Name: fabrication of custom agarose wells for cell seeding and tissue ring self-assembly using 3d-printed molds
Uploaded: 2018-04-02T12:30:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds at JoVE.com

Мы с благодарностью признаем доктор Эрика Stults (научные исследования и применения ученый, ИЗВ информационные технологии) за помощь с 3D печати, Аманда Зои Reidinger, Ph.D., Крис Nycz и Карен Леви, м.е., для их ввода на дизайн плесень, Кэти Suqui и Дженнифер Mann для их помощи тестирования формы конструкции и Майкл о ' Киф за его помощь в съемках.  Эта работа была поддержана NSF IGERT DGE 1144804 (MWR, газ), NIH R15 HL097332 (MWR, тах), NSF REU EEC0754996 (BA), низ 1R01 EB023907 (MWR, HAS) и низ HL137197 R15 (MWR, HAS).
<div></div>

1. Подготовка 3D-печатные формы
<ol><li>Подготовьте чертеж плесени в желаемых размеров.</li>
	<li>Отправьте файл CAD на принтере с высоким разрешением 3D. Выберите соответствующие печати пластмасса, с глянцевой отделкой.</li>
	<li>После печати, тщательно мыть формы с моющим средством и водой.</li>
</ol>2. литья PDMS негативов
<ol><li>Измерьте нужное количество PDMS базы на баланс. Для прессформы с 60 мм диаметром 2 мм, а также должности, использовать 25 г.</li>
	<li>Добавление отвердителя в 1:10 (w/w) отношение к основанию PDMS.</li>
	<li>Размешайте энергично, пока тщательно комбинируются два компонента. Недостаточное смешивание может привести к неполной полимеризации PDMS, что приводит к «липкий» поверхности.</li>
	<li>Поместите кусок ленты лаборатории вокруг границы 3D-печатные формы, чтобы включить формирование PDMS базового слоя над печатной скважин.</li>
	<li>Залить PDMS смесь в формы и плесень в вакуумной камере де газ до тех пор, пока все пузырьки будут освобождены.</li>
	<li>Вылечить PDMS при 50 ° C для 2-4 ч, или пока не затвердевших достаточно, чтобы удалить.</li>
	<li>Удалите ленту лаборатории и осторожно извлечь PDMS отрицательной.</li>
	<li>Инкубируйте PDMS при 60 ° C для дополнительного 1 ч (после удаления из 3D-печатные формы) для обеспечения, что плесень полностью вылечить.</li>
	<li>Вымойте PDMS тщательно с моющим средством и водой для удаления остатков. Недостаточная Стиральная может привести к формирования бедных кольцо для первого использования негативных PDMS.</li>
</ol>3. Изготовление агарозы Уэллс
<ol><li>Подготовьте агарозы скважин за 1 день до заполнения ячеек.</li>
	<li>Сделайте раствор 2% (w/v) агарозы в среде DMEM и автоклав.</li>
	<li>Накапайте 4 мл расплавленного агарозы в газобетона PDMS отрицательным. Затем накапайте агарозы непосредственно в должности PDMS негативов. Удалите любые воздушные пузыри с кончиком пипетки, как пузыри могут вызвать неоднородностей в хорошо измерениях.</li>
	<li>Примечание: Не переполняйте формы; верхней поверхности агарозы должна быть плоской, так что агарозы скважин будет уровень после удаления от PDMS и размещение в 6-ну культуры пластин. Остатки агарозы могут быть re газобетона и используется снова, хотя не более одного раза.</li>
	<li>После агарозы охлаждается (примерно 10 минут, для 4 мл агарозы; большие формы может потребоваться больше охлаждения раз), тщательно отделить агарозы скважин от PDMS негативы использованием тупых щипцами и передачи в колодец 6-ну плиты.</li>
	<li>Опускайте агарозы скважин в полной питательной среды и сбалансировать на ночь в инкубатор 37 ° C перед использованием.</li>
</ol>4. Заполнение ткани кольца
<ol><li>Культура крыса аорты гладких мышц клетки21 (RaSMCs) в среде DMEM, содержащие 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 1% L-глютамина, 1% несущественные аминокислот, пируват натрия 1% и 1% пенициллин стрептомицином до тех пор, пока они достигают 70% слияния. Примечание: Клетки должны культивировали в 5% CO2 и 37 ° C в 15 см культуры ткани пластины.</li>
	<li>После того, как пресс-формы являются достижение равновесного уровня (раздел 3), подготовить RaSMCs для заполнения.</li>
	<li>Промойте пластины дважды с 5 мл на пластине-фосфатный буфер (PBS).</li>
	<li>Добавьте 3 мл 0,25% трипсина на 15 см Петри. Перемещение плит до 37 ° C инкубатор для 2-3 мин, или до тех пор, пока клетки снять пластину.</li>
	<li>Нейтрализовать трипсина с равным объемом (3 мл на пластину) полной питательной среды. Ресуспензируйте клетки тщательно порвать пряди.</li>
	<li>Разбавить Алиготе суспензию клеток 1:1 с Трипановый синий краситель и подсчитать количество ячеек с Горяева.</li>
	<li>Центрифуга общий объем суспензии клеток для 5 минут при 200 x g для пеллет клетки.</li>
	<li>Ресуспензируйте клетки в концентрации 10 миллионов клеток / мл; Это приведет к 500 000 ячеек на 50 мкл. Примечание: Различных типов клеток может потребоваться концентрации различных клеток.</li>
	<li>Аспирационная всех средних от плесени агарозы. Будьте осторожны, чтобы удалить все среды из отдельных скважин, но не протыкайте днища колодцев.</li>
	<li>Накапайте 50 мкл суспензии в каждой скважине.</li>
	<li>Аккуратно добавьте 2 мл свежей среды вокруг внешней плесени агарозы. Будьте осторожны, чтобы не позволить средних переполнения в скважины агарозы. Поместите пластины в инкубаторе на ночь (примерно 16 h).</li>
	<li>После ночи инкубации аспирационная среднего от вне формы и добавить 4,5 мл свежего среднего для каждой скважины пластину 6-Ну так, что формы и кольца полностью погружены. Изменение среднего ежедневно.</li>
</ol>

