Name: fabrication of custom agarose wells for cell seeding and tissue ring self-assembly using 3d-printed molds
Uploaded: 2018-04-02T12:30:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds at JoVE.com

Vi erkänna tacksamt Dr Erica Stults (akademisk forskning & ansökan vetenskapsman, WPI informationstekniktjänster) för hennes hjälp med 3D utskrift, Amanda Zoë Reidinger, Ph.D., Chris Nycz och Karen Levi, M.E., för deras insatser på mögel design, Kathy Suqui och Jennifer Mann för deras hjälp testning mögel design och Michael O'Keefe för hans hjälp med filmning.  Detta arbete stöds av NSF IGERT DGE 1144804 (MWR, har), NIH R15 HL097332 (MWR, TAH), NSF GRO EEC0754996 (BA), NIH 1R01 EB023907 (MWR, har) och NIH R15 HL137197 (MWR, har).
<div></div>

1. förbereda 3D-tryckt mögel
<ol><li>Förbereda en CAD-ritning av mögel i önskade dimensioner.</li>
	<li>Skicka CAD-filen till en högupplöst 3D-skrivare. Välj lämplig utskrift plastmaterial, med glansig finish.</li>
	<li>Efter utskrift, tvätta mögel med rengöringsmedel och vatten.</li>
</ol>2. gjutning PDMS negativ
<ol><li>Mät önskad mängd PDMS bas på en balans. För en mögel med en 60 mm diameter och 2 mm inlägg väl, Använd 25 g.</li>
	<li>Lägg till härdare på en 1:10 (w/w) förhållandet till PDMS basen.</li>
	<li>Rör kraftigt tills de två komponenterna är noggrant kombinerade. Otillräcklig blandning kan leda till ofullständig härdning av PDMS, vilket resulterar i en ”klibbig” yta.</li>
	<li>Placera en bit laboratorium tejp runt kanten av 3D-tryckt formar, att möjliggöra bildandet av ett PDMS bas lager ovanför de tryckta brunnarna.</li>
	<li>Häll PDMS blandningen i formen och placera formen i en vakuumkammare avinstallation gas tills alla bubblor är släppt.</li>
	<li>Bota PDMS vid 50 ° C i 2 – 4 timmar, eller tills stelnat tillräckligt för att ta bort.</li>
	<li>Ta bort lab tejpen och försiktigt extrahera PDMS negationen.</li>
	<li>Inkubera i PDMS vid 60 ° C för en ytterligare 1 h (efter borttagning från 3D-tryckt mögel) för att säkerställa att mögel är helt botad.</li>
	<li>Tvätta PDMS noggrant med rengöringsmedel och vatten för att avlägsna eventuella rester. Otillräcklig tvättning kan resultera i dålig ring bildning för de första användningarna av PDMS negativa.</li>
</ol>3. tillverka agaros Wells
<ol><li>Förbereda agaros brunnar 1 dag före sådd celler.</li>
	<li>Gör en 2% (w/v) agaros lösning i DMEM och autoklav.</li>
	<li>Pipettera 4 mL smälta agarosen till en Ånghärdad PDMS negativt. Sedan negativ Pipettera agaros direkt in i inläggen för PDMS. Ta bort eventuella luftbubblor med Pipettera spets, som bubblor kan orsaka inhomogeneities i mått.</li>
	<li>Obs: Överfyll inte formar; den övre ytan Agarens måste vara plan, så att agaros brunnar nivå vid borttagning från PDMS och placering i 6-väl kultur plattor. Överblivna agaros kan vara re-autoklaveras och användas igen, även om inte mer än en gång.</li>
	<li>Efter Agarens kyler (ca 10 min för 4 mL agaros; större formar kan behöva längre kyla gånger), noggrant skilja agaros brunnarna från de PDMS negativ med trubbig pincett och överför till en väl 6-bra platta.</li>
	<li>Dränka agaros brunnarna i komplett odlingsmedium och temperera över natten i en 37 ° C inkubator före användning.</li>
</ol>4. sådd vävnad ringar
<ol><li>Kultur råtta aorta glatt muskulatur celler21 (RaSMCs) i DMEM innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS), 1% L-glutamin, 1% icke-essentiella aminosyror, 1% natrium pyruvat och 1% penicillin-streptomycin tills de når 70% sammanflödet. Obs: Celler bör vara odlade på 5% CO2 och 37 ° C i 15 cm vävnadsodling plattor.</li>
	<li>Efter att formarna är utjämnad (avsnitt 3), förbereda RaSMCs för sådd.</li>
	<li>Skölj plattor två gånger med 5 mL per platta fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).</li>
	<li>Lägga till 3 mL 0,25% trypsin per 15 cm petriskål. Flytta plattorna till en 37 ° C inkubator för 2 – 3 min, eller tills cellerna har lyfte plattan.</li>
	<li>Neutralisera trypsin med en lika stor volym (3 mL per platta) komplett odlingsmedium. Att resuspendera cellerna noga för att bryta upp klumpar.</li>
	<li>Späd en alikvot av cellsuspensionen 1:1 med trypan blått färgämne, och räkna cellerna med en hemocytometer.</li>
