Name: fabrication of custom agarose wells for cell seeding and tissue ring self-assembly using 3d-printed molds
Uploaded: 2018-04-02T12:30:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds at JoVE.com

Vi erkjenner takknemlig Dr. Erica Stults (akademisk forskning og søknad vitenskapsmann, WPI IT-tjenester) for henne hjelp med 3D utskrift, Amanda Zoë Reidinger, Ph.D., Chris Nycz og Karen Levi, M.E., for innspill deres på mold design, Kathy Suqui og Jennifer Mann for deres hjelp testing mold design, og Michael O'Keefe for hans hjelp med filming.  Dette arbeidet ble støttet av NSF IGERT DGE 1144804 (MWR, har), NIH R15 HL097332 (MWR, TAH) NSF REU EEC0754996 (BA), NIH 1R01 EB023907 (MWR, har) og NIH R15 HL137197 (MWR, har).
<div></div>

1. klargjør 3D-trykt Mold
<ol><li>Forberede en CAD-tegning av mold i ønsket dimensjoner.</li>
	<li>Sende CAD-filen til en høyoppløselig 3D-skriver. Velg passende plast utskrift materiale, med skinnende overflate.</li>
	<li>Utskrift, vaskes grundig mold med såpe og vann.</li>
</ol>2. casting PDMS negativer
<ol><li>Måle ønsket antall PDMS base på en balanse. For en mold med 60 mm diameter og 2 mm innlegg godt, bruke 25 g.</li>
	<li>Legge til herding agent på en 1:10 (w/w) forholdet til PDMS base.</li>
	<li>Røre kraftig til de to komponentene er grundig kombinert. Utilstrekkelig blanding kan resultere i ufullstendige herding av PDMS, noe som resulterer i en "klebrig" overflate.</li>
	<li>Plass et laboratorium bånd rundt kanten av 3D-trykt muggsopp, aktivere dannelsen av en PDMS base lag over trykte brønnene.</li>
	<li>Hell PDMS blandingen i formen og plassere mold i et vakuum kammer til de gass før alle bobler er utgitt.</li>
	<li>Kurere PDMS ved 50 ° C i 2-4 h, eller til befestet nok fjerne.</li>
	<li>Fjerne lab båndet og nøye pakke PDMS negative.</li>
	<li>Inkuber PDMS ved 60 ° C i en ekstra 1 h (etter fjerning fra 3D-trykt mold) for å sikre at mold er fullstendig kurert.</li>
	<li>Vask PDMS grundig med såpe og vann for å fjerne eventuelle rester. Utilstrekkelig vask kan medføre dårlig ring formasjonen for den første bruken av PDMS negative.</li>
</ol>3. fabrikere Agarose Wells
<ol><li>Forberede agarose brønner 1 dag før såing celler.</li>
	<li>Lage en 2% (w/v) agarose løsning i DMEM og autoclave.</li>
	<li>Pipetter 4 mL smeltet agarose i en autoklaveres PDMS negativ. Deretter negativer Pipetter agarose direkte i innleggene på PDMS. Fjern eventuelle luftbobler med Pipetter tips, bobler kan forårsake inhomogeneities i dimensjonene for godt.</li>
	<li>Merk: Må ikke overfylle former; overflaten av agarose må være flat, slik at agarose brønner skal nivå fjerning fra PDMS og plassering i 6-brønnen platene. Leftover agarose kan være re-autoklaveres og brukes igjen, men ikke mer enn én gang.</li>
	<li>Etter agarose kjøler (ca 10 min for 4 mL agarose; større muggsopp kan trenger lenger kjøling ganger), forsiktig skille agarose brønnene fra PDMS negativer med sløv tang og overføre til en godt av en 6-vel plate.</li>
	<li>Senk agarose brønnene i fullstendig kultur medium, og equilibrate over natten i en 37 ° C inkubator før bruk.</li>
</ol>4. frø vev ringer
<ol><li>Kultur rotte aorta glatt muskel celler21 (RaSMCs) i DMEM som inneholder 10% fosterets bovin serum (FBS), 1% L-glutamin, 1% ikke-essensielle aminosyrer, 1% natrium pyruvate og 1% penicillin-streptomycin til de når 70% samløpet. Merk: Cellene skal bli kultivert på 5% CO2 og 37 ° C i 15 cm vev kultur plater.</li>
	<li>Etter muggsopp er equilibrated (del 3), forberede RaSMCs frø.</li>
	<li>Skyll plater to ganger med 5 mL per plate fosfat bufret saltoppløsning (PBS).</li>
	<li>Legge 3 mL 0,25% trypsin per 15 cm Petriskål. Flytte platene til en 37 ° C inkubator i 2-3 minutter, eller til celler har løftet av platen.</li>
	<li>Nøytralisere trypsin med en like volum (3 mL per plate) på komplett kultur medium. Resuspend cellene grundig for å bryte opp klumper.</li>
	<li>Fortynne en aliquot av cellen suspensjon 1:1 med trypan blå farge, og telle celler med en hemocytometer.</li>
	<li>Sentrifuge det totale volumet av cellen suspensjon for 5 min 200 x g til pellets celler.</li>
	<li>Resuspend celler i en konsentrasjon av 10 millioner celler per mL; Dette vil resultere i 500 000 celler per 50 µL. Merk: Forskjellige celletyper krever ulike celle konsentrasjoner.</li>
	<li>Sug opp alle medium fra agarose mold. Vær forsiktig fjerne alle medium fra individuelle brønner, men å ikke punktere bunnen av brønnene.</li>
	<li>Pipetter 50 µL av suspensjon i hver brønn.</li>
	<li>Forsiktig legge 2 mL av fersk medium rundt utsiden av agarose mold. Vær forsiktig med å la middels overflyt i brønnene av agarose. Plasser plater i inkubator natten (ca 16 h).</li>
	<li>Etter natten inkubasjon Sug opp mediet utenfor formene, og legge 4,5 mL frisk medium hver brønn av 6-vel platen slik at muggsopp og ringer er helt neddykket. Endre medium daglig.</li>
</ol>