<ol>
	<li>L'Heureux, N., Paquet, S., Labbe, R., Germain, L., Auger, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+completely+biological+tissue-engineered+human+blood+vessel.">A completely biological tissue-engineered human blood vessel.</a> FASEB J. 12 (1), 47-56 (1998).</li><li>Adebayo, O., Hookway, T. A., Hu, J. Z., Billiar, K. L., Rolle, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+smooth+muscle+cell+tissue+rings+exhibit+greater+tensile+strength+than+cell-seeded+fibrin+or+collagen+gel+rings.">Self-assembled smooth muscle cell tissue rings exhibit greater tensile strength than cell-seeded fibrin or collagen gel rings.</a> J Biomed Mater Res A. 101 (2), 428-437 (2013).</li><li>Hayashi, K., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+stem+cell+aggregates+with+gelatin+microspheres+to+enhance+biological+functions.">Preparation of stem cell aggregates with gelatin microspheres to enhance biological functions.</a> Acta Biomater. 7 (7), 2797-2803 (2011).</li><li>Kelm, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+concept+for+scaffold-free+vessel+tissue+engineering:+self-assembly+of+microtissue+building+blocks.">A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks.</a> J Biotechnol. 148 (1), 46-55 (2010).</li><li>McAllister, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+haemodialysis+access+with+an+autologous+tissue-engineered+vascular+graft:+a+multicentre+cohort+study.">Effectiveness of haemodialysis access with an autologous tissue-engineered vascular graft: a multicentre cohort study.</a> Lancet. 373, 1440-1446 (2009).</li><li>Svoronos, A. A., Tejavibulya, N., Schell, J. Y., Shenoy, V. B., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-mold+design+controls+the+3D+morphological+evolution+of+self-assembling+multicellular+microtissues.">Micro-mold design controls the 3D morphological evolution of self-assembling multicellular microtissues.</a> Tissue Eng Part A. 20 (7-8), 1134-1144 (2014).</li><li>Gwyther, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+vascular+tissue+fabricated+from+aggregated+smooth+muscle+cells.">Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells.</a> Cells Tissues Organs. 194 (1), 13-24 (2011).</li><li>Mehesz, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+robotic+biofabrication+of+tissue+spheroids.">Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids.</a> Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).</li><li>Laterreur, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+direct+burst+pressure+and+the+ring+tensile+test+methods+for+mechanical+characterization+of+tissue-engineered+vascular+substitutes.">Comparison of the direct burst pressure and the ring tensile test methods for mechanical characterization of tissue-engineered vascular substitutes.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 34, 253-263 (2014).</li><li>L'Heureux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tissue-engineered+blood+vessels+for+adult+arterial+revascularization.">Human tissue-engineered blood vessels for adult arterial revascularization.</a> Nat Med. 12 (3), 361-365 (2006).</li><li>Dash, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Engineered+Vascular+Rings+from+Human+iPSC-Derived+Smooth+Muscle+Cells.">Tissue-Engineered Vascular Rings from Human iPSC-Derived Smooth Muscle Cells.</a> Stem Cell Reports. 7 (1), 19-28 (2016).</li><li>Heureux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+tissue-engineered+vascular+media:+a+new+model+for+pharmacological+studies+of+contractile+responses.">A human tissue-engineered vascular media: a new model for pharmacological studies of contractile responses.</a> FASEB J. 15, 515-524 (2001).</li><li>Dikina, A. D., Strobel, H. A., Lai, B. P., Rolle, M. W., Alsberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+cartilaginous+tubes+for+tracheal+tissue+replacement+via+self-assembly+and+fusion+of+human+mesenchymal+stem+cell+constructs.">Engineered cartilaginous tubes for tracheal tissue replacement via self-assembly and fusion of human mesenchymal stem cell constructs.</a> Biomaterials. 52, 452-462 (2015).</li><li>Twal, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellularized+microcarriers+as+adhesive+building+blocks+for+fabrication+of+tubular+tissue+constructs.">Cellularized microcarriers as adhesive building blocks for fabrication of tubular tissue constructs.</a> Ann Biomed Eng. 42 (7), 1470-1481 (2014).