	<li>Centrifugera den totala volymen av cellsuspensionen för 5 min vid 200 x g till pellet celler.</li>
	<li>Återsuspendera cellerna vid en koncentration på 10 miljoner celler per mL. Detta kommer att resultera i 500 000 celler per 50 µL. Anmärkning: Olika celltyper kan kräva annan cell koncentrationer.</li>
	<li>Aspirera alla medium från agaros mögel. Var noga med att ta bort alla medium från enskilda brunnar, men att inte punktera bottnar i brunnarna.</li>
	<li>Överför med pipett 50 µL av suspensionen i varje brunn.</li>
	<li>Tillsätt försiktigt 2 mL färsk medium runt utsidan av agaros mögel. Var noga med att inte låta medium overflow i brunnar Agarens. Placera tallrikar i inkubatorn över natten (ca 16 h).</li>
	<li>Efter natten inkubation, aspirera på medellång från utanför formarna och Lägg 4,5 mL färsk medium till varje brunn av 6-väl plattan så att formarna och ringar är helt nedsänkt. Förändring medium dagligen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>L'Heureux, N., Paquet, S., Labbe, R., Germain, L., Auger, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+completely+biological+tissue-engineered+human+blood+vessel.">A completely biological tissue-engineered human blood vessel.</a> FASEB J. 12 (1), 47-56 (1998).</li><li>Adebayo, O., Hookway, T. A., Hu, J. Z., Billiar, K. L., Rolle, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+smooth+muscle+cell+tissue+rings+exhibit+greater+tensile+strength+than+cell-seeded+fibrin+or+collagen+gel+rings.">Self-assembled smooth muscle cell tissue rings exhibit greater tensile strength than cell-seeded fibrin or collagen gel rings.</a> J Biomed Mater Res A. 101 (2), 428-437 (2013).</li><li>Hayashi, K., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+stem+cell+aggregates+with+gelatin+microspheres+to+enhance+biological+functions.">Preparation of stem cell aggregates with gelatin microspheres to enhance biological functions.</a> Acta Biomater. 7 (7), 2797-2803 (2011).</li><li>Kelm, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+concept+for+scaffold-free+vessel+tissue+engineering:+self-assembly+of+microtissue+building+blocks.">A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks.</a> J Biotechnol. 148 (1), 46-55 (2010).</li><li>McAllister, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+haemodialysis+access+with+an+autologous+tissue-engineered+vascular+graft:+a+multicentre+cohort+study.">Effectiveness of haemodialysis access with an autologous tissue-engineered vascular graft: a multicentre cohort study.</a> Lancet. 373, 1440-1446 (2009).</li><li>Svoronos, A. A., Tejavibulya, N., Schell, J. Y., Shenoy, V. B., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-mold+design+controls+the+3D+morphological+evolution+of+self-assembling+multicellular+microtissues.">Micro-mold design controls the 3D morphological evolution of self-assembling multicellular microtissues.</a> Tissue Eng Part A. 20 (7-8), 1134-1144 (2014).</li><li>Gwyther, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+vascular+tissue+fabricated+from+aggregated+smooth+muscle+cells.">Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells.</a> Cells Tissues Organs. 194 (1), 13-24 (2011).</li><li>Mehesz, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+robotic+biofabrication+of+tissue+spheroids.">Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids.</a> Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).</li><li>Laterreur, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+direct+burst+pressure+and+the+ring+tensile+test+methods+for+mechanical+characterization+of+tissue-engineered+vascular+substitutes.">Comparison of the direct burst pressure and the ring tensile test methods for mechanical characterization of tissue-engineered vascular substitutes.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 34, 253-263 (2014).</li><li>L'Heureux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tissue-engineered+blood+vessels+for+adult+arterial+revascularization.">Human tissue-engineered blood vessels for adult arterial revascularization.</a> Nat Med. 12 (3), 361-365 (2006).</li><li>Dash, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Engineered+Vascular+Rings+from+Human+iPSC-Derived+Smooth+Muscle+Cells.">Tissue-Engineered Vascular Rings from Human iPSC-Derived Smooth Muscle Cells.