<ol>
	<li>L'Heureux, N., Paquet, S., Labbe, R., Germain, L., Auger, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+completely+biological+tissue-engineered+human+blood+vessel.">A completely biological tissue-engineered human blood vessel.</a> FASEB J. 12 (1), 47-56 (1998).</li><li>Adebayo, O., Hookway, T. A., Hu, J. Z., Billiar, K. L., Rolle, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+smooth+muscle+cell+tissue+rings+exhibit+greater+tensile+strength+than+cell-seeded+fibrin+or+collagen+gel+rings.">Self-assembled smooth muscle cell tissue rings exhibit greater tensile strength than cell-seeded fibrin or collagen gel rings.</a> J Biomed Mater Res A. 101 (2), 428-437 (2013).</li><li>Hayashi, K., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+stem+cell+aggregates+with+gelatin+microspheres+to+enhance+biological+functions.">Preparation of stem cell aggregates with gelatin microspheres to enhance biological functions.</a> Acta Biomater. 7 (7), 2797-2803 (2011).</li><li>Kelm, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+concept+for+scaffold-free+vessel+tissue+engineering:+self-assembly+of+microtissue+building+blocks.">A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks.</a> J Biotechnol. 148 (1), 46-55 (2010).</li><li>McAllister, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+haemodialysis+access+with+an+autologous+tissue-engineered+vascular+graft:+a+multicentre+cohort+study.">Effectiveness of haemodialysis access with an autologous tissue-engineered vascular graft: a multicentre cohort study.</a> Lancet. 373, 1440-1446 (2009).</li><li>Svoronos, A. A., Tejavibulya, N., Schell, J. Y., Shenoy, V. B., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-mold+design+controls+the+3D+morphological+evolution+of+self-assembling+multicellular+microtissues.">Micro-mold design controls the 3D morphological evolution of self-assembling multicellular microtissues.</a> Tissue Eng Part A. 20 (7-8), 1134-1144 (2014).</li><li>Gwyther, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+vascular+tissue+fabricated+from+aggregated+smooth+muscle+cells.">Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells.</a> Cells Tissues Organs. 194 (1), 13-24 (2011).</li><li>Mehesz, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+robotic+biofabrication+of+tissue+spheroids.">Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids.</a> Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).</li><li>Laterreur, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+direct+burst+pressure+and+the+ring+tensile+test+methods+for+mechanical+characterization+of+tissue-engineered+vascular+substitutes.">Comparison of the direct burst pressure and the ring tensile test methods for mechanical characterization of tissue-engineered vascular substitutes.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 34, 253-263 (2014).</li><li>L'Heureux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tissue-engineered+blood+vessels+for+adult+arterial+revascularization.">Human tissue-engineered blood vessels for adult arterial revascularization.</a> Nat Med. 12 (3), 361-365 (2006).</li><li>Dash, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Engineered+Vascular+Rings+from+Human+iPSC-Derived+Smooth+Muscle+Cells.">Tissue-Engineered Vascular Rings from Human iPSC-Derived Smooth Muscle Cells.</a> Stem Cell Reports. 7 (1), 19-28 (2016).</li><li>Heureux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+tissue-engineered+vascular+media:+a+new+model+for+pharmacological+studies+of+contractile+responses.">A human tissue-engineered vascular media: a new model for pharmacological studies of contractile responses.</a> FASEB J. 15, 515-524 (2001).