</li><li>Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+vascular+tissue+engineering+using+bioprinting.">Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting.</a> Biomaterials. 30 (30), 5910-5917 (2009).</li><li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+facilitated+scaffold-free+tissue+unit+fabrication.">3D printing facilitated scaffold-free tissue unit fabrication.</a> Biofabrication. 6 (2), 1-11 (2014).</li><li>Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rods,+tori,+and+honeycombs:+the+directed+self-assembly+of+microtissues+with+prescribed+microscale+geometries.">Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries.</a> The FASEB Journal. 21 (14), 4005-4012 (2007).</li><li>Gwyther, T. A., Hu, J. Z., Billiar, K. L., Rolle, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cellular+self-assembly+to+fabricate+cell-derived+tissue+rings+for+biomechanical+analysis+and+tissue+engineering.">Directed cellular self-assembly to fabricate cell-derived tissue rings for biomechanical analysis and tissue engineering.</a> J Vis Exp. (57), e3366 (2011).</li><li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+functional+biomaterials+for+tissue+engineering.">3D printing of functional biomaterials for tissue engineering.</a> Curr Opin Biotechnol. 40, 103-112 (2016).</li><li>Jakab, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+by+self-assembly+and+bio-printing+of+living+cells.">Tissue engineering by self-assembly and bio-printing of living cells.</a> Biofabrication. 2 (2), 022001 (2010).</li><li>Lemire, J. M., Potter-Perigo, S., Hall, K. L., Wight, T. N., Schwartz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Rat+Aortic+Smooth+Muscle+Cells+Differ+in+Versican/PG-M+Expression.">Distinct Rat Aortic Smooth Muscle Cells Differ in Versican/PG-M Expression.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 16 (6), 821-829 (1996).</li><li>Strobel, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+self-assembly+with+microsphere+incorporation+for+growth+factor+delivery+within+engineered+vascular+tissue+rings.">Cellular self-assembly with microsphere incorporation for growth factor delivery within engineered vascular tissue rings.</a> Tissue Eng Part A. 23 (3-4), 143-155 (2017).</li><li>Strobel, H. A., Calamari, E. L., Beliveau, A., Jain, A., Rolle, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+characterization+of+electrospun+polycaprolactone+and+gelatin+composite+cuffs+for+tissue+engineered+blood+vessels.">Fabrication and characterization of electrospun polycaprolactone and gelatin composite cuffs for tissue engineered blood vessels.</a> JBMR Part B. , (2017).</li><li>Napolitano, A. P., Chai, P., Dean, D. M., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+self-assembly+of+complex+cellular+aggregates+on+micromolded+nonadhesive+hydrogels.">Dynamics of the self-assembly of complex cellular aggregates on micromolded nonadhesive hydrogels.</a> Tissue Eng. 13 (8), 2087-2094 (2007).</li><li>Gwyther, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Engineered Vascular Tissue Generated by Cellular Self-Assembly. , (2012).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Здесь мы представили универсальный метод для быстрого изготовления колец собственн-собранные ткани с легко настроить размеры с помощью 3D печати. Наш метод аналогичен сообщили в Svoronos и др. 6 , где Сота 3D-печати и собака кость форме воск формы были использованы для приведения PDMS негативов. Однако были изменены формы содержат ряд уникальных конструктивных особенностей. Паз (рис. 4A(1)) обеспечивает ориентацию формы разрешить каждое кольцо, чтобы быть помечены и контроль индивидуально. Центральное отверстие (рис. 4A(2)) помогает улучшить распространение среды в скважины. Номера файлов CAD печатаются непосредственно на плесень; Таким образом PDMS негативов друг помечены с номером версии и после диаметр (A3Рисунок 4). Конические внешние стены (рис. 3(1), 5 °), в верхней части хорошо желоба (Рисунок 3(2), 45 °) и центральное отверстие (рис. 3(3), 5 °) сделать его легче удалить PDMS негативов из 3D-печатные формы , и легче удалить из негативов PDMS агарозы скважин (рис. 4A(2), A(4)).