</a> Stem Cell Reports. 7 (1), 19-28 (2016).</li><li>Heureux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+tissue-engineered+vascular+media:+a+new+model+for+pharmacological+studies+of+contractile+responses.">A human tissue-engineered vascular media: a new model for pharmacological studies of contractile responses.</a> FASEB J. 15, 515-524 (2001).</li><li>Dikina, A. D., Strobel, H. A., Lai, B. P., Rolle, M. W., Alsberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+cartilaginous+tubes+for+tracheal+tissue+replacement+via+self-assembly+and+fusion+of+human+mesenchymal+stem+cell+constructs.">Engineered cartilaginous tubes for tracheal tissue replacement via self-assembly and fusion of human mesenchymal stem cell constructs.</a> Biomaterials. 52, 452-462 (2015).</li><li>Twal, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellularized+microcarriers+as+adhesive+building+blocks+for+fabrication+of+tubular+tissue+constructs.">Cellularized microcarriers as adhesive building blocks for fabrication of tubular tissue constructs.</a> Ann Biomed Eng. 42 (7), 1470-1481 (2014).</li><li>Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+vascular+tissue+engineering+using+bioprinting.">Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting.</a> Biomaterials. 30 (30), 5910-5917 (2009).</li><li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+facilitated+scaffold-free+tissue+unit+fabrication.">3D printing facilitated scaffold-free tissue unit fabrication.</a> Biofabrication. 6 (2), 1-11 (2014).</li><li>Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rods,+tori,+and+honeycombs:+the+directed+self-assembly+of+microtissues+with+prescribed+microscale+geometries.">Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries.</a> The FASEB Journal. 21 (14), 4005-4012 (2007).</li><li>Gwyther, T. A., Hu, J. Z., Billiar, K. L., Rolle, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cellular+self-assembly+to+fabricate+cell-derived+tissue+rings+for+biomechanical+analysis+and+tissue+engineering.">Directed cellular self-assembly to fabricate cell-derived tissue rings for biomechanical analysis and tissue engineering.</a> J Vis Exp. (57), e3366 (2011).</li><li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+functional+biomaterials+for+tissue+engineering.">3D printing of functional biomaterials for tissue engineering.</a> Curr Opin Biotechnol. 40, 103-112 (2016).</li><li>Jakab, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+by+self-assembly+and+bio-printing+of+living+cells.">Tissue engineering by self-assembly and bio-printing of living cells.</a> Biofabrication. 2 (2), 022001 (2010).</li><li>Lemire, J. M., Potter-Perigo, S., Hall, K. L., Wight, T. N., Schwartz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Rat+Aortic+Smooth+Muscle+Cells+Differ+in+Versican/PG-M+Expression.">Distinct Rat Aortic Smooth Muscle Cells Differ in Versican/PG-M Expression.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 16 (6), 821-829 (1996).</li><li>Strobel, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+self-assembly+with+microsphere+incorporation+for+growth+factor+delivery+within+engineered+vascular+tissue+rings.">Cellular self-assembly with microsphere incorporation for growth factor delivery within engineered vascular tissue rings.</a> Tissue Eng Part A. 23 (3-4), 143-155 (2017).</li><li>Strobel, H. A., Calamari, E. L., Beliveau, A., Jain, A., Rolle, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+characterization+of+electrospun+polycaprolactone+and+gelatin+composite+cuffs+for+tissue+engineered+blood+vessels.">Fabrication and characterization of electrospun polycaprolactone and gelatin composite cuffs for tissue engineered blood vessels.</a> JBMR Part B. , (2017).</li><li>Napolitano, A. P., Chai, P., Dean, D. M., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+self-assembly+of+complex+cellular+aggregates+on+micromolded+nonadhesive+hydrogels.">Dynamics of the self-assembly of complex cellular aggregates on micromolded nonadhesive hydrogels.</a> Tissue Eng. 13 (8), 2087-2094 (2007).</li><li>Gwyther, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Engineered Vascular Tissue Generated by Cellular Self-Assembly. , (2012).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