</li><li>Dikina, A. D., Strobel, H. A., Lai, B. P., Rolle, M. W., Alsberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+cartilaginous+tubes+for+tracheal+tissue+replacement+via+self-assembly+and+fusion+of+human+mesenchymal+stem+cell+constructs.">Engineered cartilaginous tubes for tracheal tissue replacement via self-assembly and fusion of human mesenchymal stem cell constructs.</a> Biomaterials. 52, 452-462 (2015).</li><li>Twal, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellularized+microcarriers+as+adhesive+building+blocks+for+fabrication+of+tubular+tissue+constructs.">Cellularized microcarriers as adhesive building blocks for fabrication of tubular tissue constructs.</a> Ann Biomed Eng. 42 (7), 1470-1481 (2014).</li><li>Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+vascular+tissue+engineering+using+bioprinting.">Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting.</a> Biomaterials. 30 (30), 5910-5917 (2009).</li><li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+facilitated+scaffold-free+tissue+unit+fabrication.">3D printing facilitated scaffold-free tissue unit fabrication.</a> Biofabrication. 6 (2), 1-11 (2014).</li><li>Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rods,+tori,+and+honeycombs:+the+directed+self-assembly+of+microtissues+with+prescribed+microscale+geometries.">Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries.</a> The FASEB Journal. 21 (14), 4005-4012 (2007).</li><li>Gwyther, T. A., Hu, J. Z., Billiar, K. L., Rolle, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cellular+self-assembly+to+fabricate+cell-derived+tissue+rings+for+biomechanical+analysis+and+tissue+engineering.">Directed cellular self-assembly to fabricate cell-derived tissue rings for biomechanical analysis and tissue engineering.</a> J Vis Exp. (57), e3366 (2011).</li><li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+functional+biomaterials+for+tissue+engineering.">3D printing of functional biomaterials for tissue engineering.</a> Curr Opin Biotechnol. 40, 103-112 (2016).</li><li>Jakab, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+by+self-assembly+and+bio-printing+of+living+cells.">Tissue engineering by self-assembly and bio-printing of living cells.</a> Biofabrication. 2 (2), 022001 (2010).</li><li>Lemire, J. M., Potter-Perigo, S., Hall, K. L., Wight, T. N., Schwartz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Rat+Aortic+Smooth+Muscle+Cells+Differ+in+Versican/PG-M+Expression.">Distinct Rat Aortic Smooth Muscle Cells Differ in Versican/PG-M Expression.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 16 (6), 821-829 (1996).</li><li>Strobel, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+self-assembly+with+microsphere+incorporation+for+growth+factor+delivery+within+engineered+vascular+tissue+rings.">Cellular self-assembly with microsphere incorporation for growth factor delivery within engineered vascular tissue rings.</a> Tissue Eng Part A. 23 (3-4), 143-155 (2017).</li><li>Strobel, H. A., Calamari, E. L., Beliveau, A., Jain, A., Rolle, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+characterization+of+electrospun+polycaprolactone+and+gelatin+composite+cuffs+for+tissue+engineered+blood+vessels.">Fabrication and characterization of electrospun polycaprolactone and gelatin composite cuffs for tissue engineered blood vessels.</a> JBMR Part B. , (2017).</li><li>Napolitano, A. P., Chai, P., Dean, D. M., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+self-assembly+of+complex+cellular+aggregates+on+micromolded+nonadhesive+hydrogels.">Dynamics of the self-assembly of complex cellular aggregates on micromolded nonadhesive hydrogels.</a> Tissue Eng. 13 (8), 2087-2094 (2007).</li><li>Gwyther, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Engineered Vascular Tissue Generated by Cellular Self-Assembly. , (2012).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