Мы продемонстрировали гибкость этой системы изготовления собственн-собранные кольцевой тканей различных диаметров и типов клеток, включая первичный человека гладких мышц клетки (SMCs)18,22, крысы, aortic SMCs7 , 23, мезенхимальных стволовых клеток (использования)13и SMCs производным от индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs)11 (Таблица 1). В текущей работе мы оценки формирования колец от типов дополнительные клетки как эндотелиальные клетки и взрывательных хряща кольца разных размеров для потенциальных приложений в трахеи замены. В дополнение к полностью клеток, полученных конструкций мы использовали эту систему для изготовления колец с встроенным сшитого желатин микросферы13,22. Микросферы могут быть включены в ткани кольца во время самостоятельной сборки обеспечивают дополнительную механическую прочность, или для локализованных доставки факторы роста13,22.
При изготовлении ткани кольца, оптимизация количества клеток может потребоваться для различных типов клеток. Минимальная клетки, цифры могут отличаться на основе размера и типа клеток. К примеру hSMCs, производного от iPSCs посеян на 600 000 клеток/кольцо11, использования и первичной hSMCs посеян на 400 000 клеток/кольцо13,22и крысы, которые aortic SMCs посеян на 500000 клеток/кольцо18. Размеры корыта может также повлиять на формирование кольцо и минимальное количество клеток, необходимых для формирования кольцо24. Для исследования клеток человека и 3D-печатные формы был использован корыта шириной 2 мм. Оригинальные формы поликарбонатные имел ширина желоба 3.75 мм, которая требует 750000 hSMCs сформировать 2 мм ячейку кольцо18. С сокращение желоба ширины мы смогли сократить количество клеток, необходимых для формирования кольцо на 46%, до 400 000 ячеек на кольцо25. Количество клеток, семенами в кольцо приводится в таблице 1.
При выборе 3D-печатный материал, многие факторы должны быть рассмотрены. Потому что PDMS обычно лечится при 60 ° C, 3D-печатный материал должен иметь достаточно высокой температуры, чтобы избежать повреждения во время отверждения PDMS плавления. Температура плавления материала, используемого в этом исследовании (патентованного материала, смотрите Таблицу материалы) не доступен. Однако когда запеченные при 60 ° C для 1 h, мы наблюдали, что материал начали производить запах. Таким образом мы решили снизить температуру отверждения до 50 ° C и увеличить время отверждения для того, чтобы испечь PDMS без повреждения материала 3D-печати. Корректировки в время отверждения могут быть необходимы, если формы изменяются в форме больших PDMS негативов. Дополнительный период твердения при 60 ° C после удаления PDMS из 3D-печатные формы предотвращает окончательное PDMS негативные оставшиеся липкий, ограничивая 3D-печатные формы подвергается воздействию температуры. Обратите внимание, что некоторые материалы подавляют отверждения PDMS, поэтому убедитесь, что выбранный материал совместим с PDMS. Наконец необходимо также учитывать плесень материала токсичности. В то время как 3D-печатные формы не будет в прямой контакт с клетками, вполне возможно, что некоторые остатки от плесени могут быть переданы PDMS негативные во время отверждения процедуры. Мы обнаружили, что очень тщательного мытья моющим средством было достаточно, чтобы удалить остатки от негативных PDMS. Однако мы наблюдали ранее, неадекватной Стиральная привело к бедных кольцо формирования в скважинах агарозы для первых нескольких видов PDMS негативные. Использование PDMS отлитые из других 3D-печатных материалов может потребоваться дополнительное расследование для проверки, что моющее средство достаточно, чтобы удалить плесень остатков, включая любые потенциальные поступления. Периодические испытания также может быть необходимо, как это возможно, что неоднократные Отопление циклов (даже до 50 ° C) могут повредить плесень с течением времени и приводить к увеличению осадок после многократного использования. На сегодняшний день, мы использовали один 3D-печатные формы для производства более чем 30 PDMS негативов, которые были использованы для успешного создания ткани кольца.
В целом, 3D печать позволяет большую гибкость для изготовления агарозы формы чем обработки из поликарбоната. Он обеспечивает более высокое разрешение, чем это возможно с инструмента, и дизайн плесень не ограничивается размеры имеющиеся инструменты. Это позволяет более настройки, и добавлением функций, таких как сужающийся что не возможно с механической обработкой. Эта система может применяться для изготовления собственн-собранные тканей в других фигурах также, помимо колец6,17. С помощью метода изготовления кольцо, мы разработали ткани кольца из различных типов клеток и размеров для потенциальных приложений в трахеи ткани инженерных13,7инженерии кровеносных сосудов и моделирования сосудистых заболеваний11.

