) । प्रत्येक PDMS नकारात्मक डिटर्जेंट, autoclaved के साथ साफ किया जा सकता है, और फिर से कई वर्षों तक के लिए इस्तेमाल की आवृत्ति पर निर्भर करता है । मूल डिजाइन18की तुलना में, कॉंपैक्ट 3d मुद्रित मोल्ड 2 मिमी ऊतक की अंगूठी (चित्रा 1E) प्रति काफी कम PDMS और agarose का उपयोग करता है ।
कोशिकाओं equilibrated agarose वेल्स कुल में बीज से कम 24 ज. अंगूठी आयामों में ऊतक के छल्ले फार्म agarose कुओं के आयामों पर निर्भर हैं । यहां, हम प्रदर्शन किया है कि स्व-इकट्ठे चूहे चिकनी मांसपेशी सेल के छल्ले 2, 4, या 12 मिमी व्यास पदों (चित्रा 4) के साथ कुओं में गढ़े जा सकते हैं । जबकि इस अध्ययन में छल्ले केवल 3 दिनों के लिए, हम पहले से 2 सप्ताह22तक के लिए hSMC के छल्ले के लिए प्रसंस्कृत किया गया है, और hMSC-उपास्थि के छल्ले के लिए 3 सप्ताह13। के रूप में पहले बताया, छल्ले ऊतक समारोह11 और यांत्रिक शक्ति13,22, और भी मॉड्यूलर इमारत इकाइयों के रूप में सेवा कर सकते है की मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए मानव ऊतकों के इन विट्रो मॉडल में 3 डी के रूप में कार्य कर सकते है ट्यूब के आकार का ऊतक उत्पन्न7,13. कोशिका बोने की स्थिति और ऊतक के कार्यात्मक विशेषताओं के छल्ले के इन सेल प्रकार से इंजीनियर तालिका 1में संक्षेप हैं ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig1.jpg"> चित्रा 1: पाली कार्बोनेट मोल्ड डिजाइन । शुरू में, 15-अच्छी तरह से मोल्ड (ए) पाली कार्बोनेट में मशीन थे । बाद के संस्करणों के एक और कॉंपैक्ट डिजाइन (ख) विशेष रुप से प्रदर्शित 5 कुओं के साथ एक एकल पाली कार्बोनेट मोल्ड में फिट है, और एक अच्छी तरह से एक 6 के भीतर अच्छी तरह से थाली । यहां, हम इस डिजाइन संशोधित मशीनी पाली कार्बोनेट (सी) के लिए एक अधिक अनुकूलन विकल्प के रूप में 3 डी-मुद्रित प्लास्टिक का उपयोग करें । (घ) में दिखाया agarose कुओं प्रारंभिक डिजाइन18 (बाएं) से निर्मित कर रहे है मौजूदा कॉंपैक्ट डिजाइन (सही) है, जो काफी कम agarose की आवश्यकता की तुलना में, और कुओं के मैनुअल जुदाई की आवश्यकता नहीं है । प्रत्येक डिज़ाइन पुनरावृत्ति के लिए आवश्यक PDMS और agarose की मात्राएं (ई) में दिखाई जाती हैं । केंद्र के पदों व्यास में 2 मिमी हैं । मोल्ड में (एक) 6 सेमी x 12 सेमी है, (ख) एक 5 सेमी व्यास है, और (सी) एक 6 सेमी व्यास है । में स्केल बार (D) = 3 सेमी. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig1large.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig2.jpg"> चित्रा 2: स्वयं के निर्माण ऊतक के छल्ले इकट्ठे । एक 3d-मुद्रित मोल्ड एक PDMS नकारात्मक है, जो तो agarose वेल्स (a) कास्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है कास्ट करने के लिए इस्तेमाल होता है । कोशिकाओं को तो सीधे agarose कुओं, जहां वे कम 24 से अधिक में कुल ऊतक के छल्ले फार्म (बी) में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं । (B) में डैश्ड रेखाएं अच्छी बाह्यरेखा दिखाती हैं । <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig2large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig3.jpg"> चित्रा 3:3d प्रिंट मोल्ड सीएडी ड्राइंग के पार अनुभागीय दृश्य । गर्त चौड़ाई के लिए आयाम (एक), गर्त ऊंचाई (ख), केंद्र छेद (सी), कुल व्यास (डी), बाहरी होंठ (ई), और बाहरी दीवार ऊंचाई (एफ) दिखाया जाता है । बाहरी दीवारों (1), कुओं के ऊपरी भाग (2), और केंद्र छेद (3) पतला कर रहे हैं (1 और 3 के लिए एक 5 ° कोण पर, 2 के लिए 45 डिग्री) PDMS नकारात्मक हटाने की आसानी में सुधार करने के लिए. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig3large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig4.jpg"> चित्रा 4: सीएडी चित्र इसी PDMS नकारात्मक और स्वयं के साथ 2 (ए), 4 (ख), और 12 (ग) मिमी पोस्ट व्यास के साथ एसएमसी के छल्ले इकट्ठे । में (A), (1) अभिविंयास प्रदान करने के लिए एक पायदान इंगित करता है, (2) एक केंद्रीय छेद इंगित करता है छिड़काव में सुधार करने के लिए, (3) एक फ़ाइल संख्या है, जो PDMS नकारात्मक पर सीधे निशान है, और (4) बाहरी दीवार, जो PDMS नकारात्मक हटाने के लिए कम पतला है । agarose वेल्स में स्केल बार्स = 1 सेमी. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig4large.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>कक्ष प्रकार</td>
			<td>कक्ष प्रति रिंग वरीयता प्राप्त</td>
			<td>रिंग व्यास</td>
			<td>संस्कृति अवधि</td>
			<td>कार्यात्मक विश्लेषण प्रदर्शन</td>
		</tr>
<tr>
<td>चूहा एसएमसी</td>
			<td>0.5, 1, या 3 x 106
</td>
			<td>2, 4, या 12 मिमी</td>
			<td>3 दिन</td>
			<td>वर्तमान अध्ययन; N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>
iPSC व्युत्पंन एसएमसी 11
</td>
			<td>0.6 x 106
</td>
			<td>2 मिमी</td>
			<td>17 दिन</td>
			<td>सिकुड़ना परीक्षण, uniaxial तन्यता परीक्षण, ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण</td>
		</tr>
<tr>
<td>
मानव एसएमसी 22
</td>
			<td>0.4 x 106
</td>
			<td>2 मिमी</td>
			<td>2, 7, या 14 दिन</td>
			<td>Uniaxial तन्यता चाचणी, ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण</td>
		</tr>
<tr>
<td>
मानव एमएससी 14
</td>
			<td>0.4 x 106
</td>
			<td>2 मिमी</td>
			<td>21 दिन</td>
			<td>Uniaxial तन्यता परीक्षण, ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण, रिंग फ्यूजन और ट्यूब संपीड़न परीक्षण, उपास्थि ऊतक में भेदभाव</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 1: विभिन्न कक्ष प्रकारों से रिंग निर्माण के लिए आवश्यक कक्ष संख्याएं.

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Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

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