Her har vi presentert en allsidig metode for rask fabrikasjon av selv montert vev ringer med lett tilpasses dimensjoner med 3D-utskrift. Vår metode er lik som i Svoronos et al. 6 , der 3D-trykt honeycomb og hunden-Ben formet voks former ble brukt til å kaste PDMS negativer. Imidlertid er formene endret for å inneholde flere unike designelementer. Et hakk (figur 4A(1)) gir retning av mold tillate hver ring merket og overvåket individuelt. Den sentrale hullet (figur 4A(2)) forbedrer spredningen av medium i brønnene. CAD filnumre skrives ut direkte på formen; Derfor PDMS negativer hver merket med versjonsnummeret og legge diameter (Figur 4A3). Konisk ytterveggene (Figur 3(1), 5 °) på toppen av godt trau (Figur 3(2), 45 °) og sentrale hullet (Figur 3(3)5 °) gjør det enklere å fjerne PDMS negativer fra 3D-trykt formene , og agarose brønner er enklere å fjerne fra PDMS negative (figur 4A(2), A(4)).
Vi har vist allsidigheten til dette systemet ved å fabrikere selv montert ringformede vev av en rekke diametere og celletyper, inkludert primære menneskelige glatt muskel celler (SMCs)18,22, rotte aorta SMCs7 , 23og menneskelige mesenchymal stamceller (hMSCs)13SMCs avledet fra indusert pluripotent stamceller (iPSCs)11 (tabell 1). I pågående arbeid, er vi evaluere dannelsen av ringer fra flere celletyper som endotelceller, og blander brusk ringer av varierende størrelse for potensielle programmer i tracheal erstatning. I tillegg til helt celle-avledet konstruerer, har vi også brukt dette systemet for å dikte ringer med innarbeidet krysskoblet gelatin mikrosfærer13,22. Mikrosfærer kan innlemmes i vev ringer under selvtillit forsamlingen for å gi ekstra mekanisk styrke, eller for lokaliserte levering av vekstfaktorer13,22.
Når fabrikere vev ringer, kan optimalisering av celle nummer være nødvendig for forskjellige celletyper. Minimum celle tall kan variere basert på størrelse og type celler. For eksempel hSMCs fra iPSCs er seeded på 600.000 celler/ring11, hMSCs og primære hSMCs er seeded på 400 000 celler/ring13,22og rotten aorta SMCs er seeded 500.000 celler/ring18. Gjennom dimensjoner kan også påvirke ring dannelse og minimum antall celler kreves for ring formasjon24. For studier med menneskelige celler og 3D-trykt muggsopp brukte en gjennom bredde på 2 mm. Den opprinnelige polykarbon formene hadde en gjennom bredde på 3.75 mm, som krevde 750.000 hSMCs danner en 2 mm celle ring18. Med redusert gjennom bredde kunne vi redusere antall celler nødvendig for ring dannelsen av 46% til 400 000 celler per ring25. Antall celler seeded per ring oppsummeres i tabell 1.
Når du velger et 3D-trykt materiale, må mange faktorer vurderes. Fordi PDMS er vanligvis helbredet ved 60 ° C, 3D-trykt materiale må ha høy nok smelter temperatur for å unngå skade ved PDMS herding. Smeltetemperaturen for materialet som brukes i denne studien (en proprietær materiale, se Tabellen for materiale) er ikke tilgjengelig. Men når bakt på 60 ° C i 1 time, observerte vi at materialet begynte å produsere en lukt. Derfor besluttet vi å senke herding temperaturen til 50 ° C og øke herding for å bake PDMS uten å skade den 3D-trykt materialet. Justeringer i herding tid kan være nødvendig hvis muggsopp endres til skjemaet større PDMS negativer. En ekstra herding periode på 60 ° C etter PDMS fjerning fra 3D-trykt formene forhindrer at den endelige PDMS negative gjenværende tacky, samtidig som temperaturen 3D-trykt mold er utsatt. Merk at noen materialer hemme herding av PDMS, slik at at valgte materialet er kompatibel med PDMS. Til slutt må også mold materiale toksisitet vurderes. Mens 3D-trykt mold ikke vil være i direkte kontakt med celler, er det mulig at noen rester fra formen kan overføres til PDMS negative under herding prosedyren. Vi fant at veldig grundig vask med vaskemiddel var tilstrekkelig til å fjerne eventuelle rester fra PDMS negativ. Men observert vi tidligere at utilstrekkelig vask ledet dårlig ring-formasjonen i agarose brønner for første få bruk av PDMS negativ. Bruk av PDMS kastet av andre 3D-trykte materialer krever videre undersøkelser kan kontrollere vaskemiddel er tilstrekkelig å fjerne mold rester, inkludert noen potensielle leachates. Periodiske tester kan også være nødvendig, det mulig at gjentatt oppvarming sykluser (til 50 ° C) kan skade mold over tid, og forårsake øker i rester etter gjentatt bruk. Hittil har vi brukt en enkel 3D-trykt mold for å produsere mer enn 30 PDMS negative som har blitt brukt for å kunne generere vev ringer.
Samlet, 3D utskrift gir større fleksibilitet til fabrikasjon av agarose former enn bearbeiding av polykarbonat. Det gir høyere oppløsning enn det er mulig med verktøy, og mold design er ikke begrenset av dimensjoner av verktøyene. Dette gir større tilpasningsmuligheter, og tillegg av funksjoner som avsmalnende som kan maskinering. Dette systemet kan brukes å fabrikere selv montert vev i andre figurer, i tillegg til ringer6,17. Med metoden ring fabrikasjon har vi utviklet vev ringer fra en rekke celletyper og størrelser for potensielle anvendelser i tracheal tissue engineering13, utviklet blodkar7og modellering vascular sykdommer11.