Сотовый самосборки подходы к фабрикации инженерии тканей кровеносных сосудов являются альтернативой подходы, основанные на эшафот. Собственн-собранные, леска бесплатные тканей могут иметь большую плотность клеток, расширенной матрицы осаждения и прочность и улучшение биологической функции, по сравнению с основанной на эшафот тканей1,2,3,4 . Однако образуя 3D тканей без использования экзогенных эшафот поддержки определенных размеров и формы остается проблемой. Некоторые методы сливаются слои клеток листов сформировать толще конструкции, хотя этот процесс может быть много времени и труда интенсивный5. Кроме того, клетки могут быть посеяны в не клей формы и допускается к совокупности сфероидов, кольца и другие ткани формы6,,78.
Собственн-собранные ткани кольца требуют меньше клетки, короче культуры раз, и меньше реагентов, чем больших трубчатых инженерии тканей, но может все еще быть механически испытания, изучены гистологически или для сократимости и другие функциональные тестирования7 , 9 , 10 , 11. потому, что они могут быть изготовлены быстро и легко тестируемых, ткани кольца являются идеальными для досмотра большого числа параметров культуры и имеют потенциал для использования в качестве модели болезни11 или инструменты для наркотиков скрининг12. Кроме того кольца могут быть слиты в более сложные структуры тканей кровеносных сосудов или трахеи7,13, и кольца могут предохранитель более полно, чем другие формы, такие как сфероидов14,15.
Агарозы широко используется как форма материала для изготовления собственн-собранные тканей из-за его биосовместимость, проницаемость и адгезивные свойства-клеток. Например Norotte et al. сфабрикованы агарозы формы из экструдированных прутков, позволяющие ограниченный контроль над плесени форма и требуется специализированное оборудование15. Загар et al. хранение альгината капельки как строительные блоки для изготовления форм пользовательских Гидрогель в различные формы (пирамида, квадрат)16. Однако большого диаметра сфероидов альгината (300 мкм) привели к функции с низким разрешением. Такое низкое разрешение может привести к неравномерным поверхности которых может негативно сказаться на последовательность агрегации клеток. Кроме того агарозы может быть приведен в полимерные негативы для создания плесени не клей с гладкой функции и конкретные размеры6,7,17.
Мы сообщалось ранее системы для изготовления пользовательских кольцевой агарозы заполнения ячейки скважин от PDMS негативные литой в фрезерованные поликарбоната плесень7,18. Агарозы выливают в отрицательной PDMS и позволило установить7,18. Клетки затем были посеяны в агарозном скважины, где они объединяются в форме самостоятельной сборки, эшафот свободный ткань кольца в менее чем 24 часа7,18. Негативы PDMS автоклавируемый, могут быть повторно использованы много раз и мягкие и гибкие, что делает его легко удалить затвердевший агарозы скважин. Когда эта система была первоначально сообщалось в Gwyther и др. 7, PDMS негативы были отлиты из молотые поликарбонатные формы (рис. 1A). После агарозы литья клетки посева скважин были индивидуально вырезать и помещены в скважин 12-ну пластина7,18. Дизайн недавно был изменен таким образом, чтобы один агарозы плесень производит 5 колец и вписывается в хорошо 6-ну плиты, устраняя необходимость в вырезал отдельных скважин и уменьшая количество PDMS и агарозы, необходимых для производства каждого кольца (Рисунок 1B). Меньше ячейка заполнения ширина желоба была использована для сократить количество посеянных клеток, необходимых для достижения кольцо формирования. Несмотря на эти изменения разрешение и настройки форм были ограничены размеры доступны стандартные пластинами, и micromilling могут быть дорогими. Кроме того компьютер ЧПУ (CNC) обработки может занять много времени и громоздким из-за необходимости выделить время на сильно использованы нестандартного оборудования, дополнительные автоматизированного производства (CAM) программного обеспечения для преобразования (автоматизированного проектирования Файл CAD) путь программируемые средства и надежные крепления поликарбоната части во время обработки.
В настоящем исследовании мы рассмотрели использование 3D печати как альтернатива ЧПУ. 3D печать широко используется для инженерных пользовательских имплантатов, эшафот материалов и для прямой печати клеток и тканей сфероидов15,19,20. Мы использовали с высоким разрешением 3D-принтер, и специализированных 3D печати материалов, что позволило нам печатать жесткой формы с гладкой, глянцевой поверхности (см. Таблицу материалы). Наша техника позволяет изготовление высоко настраиваемый, с высоким разрешением пластиковых форм, которые могут использоваться для литья PDMS негативов и агарозы скважин. Дизайн итераций приводится на рисунке 1. Дизайн плесень далее был изменен в версии 3D-печатные формы включить конические наружных стен и центром отверстия для того, чтобы облегчить удаление PDMS негативов из 3D-печатные формы и агарозы скважин от PDMS негативов. Эти конические функции нельзя добиться с стандартом на обрабатывающие процессы. В этой итерации, что привело в толще агарозы базовый ниже должности, чтобы уменьшить риск нарушения во время агарозы хорошо удаления постов было увеличено расстояние от нижней части скважины в нижней части формы. Плесень и кольцо изготовление процедура схематически показан на рисунке 2.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>15-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroWhite</td>
			<td>StrataSys</td>
			<td>RGD835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>StrataSys</td>
			<td>Objet 260 Connex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>15-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16000069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-015-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-000-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-strep</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-900-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WKY 3M-22 rat aortic smooth muscle cells</td>
			<td>Provided by T. Wight [ref 21]</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of custom agarose wells for cell seeding and tissue ring self-assembly using 3d-printed molds