Här har vi presenterat en mångsidig metod för snabb tillverkning av själv monterade vävnad ringar med enkelt anpassade dimensioner med hjälp av 3D-utskrifter. Vår metod är liknande som rapporterats i Svoronos et al. 6 , där 3D-tryckt honeycomb och hund-ben formade vax mögel användes att kasta PDMS negativ. Formarna har dock ändrats för att innehålla flera unika designfunktioner. Ett snäpp (figur 4A(1)) ger orientering av mögel så att varje ring märkt och övervakas individuellt. Hål i mitten (figur 4A(2)) hjälper till att förbättra spridningen av medium i brunnar. CAD filnummer är tryckta direkt på mögel; Därför PDMS negativ är varje märkta med versionsnummer och bokför diameter (figur 4A3). Avsmalnande ytterväggarna (figur 3(1), 5 °), på toppen av väl dalar (figur 3(2), 45 °) och centrala hål (figur 3(3), 5 °) gör det lättare att ta bort PDMS negativ från 3D-tryckt formarna , och agaros brunnar är lättare att ta bort från PDMS negativen (figur 4A(2), A(4)).
Vi har visat detta system mångsidighet genom att tillverka själv monterade ringformade vävnader i olika diametrar och celltyper, inklusive primära mänskliga muskulatur celler (SMCs)18,22, råtta aorta SMCs7 , 23, humana mesenkymala stamceller (hMSCs)13och SMCs härrör från inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs)11 (tabell 1). I pågående arbete, vi utvärderar bildandet av ringar från ytterligare celltyper som endotelceller, och fusing brosk ringar i olika storlekar för potentiella tillämpningar i luftrör ersättare. Förutom helt cell-derived konstruktioner, har vi också använt detta system för att tillverka ringar med inbyggda tvärbunden gelatin mikrosfärer13,22. Mikrosfärer kan införlivas inom vävnad ringar under självmontering för att ge ytterligare mekanisk styrka, eller för lokaliserade leverans av tillväxtfaktorer13,22.
När fabricera vävnad ringar, kan optimering av cell nummer krävas för olika celltyper. Minsta cell nummer kan variera baserat på storlek och typ av celler. Till exempel hSMCs som härrör från iPSCs är seedade 600 000 celler/ring11, hMSCs och primära hSMCs är seedade på 400 000 celler/ring13,22, och råtta aorta SMCs är seedade 500 000 celler/ring18. Tråg dimensioner påverka ring bildning och det minsta antalet celler krävs för ring bildandet24. För studier med mänskliga celler och 3D-tryckt formar användes en tråg bredd 2 mm. Ursprungliga polykarbonat formarna hade tråg bredden 3,75 mm, som krävt 750 000 hSMCs att bilda en 2 mm cell ring18. Med minskad tråg bredd kunde vi minska antalet celler nödvändiga för ring bildas med 46% till 400 000 celler per ring25. Mängder av celler seedade per ring sammanfattas i tabell 1.
När du väljer ett 3D-tryckt material, behöver många faktorer beaktas. Eftersom PDMS härdas vanligen vid 60 ° C, 3D-tryckt material måste ha en tillräckligt hög smälttemperatur att undvika skador under PDMS härdning. Smälttemperaturen för det material som används i denna studie (ett patentskyddat material, se Tabell för material) finns inte. När bakat vid 60 ° C för 1 h, konstaterade vi dock att materialet började producera en lukt. Därför beslöt vi att sänka bota temperatur till 50 ° C och öka härdningstiden för att baka PDMS utan att skada det 3D-tryckt materialet. Justeringar i härdningstid kan vara nödvändigt om formar ändras till form större PDMS negativ. En ytterligare härdning period vid 60 ° C efter PDMS avlägsnande från 3D-tryckt formarna förhindrar den slutliga PDMS negativa återstående tacky, samtidigt begränsa temperaturen 3D-tryckt mögel är utsatt för. Observera att vissa material hämma härdning av PDMS, så se till att det valda materialet är kompatibel med PDMS. Slutligen måste också mögel material toxicitet beaktas. Även 3D-tryckt mögel inte kommer vara i direkt kontakt med celler, är det möjligt att några rester från mögel kan överföras till det negativa under förfarandet för härdning PDMS. Vi fann att mycket grundlig tvätt med rengöringsmedel var tillräcklig för att ta bort eventuella rester från den negativa PDMS. Dock har vi tidigare observerade att otillräcklig tvättning ledde till dålig ring bildande i agaros brunnar för första några användningsområden för den negativa PDMS. Användning av PDMS rösterna från andra 3D-tryckt material kan kräva ytterligare utredning för att verifiera att tvättmedel räcker att ta bort mögel restprodukter, inbegripet eventuella potentiella lakvatten. Periodisk provning kan också vara nödvändigt, eftersom det möjligt att upprepade värme cykler (även till 50 ° C) kan skada mögel över tid, och leda till ökningar i rester efter upprepad användning. Hittills har vi använt en enda 3D-tryckt mögel för att producera mer än 30 PDMS negativ som har använts för att framgångsrikt skapa vävnad ringar.
Övergripande, 3D utskrift gör större mångsidighet för tillverkning av agaros formar än bearbetning av polykarbonat. Det ger en högre upplösning än vad som är möjligt med verktyg och mögel design begränsas inte av dimensionerna av de tillgängliga verktygen. Detta möjliggör för större anpassning, och tillägg av funktioner såsom nedtrappning som eventuellt inte med bearbetning. Detta system kan tillämpas på fabricera själv monterade vävnader i andra former också, förutom ringar6,17. Använder metoden ring fabrication har vi utvecklat vävnad ringar från en mängd olika celltyper och storlekar för potentiella tillämpningar i luftrör tissue engineering13, konstruerade blodkärl7och modellering vaskulära sjukdomar11.