Mobilnettet selvtillit forsamlingen tilnærminger til fabrikasjon vev utvikling blodkar er et alternativ til stillaset tilnærminger. Selv samlet, stillas-fri vev kan ha større celle tetthet, forbedret matrix avsettelse og styrke og forbedret biologisk funksjon i forhold til stillaset-baserte vev1,2,3,4 . Imidlertid danner 3D vev uten bruk av eksogene stillaset støtte med bestemte størrelser og former er fortsatt en utfordring. Noen metoder smelter sammen lag celle ark til tykkere konstruerer, selv om denne prosessen kan være tidkrevende og arbeidskraft intensiv5. Eventuelt cellene kan seeded i ikke-klebende former og tillatt å samlet i spheroids, ringer og andre vev figurene6,7,8.
Selv montert vev ringene krever færre celler, kortere kultur tider og mindre reagenser enn større rørformede konstruert vev, men kan fortsatt være mekanisk testet, undersøkt histologisk eller contractility og andre funksjonelle tester7 , 9 , 10 , 11. fordi de kan fremstille raskt og enkelt testet, vev ringer er ideelle for screening stort antall kultur parametere, og har potensial som sykdom modeller11 eller verktøy for narkotikarelaterte screening12. Dessuten ringer kan være smeltet sammen til mer komplekse vev strukturer som blodkar eller spor7,13, og ringer kan sikring mer fullstendig enn andre figurer som spheroids14,15.
Agarose er mye brukt som mold materiale for fabrikere selv montert vev sin biocompatibility, permeabilitet og ikke-klebende egenskaper. For eksempel fremstille Norotte et al. agarose former fra ekstrudert stenger, som aktivert begrenset kontroll over mold form og nødvendige spesialisert utstyr15. Tan et al. avsatt alginate dråper som bygge enheter å utvikle egendefinerte hydrogel former i ulike figurer (pyramide, square)16. Men resulterte stor diameter på alginate spheroids (300 µm) i funksjoner med lav oppløsning. Så lav oppløsning kan føre til ujevn mold overflater som kan påvirke celle aggregering konsistens. Alternativt kan agarose brukes i polymer negativer opprette ikke-klebende former med glatte funksjoner og bestemte dimensjoner6,7,17.
Vi har tidligere rapportert et system for fabrikasjon egendefinerte Ringformet agarose celle-såing brønner fra en PDMS negative kastet i en valset polykarbonat mold7,18. Agarose ble helles i PDMS negative og lov å sette7,18. Celler var så frø i agarose brønner, hvor de akkumuleres skjemaet selv samlet stillaset-fri vev ringer på mindre enn 24 h7,18. PDMS negativer er autoclavable, kan gjenbrukes mange ganger, og er myk og fleksibel slik at det blir enkelt å fjerne befestet agarose brønnene. Når dette systemet ble opprinnelig rapportert i Gwyther et al. 7, PDMS negativer ble kastet fra valset polykarbonat muggsopp (figur 1A). Etter agarose avstøpning, ble celle seeding brønnene individuelt kuttet ut og plassert i brønner en 12-vel plate7,18. Utformingen ble nylig endret slik at en enkelt agarose mold produserer 5 ringer og passer i en godt av en 6-vel plate, eliminerer behovet å kutte ut individuelle brønner og redusere mengden av PDMS og agarose kreves for å produsere hver ring (figur 1B). En mindre celle seeding gjennom bredde ble brukt til å redusere antall frø celler kreves for å oppnå ring formasjon. Til tross for disse endringene, oppløsning og tilpasning av muggsopp var begrenset til tilgjengelige standard endmill dimensjoner og micromilling kan være uoverkommelig dyrt. I tillegg datamaskinen numerisk kontroll (CNC) maskinering kan være tidkrevende og tungvint på grunn av behovet for å reservere tid på utnyttet sterkt egendefinerte utstyr, ytterligere datamaskinassistert produksjon (CAM) programvare for å konvertere dataassistert konstruksjon ( CAD) filen til en programmerbar verktøyet bane, og pålitelig Fikstureringssystem av polykarbonat under maskinering.
I studien undersøkte vi bruk av 3D-utskrift som et alternativ til CNC maskinering. 3D-utskrift er mye brukt for engineering egendefinerte implantater, fabrikasjon stillaset materialer, og direkte utskrift av celler og vev spheroids15,19,20. Vi brukte en høyoppløselig 3D skriver, og spesialiserte 3D utskrift materiale som mulig for oss å skrive ut en rigid mold med en glatt, glanset overflate finish (se Tabell for materiale). Våre teknikken kan fabrikasjon av tilpasses, høy oppløsning plast former som kan brukes til støping PDMS negativer og agarose brønner. Design iterasjoner oppsummeres i figur 1. Mold design ble ytterligere endret i 3D-trykt mold versjon inkludere konisk yttervegger og en senterhullet for å lette fjerning av begge PDMS negativer fra 3D-trykt formene og agarose brønner fra PDMS negativer. Funksjonene konisk kan ikke oppnås med standard maskinering processes. Avstanden fra bunnen av brønnene til bunnen av mold økt i denne gjentakelse, noe som resulterer i en tykkere agarose base under innlegg å redusere risikoen for innlegg bryte under agarose godt fjerning. Mold og ring fabrikasjon prosedyren er vist skjematisk i figur 2.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>15-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroWhite</td>
			<td>StrataSys</td>
			<td>RGD835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>StrataSys</td>
			<td>Objet 260 Connex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>15-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16000069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-015-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-000-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-strep</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-900-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WKY 3M-22 rat aortic smooth muscle cells</td>
			<td>Provided by T. Wight [ref 21]</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of custom agarose wells for cell seeding and tissue ring self-assembly using 3d-printed molds