Инженерии тканей клинически используются для замены и ремонта тканей и в настоящее время разрабатываются как инструменты для проверки наркотиков и болезней человека моделирования. Собственн-собранные тканей предлагают преимущества над основанных на эшафот тканевой инженерии, например расширенной матрицы осаждения, прочность и функции. Однако есть несколько доступных методов для изготовления 3D тканей без заполнения ячеек на или в рамках поддержки эшафот. Ранее мы разработали систему для изготовления колец собственн-собранные ткани путем заполнения ячеек в не клей агарозы скважины. Полидиметилсилоксан (PDMS) негативные впервые был брошен в торцевой поликарбонатный плесень, а затем агарозы был загущенное в PDMS негативные для создания кольцевой ячейки, заполнение скважины. Тем не менее универсальность этого подхода была ограничена резолюции инструменты для обработки формы поликарбоната. Здесь мы демонстрируем, что 3D-печатные пластиковые может использоваться как альтернатива механической поликарбоната для изготовления PDMS негативов. 3D-печатные формы и пересмотренные формы дизайн проще в использовании, недороги в производстве и требует значительно меньше агарозы и PDMS в клетку, посев хорошо. Мы продемонстрировали, что результирующая агарозы скважин может использоваться для создания кольца собственн-собранные ткани с заказной диаметрами от целого ряда различных типов клеток. Кольца могут затем использоваться механические, функциональные и гистологический анализ, или для изготовления более крупных и более сложных трубчатых тканей.