Cellulära självmontering strategier för att fabricera vävnadstekniska blodkärl är ett alternativ till byggnadsställning-baserade metoder. Själv monterade, byggnadsställning-fri vävnader kan ha större cell densiteten, förbättrad matrix nedfall och styrka och förbättrad biologisk funktion jämfört med byggnadsställning-baserade vävnader1,2,3,4 . Bilda 3D vävnader utan användning av EXOGEN byggnadsställning stöd med specifika storlekar och former är dock fortfarande en utmaning. Vissa metoder smälter samman lager av cell ark att bilda tjockare konstruktioner, även om denna process kan vara tidskrävande och labor intensiv5. Alternativt, celler kan seedade i icke-häftande formar och tillåtet till samlade in spheroids, ringar och andra vävnad former6,7,8.
Själv monterade vävnad ringar kräver färre celler, kortare kultur tider och mindre reagenser än större tubulär konstruerad vävnader, men kan fortfarande vara mekaniskt testade, undersöktes histologiskt eller används för kontraktilitet och andra funktionella tester7 , 9 , 10 , 11. eftersom de kan snabbt fabricerade och enkelt testas, vävnad ringar är idealiska för screening stort antal kultur parametrar, och har potential för användning som sjukdom modeller11 eller verktyg för drug screening12. Dessutom ringar kan vara smält till komplexare vävnad strukturer som blodkärl eller luftstrupen7,13, och ringar kan säkring mer fullständigt än andra former såsom spheroids14,15.
Agaros används allmänt som ett mögel material för fabricera själv monterade vävnader på grund av dess biokompatibilitet, permeabilitet och icke-cell vidhäftningsegenskaper. Exempelvis fabricerade Norotte et al. agaros formar från strängpressad stång, vilket möjliggjorde begränsad kontroll över mögel form och krävs specialutrustning15. Tan et al. deponeras alginat droppar som byggnadsenheter för att fabricera anpassade hydrogel formar i olika former (pyramid, square)16. Den stora diametern av de alginat spheroids (300 µm) resulterade dock i funktioner med låg upplösning. Sådan låg upplösning kan resultera i ojämn mögel ytor som kan inverka negativt på cell aggregering konsistens. Alternativt, agaros kan gjutas in polymer negativ att skapa icke-häftande formar med smidig funktioner och specifika dimensioner6,7,17.
Tidigare rapporterade vi ett system för att fabricera anpassade ringformig agaros cell-sådd brunnar från en PDMS negativa rösterna i ett slipat polykarbonat mögel7,18. Agaros var hälls i PDMS negationen och tillåtet att sätta7,18. Cellerna var sedan seedad i agaros brunnar, där de samman för att bilda själv samlat, byggnadsställning-fri vävnad ringar på mindre än 24 h7,18. PDMS negativ är autoklaverbart, kan återanvändas många gånger och är mjuka och flexibla, vilket gör det enkelt att ta bort stelnad agaros brunnarna. När detta system rapporterades först i Gwyther o.a. 7, PDMS negativ kastades från slipat polykarbonat formar (figur 1A). Efter agaros gjutning, var cell sådd brunnarna individuellt klipp ut och placeras i brunnar i en 12-väl plattan7,18. Designen ändrades nyligen att en enda agaros mögel producerar 5 ringar och passar i en väl 6-well platta, vilket eliminerar behovet av att klippa ut enskilda brunnar och minska mängden PDMS och agaros som krävs för att producera varje ring (figur 1B). En mindre cell sådd tråg bredd användes för att minska antalet seedade celler krävs för att uppnå ring bildas. Trots dessa förändringar, upplösning och anpassning av formar begränsades till tillgängliga standard pinnfräs dimensioner och micromilling kan vara oöverkomligt kostsamma. Dessutom dator numerisk styrning (CNC) bearbetning kan vara tidskrävande och besvärligt på grund av behovet av att reservera tid på utnyttjad hårt anpassad utrustning, ytterligare datorstödd tillverkning (CAM) programvara för att konvertera den datorstödd design ( CAD) filen till en programmerbar verktygsväg och pålitlig fixturering å polykarbonat under bearbetning.
I den aktuella studien undersökte vi användningen av 3D-utskrifter som ett alternativ till CNC-bearbetning. 3D-printing används ofta för engineering anpassade implantat, fabricera byggnadsställning material, och för direktutskrift av celler och vävnad spheroids15,19,20. Vi använde en högupplöst 3D-skrivare, och specialiserade 3D utskrift material som möjligt för oss att skriva ut en styv mögel med en slät, glansig ytbehandling (se Tabell för material). Vår teknik möjliggör tillverkning av mycket anpassningsbar, högupplösta plastformar som kan användas för gjutning PDMS negativ och agaros brunnar. Design iterationer sammanfattas i figur 1. Den mögel designen ändrades ytterligare i den 3D-tryckt mögel versionen att inkludera avsmalnande ytterväggarna och ett centrumhål för att underlätta borttagning av både PDMS negativen från 3D-tryckt formar och agaros brunnarna från PDMS negativ. Dessa koniska funktioner kan inte uppnås med standard bearbetningsprocesser. Avståndet från botten av brunnarna till botten av formen ökades i denna iteration, vilket resulterar i en tjockare agaros bas nedan inlägg att minska risken för inlägg bryter under agaros väl borttagning. Mögel och ring fabrication förfarandet visas schematiskt i figur 2.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>15-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroWhite</td>
			<td>StrataSys</td>
			<td>RGD835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>StrataSys</td>
			<td>Objet 260 Connex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>15-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16000069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-015-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-000-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-strep</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-900-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WKY 3M-22 rat aortic smooth muscle cells</td>
			<td>Provided by T. Wight [ref 21]</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of custom agarose wells for cell seeding and tissue ring self-assembly using 3d-printed molds