Foretatt vev brukes klinisk for tissue reparasjon og utskifting og utvikles som verktøy for menneskelig sykdom modellering og narkotikarelaterte screening. Selv montert vev tilbyr fordeler over stillaset-baserte vev utvikling, som forbedret matrix deponering, styrke og funksjon. Men er det noen metoder for fabrikasjon 3D vev uten seeding celler på eller innenfor en støtte scaffold. Tidligere utviklet vi et system for fabrikere selv montert vev ringer av seeding celler i ikke-klebende agarose brønner. En polydimethylsiloxane (PDMS) negative ble først kastet i en maskinert polykarbonat mold, og deretter agarose var gelled i PDMS negative opprette ringformede celle seeding brønner. Men var allsidigheten av denne tilnærmingen begrenset av oppløsningen av verktøy tilgjengelig for maskinering polykarbonat mold. Her viser vi at 3D-trykt plast kan brukes som et alternativ til maskinert polykarbonat for fabrikasjon PDMS negativer. 3D-trykt mold og revidert mold design er enklere å bruke, billig å produsere, og krever betydelig mindre agarose og PDMS per celle seeding godt. Vi har vist at de resulterende agarose brønnene kan brukes å opprette selv montert vev ringer med tilpassede diameter fra en rekke forskjellige celletyper. Ringer kan deretter brukes for mekanisk, funksjonelle og histologiske eller fabrikere større og mer komplekse rørformede vev.