Эта система позволяет простой, заказной изготовление агарозы клеток, заполнение скважины, что позволяет клетке самосборки кольцевой 3D инженерии тканей. 3D печать позволяет лучше разрешение и большей гибкости в дизайн плесень, чем обработка поликарбоната, где размеры ограничены размерами доступные средства. С высоким разрешением 3D-принтер стены тонкие, как 0,254 мм могут быть напечатаны, и размеры корыта ограничены только разрешение принтера (15.2 мкм разрешение для этих исследований). Как правило CNC фрезы менее 0,3 мм не коммерчески доступных, так что это не возможно создать желобов меньше ширины. Микро фрезы может производить меньше функций, хотя необходимое оборудование может быть запретительно дорогостоящими или недоступными для многих лабораториях биомедицинских исследований. Размеры корыта и кривизны также ограничены пластинами оконечности форму. Кроме того функции, такие как угловые или конические стены не возможны, и малые функции могут сломаться во время процесса обработки.
Чертежи CAD могут быть легко изменены для создания 3D-печатные формы и негативы PDMS настраиваемые размеры. Рисунок 3 описывает размеры нашей текущей 2 мм пост 3D-печатные формы, по сравнению с предыдущих итераций дизайна. Этот процесс является недорогим; 2 мм, 5-кольцо 3D-печатные формы стоимости 44.67 USD для 3D печати и каждая часть может использоваться для создания нескольких PDMS негативов. На сегодняшний день, мы создали более чем 30 PDMS негативов из одной формы 3D-печати. Каждый отрицательный требует 25 g PDMS на 0,11 USD за g (2.75 USD за PDMS негативных). Каждый отрицательный PDMS могут быть очищены с моющим средством, газобетона и повторно использоваться для вплоть до нескольких лет, в зависимости от частоты использования. По сравнению с оригинальной конструкции18, компактный 3D-печатные формы использует значительно меньше PDMS и агарозы на 2 мм ткани кольцо (рис 1E).
Клетки посеян в скважинах уравновешенной агарозы статистические формы ткани кольца в менее чем за 24 ч. кольцо размеры зависят размеры скважин агарозы. Здесь мы продемонстрировали, что собственн-собранные крыса гладкомышечные клетки кольца могут быть изготовлены в скважинах с 2, 4 или 12 мм диаметр должностей (рис. 4). В то время как кольца в этом исследовании были только культивировали в течение 3 дней, мы ранее культивируемых hSMC кольца до 2 недель22, и МСК хряща кольца до 3 недель13. Как сообщалось ранее, кольца может функционировать как 3D в vitro модели человеческих тканей для количественной оценки ткани функционировать11 и механическую прочность13,22и может также служить как здания модульные единицы генерировать ткани трубчатые конструкции7,13. Мобильный посева условий и функциональных атрибутов ткани колец инженерии из этих типов клеток кратко излагаются в таблице 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig1.jpg"> Рисунок 1: поликарбонатные формы конструкций. Первоначально формы 15-Ну были обработаны в поликарбоната (A). Более поздние версии признакам более компактный дизайн (B), с 5 скважин, впишется в одном поликарбоната плесень и в пределах одной скважиной 6-ну плиты. Здесь мы изменили этот дизайн использовать 3D-печатные пластиковые как более настраиваемый альтернатива механической поликарбоната (C). В (D) изображены агарозы скважин, изготовленный из первоначального дизайн18 (слева) по сравнению с текущей компактный дизайн (справа), который требует значительно меньше агарозы и не требуют ручного разделение скважин. Количество PDMS и агарозы, необходимых для каждой итерации разработки приведены в (E). Центр сообщений являются 2 мм в диаметре. Плесень в (A) — 6 см x 12 см, (B) имеет 5 см в диаметре, и (C) имеет диаметр 6 см. Линейки в (D) = 3 см. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig1large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig2.jpg"> Рисунок 2: Изготовление колец собственн-собранные ткани. 3D-печатные формы используется для приведения PDMS негатив, который затем используется для приведения агарозы скважин (A). Клетки затем посеяны непосредственно в агарозном скважин, где они вычисляются в менее чем 24 часа для формы ткани кольца (B). Пунктирные линии в (B) показывают хорошо наброски. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig3.jpg"> Рисунок 3: вид поперечного сечения 3D-печатные формы CAD чертеж. Показаны размеры ширина желоба (A), высота желоба (B), центральное отверстие (C), Общий диаметр (D), внешние губы (E) и наружной стены высотой (F). Наружные стены (1), верхняя часть скважин (2) и центр отверстия (3) являются конические (под углом 5 ° на 1 и 3, 45 ° 2) улучшить легкость удаления негативных PDMS. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig4.jpg"> Рисунок 4: чертежи CAD с соответствующими PDMS негативов и собственн-собранные SMC кольца с 2 (A), 4 (B) и (C) 12мм должность диаметров. (A), (1) указывает насечку для обеспечения ориентации, (2) указывает на центральное отверстие для улучшения перфузии, (3) это номер файла, который отпечатки непосредственно на PDMS негативы, и (4) показывает внешней стены, которая Это коническая облегчить негативные удаления PDMS. Масштаб баров в скважинах агарозы = 1 cm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig4large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Тип ячейки</td>
			<td>Клетки, семенами за кольцо</td>
			<td>Диаметр кольца</td>
			<td>Продолжительность культуры</td>
			<td>Функциональный анализ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Крыса SMC</td>
			<td>0,5, 1 или 3 x 10-6
</td>
			<td>2, 4 или 12 мм</td>
			<td>3 дня</td>
			<td>Текущие исследования; Н/Д</td>
		</tr>
<tr>
<td>
iPSC производные SMC 11
</td>
			<td>0,6 х 106
</td>
			<td>2 мм</td>
			<td>17 дней</td>
			<td>Испытания сократительной способности, однонаправленное испытание на растяжение, гистологический анализ</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Человека SMC 22
</td>
			<td>0,4 х 106
</td>
			<td>2 мм</td>
			<td>2, 7 или 14 дней</td>
			<td>Однонаправленное испытание на растяжение, гистологический анализ</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Человека MSC 14
</td>
			<td>0,4 х 106
</td>
			<td>2 мм</td>
			<td>21 дней</td>
			<td>Однонаправленное испытание на растяжение, гистологический анализ, кольцо фьюжн и сжатие трубки, тестирование, дифференцировку в хрящевой ткани</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Число клеток, необходимых для изготовления кольцо из различных типов клеток.