Bakåtkompilerade vävnader används kliniskt för vävnad reparation och utbyte, och utvecklas som verktyg för drogkontroll och mänskliga sjukdomar modellering. Själv monterade vävnader erbjuder fördelar över byggnadsställning-baserade vävnadsteknik, såsom förbättrad matrix nedfall, styrka och funktion. Men finns det några tillgängliga metoderna för att fabricera 3D vävnader utan sådd celler eller inom en stödjande byggnadsställning. Tidigare har utvecklat vi ett system för fabricera själv monterade vävnad ringar av sådd celler i icke-häftande agaros brunnar. Ett Polydimetylsiloxan (PDMS) negativa kastades först i en bearbetad polykarbonat mögel och sedan agaros var geléartad i den negativa PDMS att skapa ringformade cell sådd brunnar. Mångsidigheten hos denna strategi var dock begränsat resolution av verktyg som finns för bearbetning polykarbonat mögel. Här visar vi att 3D-tryckt plast kan användas som ett alternativ till maskinbearbetade polykarbonat för fabricera PDMS negativ. Den 3D-tryckta formen och reviderade mögel design är enklare att använda, billig att producera och kräver betydligt mindre agaros och PDMS per cell sådd väl. Vi har visat att de resulterande agaros brunnarna kan användas att skapa själv monterade vävnad ringar med anpassade diametrar från en mängd olika celltyper. Ringar kan sedan användas för mekaniska, funktionella och histologisk analys, eller för att tillverka större och mer komplexa tubulär vävnader.