Dette systemet gir enkel, tilpasset fabrikasjon av agarose celle seeding brønner som gjør at cellen selvstendig montering av ringformede 3D konstruert vev. 3D-utskrift gir bedre oppløsning og større fleksibilitet i mold design enn maskinering polykarbonat, hvor dimensjonene er begrenset av tilgjengelig verktøyet størrelsene. En høyoppløselig 3D skriver, vegger så tynne som 0.254 mm kan skrives og trau dimensjoner er begrenset bare av oppløsningen på skriveren (15.2 µm oppløsning for disse studiene). Vanligvis er CNC endmills mindre enn 0,3 mm ikke kommersielt tilgjengelig, så det ikke er mulig å opprette trau av mindre bredder. Mikro-fresing kan produsere mindre funksjoner, men utstyret kreves kan være uoverkommelig dyrt eller utilgjengelige for mange biomedisinsk forskningslaboratorier. Gjennom dimensjoner og kurvatur begrenses også av den endmill formen. I tillegg funksjoner vinklet som eller konisk vegger er ikke mulig, og små funksjoner kan bryte under maskinering prosessen.
CAD-tegninger kan enkelt endres for å produsere 3D-trykt muggsopp og PDMS negativer passelig dimensjoner. Figur 3 beskriver dimensjonene til våre gjeldende 2 mm innlegget 3D-trykt muggsopp, sammenlignet med tidligere design iterasjoner. Prosessen er billig; de 2 mm, 5-ring 3D-trykt mold kostnad 44.67 USD til 3D utskrift og hver del kan brukes til å opprette flere PDMS negativer. Hittil har vi skapt mer enn 30 PDMS negativer fra en enkelt 3D-trykt form. Hver negative krever 25 g PDMS til 0,11 USD per g (2,75 USD per PDMS negativ). Hver PDMS negative kan rengjøres med vaskemiddel, autoklaveres, og brukes på nytt opptil flere år, avhengig av bruksfrekvens. Sammenlignet med den opprinnelige design18, bruker kompakt 3D-trykt mold betydelig mindre PDMS og agarose per 2 mm vev ring (figur 1E).
Celler seeded i equilibrated agarose brønnene akkumulere skjemaet vev ringer på mindre enn 24 h. Ring dimensjoner avhengig av dimensjoner av agarose. Her viste vi at selv montert rotte glatt muskel celle ringer kan fremstille i brønner med 2, 4 eller 12 mm diameter innlegg (Figur 4). Mens ringer i denne studien var bare kultivert for 3 dager, vi har tidligere kultivert hSMC ringer for opptil 2 uker22, og hMSC-brusk ringer for opptil 3 uker13. Som rapportert tidligere, kan ringer fungere som 3D i vitro modeller av menneskelig vev for kvantitativ vurdering av vev funksjon11 og mekanisk styrke13,22, og kan også tjene som modulære bygningen enheter generere rørformet vev konstruksjoner7,13. Celle seeding forhold og funksjonelle attributter av vev ringer utviklet fra disse celletyper oppsummeres i tabell 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig1.jpg"> Figur 1: polykarbonat mold design. I utgangspunktet var 15-vel muggsopp maskinert i polykarbonat (A). Senere versjoner omtalt mer kompakt design (B) med 5 brønner for å passe i en enkelt polykarbonat mold, og innen en brønn av en 6-vel plate. Her endret vi denne design bruke 3D-trykt plast som et mer passelig alternativ til maskinert polykarbonat (C). Vises i (D) er agarose brønner fabrikkert fra innledende design18 (venstre) sammenlignet med dagens kompakt design (høyre), som krever betydelig mindre agarose og krever ikke manuell separasjon brønner. Mengder PDMS og agarose kreves for hver design gjentakelse vises i (E). Center innlegg er 2 mm i diameter. Mold i (A) er 6 cm x 12 cm, (B) har 5 cm diameter, og (C) har 6 cm diameter. Skala bar i (D) = 3 cm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig2.jpg"> Figur 2: fabrikasjon av selv montert vev ringer. En 3D-trykt form brukes å kaste en PDMS negativ, som deretter brukes til å kaste agarose brønnene (A). Celler er deretter seeded direkte i agarose brønnene, hvor de samlet i mindre enn 24 til skjemaet vev ringene (B). Stiplede linjer med (B) viser godt disposisjonen. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig3.jpg"> Figur 3: tverrsnittvisningen 3D-trykt mold CAD tegninger. Dimensjoner for gjennom bredden (A), trau høyde (B), senterhullet (C), totalt diameter (D), ytre leppe (E) og ytre vegg høyde (F) vises. Ytre vegger (1), øvre delen av brønner (2) og senterhullet (3) er konisk (i 5 ° vinkel for 1 og 3, 45 ° 2) for å forbedre brukervennlighet PDMS negative fjerning. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig4.jpg"> Figur 4: CAD-tegninger med tilsvarende PDMS negativer og selv montert SMC ringer med 2 (A), 4 (B) og 12 (C) mm post diametere. I (A), (1) angir et hakk for å gi retning, (2) angir et sentralt hull for å forbedre perfusjon, (3) er et filnummer som forlagene direkte på PDMS negativer, og (4) viser ytre veggen, er konisk for å lette PDMS negative fjerning. Skalere barer i agarose brønner = 1 cm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Celle type</td>
			<td>Celler seeded per ring</td>
			<td>Ring diameter</td>
			<td>Kultur varighet</td>
			<td>Funksjonell analyse utført</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rotte SMC</td>
			<td>0,5, 1 eller 3 x 106
</td>
			<td>2, 4 eller 12 mm</td>
			<td>3 dager</td>
			<td>Denne studien; I/T</td>
		</tr>
<tr>
<td>
iPSC avledet SMC 11
</td>
			<td>0,6 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>17 dager</td>
			<td>Contractility testing, uniaxial strekk test, histologiske analyse</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Menneskelige SMC 22
</td>
			<td>0,4 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>2, 7 eller 14 dager</td>
			<td>Uniaxial strekk test, histologiske analyse</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Menneskelige MSC 14
</td>
			<td>0,4 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>21 dager</td>
			<td>Uniaxial strekk test, histologiske analyse, ring fusion og rør komprimering testing, differensiering i brusk vev</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Celle tall kreves for ring fabrikasjon fra forskjellige celletyper.