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds at JoVE.com

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Этот протокол описывает платформу для изготовления колец собственн-собранные ткани в переменной размеров с помощью заказной 3D-печати прессформа. Негативы PDMS лечатся в 3D-печатные формы; затем агарозы приведен в вылечить PDMS негативов. Клетки посеяны в результате агарозы скважин, где они вычисляются в ткани кольца.

Изготовление пользовательских агарозы скважин для заполнения клеток и тканей кольцо самостоятельной сборки с использованием 3D-печатные формы

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Режиссер Сотовая самосборки для изготовления Cell-Производные Кольца тканей для биомеханического анализа и тканевая инженерия

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Бесконтактная, этикетки без мониторинга клеток и внеклеточного матрикса использованием спектроскопии комбинационного

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Человека хрящевой ткани Изготовление с использованием трехмерных струйных технологии печати

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Rapid and Low-cost Prototyping of Medical Devices Using 3D Printed Molds for Liquid Injection Molding

Быстрое и дешевое прототипов медицинских устройств с использованием 3D печатных Пресс-формы для литья под давлением жидкости

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Синтез катионизированные Magnetoferritin для сверхбыстрое НАМАГНИЧЕННОСТИ клеток

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Масштабирование Engineered сосудистых трансплантатов С помощью 3D печатных руководств и кольцо Метод Stacking

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, ...

Custom Engineered Tissue Culture Molds from Laser-etched Masters

Пользовательские инженерных форм культуры ткани от мастеров лазером

As the field of tissue engineering has continued to mature, there has been increased interest in a wide range of tissue parameters, including tissue ...

Agarose-based Tissue Mimicking Optical Phantoms for Diffuse Reflectance Spectroscopy

На основе агарозы ткани, подражая оптических фантомы для диффузного отражения спектроскопии

This protocol describes how to make agarose-based tissue-mimicking phantoms and demonstrates how to determine their optical properties using a ...

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Заполнение и имплантации биосинтетических ткани инженерии трахеи трансплантата в мышиной модели

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

3D печать пористых целлюлозы нанокомпозитных гидрогеля подмости

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...