Detta system möjliggör enkelt, anpassade tillverkning av agaros cell sådd brunnar som gör att cellen självmontering av ringformade 3D konstruerad vävnader. 3D-utskrifter gör bättre upplösning och större flexibilitet i mögel design än bearbetning polykarbonat, där dimensioner begränsas av de tillgängliga verktyg storlekarna. Med en högupplöst 3D-skrivare, väggar så tunn som 0.254 mm kan skrivas och tråg dimensioner begränsas endast av upplösningen på skrivaren (15,2 µm upplösning för dessa studier). Typiskt, CNC pinnfräsar mindre än 0,3 mm är inte kommersiellt tillgängliga, så det inte är möjligt att skapa dalar av mindre bredder. Micro-fräsning kan producera mindre funktioner, även om utrustningen som krävs kan vara oöverkomligt dyra eller otillgängliga för många biomedicinsk forskningslaboratorier. Tråg dimensioner och krökning begränsas också av pinnfräs tip form. Dessutom funktioner vinklad såsom eller avsmalnande väggar är inte möjliga, och små funktioner kan bryta under bearbetningsprocessen.
CAD-ritningar kan enkelt modifieras för att producera 3D-tryckt formar och PDMS negativ av anpassningsbara dimensioner. Figur 3 beskriver dimensionerna av vår nuvarande 2 mm post 3D-tryckt formar, jämfört med tidigare design iterationer. Processen är billiga. 2 mm, 5-ring 3D-tryckt mögel kostnad 44.67 USD till 3D print och varje del kan användas för att skapa flera PDMS negativ. Hittills har vi skapat mer än 30 PDMS negativ från en enda 3D-tryckt mögel. Varje negativ kräver 25 g PDMS på 0,11 USD per g (2,75 USD per PDMS negativa). Varje PDMS negativ kan rengöras med rengöringsmedel, lättbetong och autoklaverad, och återanvändas för upp till flera år, beroende på användningsfrekvens. Jämfört med den ursprungliga design18, använder kompakt 3D-tryckta formen betydligt mindre PDMS och agaros per 2 mm vävnad ring (figur 1E).
Celler seedade i skakad agaros brunnarna aggregerad form vävnad ringarna på mindre än 24 h. Ring dimensioner beror på dimensioner av agaros brunnarna. Här, visat vi att själv monterade råtta smidig muskel cell ringar kan fabriceras i brunnar med 2, 4 eller 12 mm diameter inlägg (figur 4). Ringar i denna studie var endast odlade i 3 dagar, vi har tidigare odlade hSMC ringar för upp till 2 veckor22medan hMSC-brosk ringar för upp till 3 veckor13. Som rapporterats tidigare, kan ringar fungera som 3D in vitro- modeller av mänskliga vävnader för kvantitativ bedömning av vävnad fungerar11 och mekanisk hållfasthet13,22, och kan också tjäna som modulbyggnader enheter till generera rör-formad vävnad konstruktioner7,13. Cell sådd villkor och funktionella attributen för vävnad ringar konstruerad från dessa celltyper sammanfattas i tabell 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig1.jpg"> Figur 1: polykarbonat mögel design. Inledningsvis var 15-väl formar bearbetas i polykarbonat (A). Senare versioner skisserat en mer kompakt design (B), med 5 brunnar för att passa i en enda polykarbonat mögel och inom ett väl 6-bra platta. Här, ändrade vi denna design att använda 3D-tryckt plast som ett mer anpassningsbara alternativ till maskinbearbetade polykarbonat (C). Som visas i (D) är agaros brunnar fabricerade från ursprungliga design18 (vänster) jämfört med den nuvarande kompakt designen (höger), som kräver betydligt mindre agaros, och kräver inte manuell separation av brunnar. Mängder av PDMS och agaros som krävs för varje design iteration visas i (E). Center inlägg är 2 mm i diameter. Mögel i (A) är 6 cm x 12 cm, (B) har en 5 cm i diameter, och (C) har en 6 cm i diameter. Skalstapeln i (D) = 3 cm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig1large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig2.jpg"> Figur 2: tillverkning av själv monterade vävnad ringar. En 3D-tryckt mögel är används för att kasta en PDMS negativ, som sedan används för att casta agaros brunnarna (A). Celler är sedan seedade direkt i agaros brunnar, där de samlade i mindre än 24 h att bilda vävnad ringar (B). Streckade linjer i (B) visar väl konturen. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig3.jpg"> Figur 3: tvärsnittsvyn av 3D-tryckt mögel CAD ritning. Mått för tråg bredd (A), lägsta höjd (B), centrumhål (C), totala diameter (D), yttre läpp (E) och yttervägg höjd (F) visas. Den yttre väggar (1), övre delen av wells (2) och centrumhål (3) är avsmalnande (i 5 ° vinkel för 1 och 3, 45 ° för 2) för att förbättra användarvänlighet PDMS negativa borttagning. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig4.jpg"> Figur 4: CAD-ritningar med motsvarande PDMS negativ och själv monterade SMC ringar med 2 (A), 4 B och 12 c mm posta diametrar. (A), (1) anger ett snäpp för att ge orientering, (2) indikerar ett hål i mitten för att förbättra perfusion, (3) är ett filnummer, vilket avtryck direkt på PDMS negativen, och (4) visar den yttre vägg, vilket är avsmalnande för att underlätta PDMS negativa borttagning. Skala barer i agaros brunnar = 1 cm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig4large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Celltyp</td>
			<td>Celler som seedade per ring</td>
			<td>Ring diameter</td>
			<td>Kultur varaktighet</td>
			<td>Funktionell analys utförs</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rat SMC</td>
			<td>0,5, 1 eller 3 x 106
</td>
			<td>2, 4 eller 12 mm</td>
			<td>3 dagar</td>
			<td>Aktuella studien; EJ TILLÄMPLIGT</td>
		</tr>
<tr>
<td>
iPSC härrör SMC 11
</td>
			<td>0,6 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>17 dagar</td>
			<td>Kontraktilitet provning, enaxlig dragprovet, histologisk analys</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Mänskliga SMC 22
</td>
			<td>0,4 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>2, 7 eller 14 dagar</td>
			<td>Enaxlig dragprovet, histologisk analys</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Mänskliga MSC 14
</td>
			<td>0,4 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>21 dagar</td>
			<td>Enaxlig dragprovet, histologisk analys, ring fusion och tube komprimering testning, differentiering till broskvävnad</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Cell nummer krävs för ring tillverkning från olika celltyper.