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds at JoVE.com

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Denne protokollen beskriver en plattform for fabrikere selv montert vev ringer i varierende størrelser ved hjelp av en tilpasset 3D-trykt plast mold. PDMS negativer er kurert i 3D-trykt mold; deretter er agarose støpt i herdet PDMS negativer. Celler er sådd i de resulterende agarose brønnene hvor de samlet i vev ringer.

Fabrikasjon av egendefinerte Agarose for celle såing og vev Ring selvstendig montering med 3D-trykt muggsopp

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Regissert Cellular Self-Assembly å dikte Cell-Avledet Tissue Rings for Biomekaniske Analysis and Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Ikke-kontakt, Label-fri Overvåking av celler og ekstracellulær matriks med Raman spektroskopi

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Menneskelig bruskvev Fabrication Bruke Tredimensjonal Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Rapid and Low-cost Prototyping of Medical Devices Using 3D Printed Molds for Liquid Injection Molding

Rask og Rimelig Prototyping av medisinsk utstyr Bruk av 3D Trykt Stanse for Liquid Injection Molding

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Syntese av kationiserte Magnetoferritin for Ultra-rask Magnetization Celler

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Skalering av Engineered vaskulære implantater Bruke 3D Trykt Guides og Ring Stacking Method

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, ...

Custom Engineered Tissue Culture Molds from Laser-etched Masters

Egendefinert utviklet vev kultur former fra Laser etset Masters

As the field of tissue engineering has continued to mature, there has been increased interest in a wide range of tissue parameters, including tissue ...

Agarose-based Tissue Mimicking Optical Phantoms for Diffuse Reflectance Spectroscopy

Agarose-baserte vev Mimicking optisk Phantoms for diffus refleksjon spektroskopi

This protocol describes how to make agarose-based tissue-mimicking phantoms and demonstrates how to determine their optical properties using a ...

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Såing og implantering av en biosyntetiske vev-konstruert Tracheal pode i en musemodell

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

3D trykt porøse Cellulose Nanocomposite Hydrogel stillaser

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...