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds at JoVE.com

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Det här protokollet beskriver en plattform för att fabricera själv monterade vävnad ringar i varierande storlekar med hjälp av ett anpassat 3D-tryckt plast mögel. PDMS negativ botas i 3D-tryckta formen; sedan gjuts agaros i härdade PDMS negativ. Celler är seedade i resulterande agaros brunnar där de samlade i vävnad ringar.

Tillverkning av anpassade agaros brunnar för Cell sådd och vävnad Ring självmontering med 3D-tryckt formar

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Riktad Cellular Self-Assembly att tillverka-cellerna Tissue Ringar för Biomekaniska analys och Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Beröringsfri, Label-free övervakning av celler och extracellulär matris med Raman-spektroskopi

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Human Brosk Tissue Fabrication Använda Tredimensionell Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Rapid and Low-cost Prototyping of Medical Devices Using 3D Printed Molds for Liquid Injection Molding

Snabb och billig Prototyping för medicintekniska produkter Använda 3D Tryckt Formar för Liquid Injection Molding

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Syntes av katjoniserad Magnetoferritin för ultrasnabb magnetiseringen av celler

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Skalning av Engineered kärlimplantat Använda 3D tryckta guider och Ring Stacking Method

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, ...

Custom Engineered Tissue Culture Molds from Laser-etched Masters

Specialkonstruerade vävnadsodling formar från lasergraverade Masters

As the field of tissue engineering has continued to mature, there has been increased interest in a wide range of tissue parameters, including tissue ...

Agarose-based Tissue Mimicking Optical Phantoms for Diffuse Reflectance Spectroscopy

Agaros-baserade vävnad härma optiska fantomer för diffus reflektans spektroskopi

This protocol describes how to make agarose-based tissue-mimicking phantoms and demonstrates how to determine their optical properties using a ...

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Sådd och Implantation av en biosyntetiska vävnadstekniska trakeal transplantat i en musmodell

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

3D tryckta porösa cellulosa Nanocomposite Hydrogel ställningar

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...