Name: rapid detection of neurodevelopmental phenotypes in human neural precursor cells (npcs)
Uploaded: 2018-03-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af New Jersey guvernør Rådet for medicinalforskning og behandling af autisme (CAUT13APS010; CAUT14APL031; CAUT15APL041), Nancy Lurie markerer Family Foundation, Mindworks velgørende bly tillid og jødiske samfund grundlaget for større MetroWest NJ.

1. sikkerhedsprocedurer og biosikkerhed kabinet vedligeholdelse
<ol><li>
Biosikkerhed niveau-2 (BSL-2) sikkerhedsprocedurer
	<ol>
<li>Følg retningslinjerne for institutionens arbejde med BSL-2 materialer. Bortskaffe BSL-2 materialer ifølge institutionens praksis. Angive lokaler og udstyr, der bruges til BSL-2 materialer. Bære alle personlige værnemidler (PPE), herunder laboratoriekittel og handsker.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Biosikkerhed kabinet vedligeholdelse
	<ol>
<li>Bruge en bio...

Protokollerne præsenteres her illustrere hurtige og enkle metoder til at studere grundlæggende udviklingsforstyrrelser processer og teste vækstfaktorer og narkotika ved hjælp af hiPSC-afledte neurale forløber celler. hiPSC teknologi har revolutioneret studiet af patogenesen af udviklingsforstyrrelser sygdomme ved at forsyne os med hidtil uset adgang til levende menneskelige neuronale celler fra berørte personer. Faktisk har der været talrige hiPSC undersøgelser af nervesystemets udvikling herunder Rett syndrom, T...

Brug af enklere organismer og musemodeller har belyst mekanismerne af grundlæggende hjernens udvikling samt sygdom patogenese. Trods disse fremskridt stadig ætiologien af mange neuropsykiatriske lidelser undvigende fordi ikke alle resultater i enklere organismer er direkte relevante for komplekse aspekter af sygdomme hos mennesker. Yderligere, den større kompleksitet af den menneskelige hjerne ofte gør det vanskeligt at model menneskelig udvikling og lidelser i dyr. Med evolution og udvikling af menneskelige inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs) teknologi, kan somatiske celler omprogrammeres til stamceller og derefter opdeles i neuronale celler til at studere sygdomme hos mennesker. Fremskridt i hiPSCs og "omic" teknologier (genomforskning, transcriptomics, proteomics, metabolomics) lover at revolutionere forståelse af menneskelige hjerne udvikling. Disse teknologier nu gøre muligt et "præcision medicin" tilgang til karakterisering af neuropsykiatriske sygdomme på et sag til sag grundlag.
Den nuværende hæfteklamme i feltet hiPSC sygdom-modellering er at differentiere celler i specifikke neuronal undertyper i en éncellelag eller bruge et 3D kultur system kaldet en organoid til at sammenfatte aspekter af hjernens udvikling1,2, 3. Disse systemer har været utrolig værdifuld i at undersøge og afdække unikke aspekter af menneskelig udvikling og sygdom4,5,6,7. Men både neuronal kulturer og organoids kræver ofte overalt fra uger til måneder i kultur før de er klar til at studere. Tidskrævende arten af disse protokoller og de nødvendige midler til at opretholde disse kultur systemer ofte begrænse antallet af eksperimenter, der kan udføres, og antallet af variabler (som vækstfaktorer eller narkotika), der kan testes. Desuden, mange undersøgelser bruger post mitotiske neuroner og organoids har fokuseret på processer såsom dendrit udvækst eller synapse dannelse, som opstår senere i udvikling. Mens disse processer har været impliceret i patologi af udviklingsforstyrrelser som autisme og skizofreni, er tidligere udviklingsmæssige hændelser, der indtræffer før endelige neuronal differentiering også vigtige for sygdom patogenese8 ,9,10,11,12,13. Ja, de seneste genomisk undersøgelser viser, at de midten af fostrets periode, som består af spredning, proces udvækst og migration, er særlig vigtigt i autisme patogenese11,14. Derfor er det vigtigt at studere neurale stamceller og stamfader cellepopulationer til bedre at forstå disse tidligere processer. Organoid systemer, der er anset for bedre at kunne sammenfatte menneskelige hjerne udvikling på grund af deres 3D karakter og organiseret struktur, indeholder en stamfader pool, der har været udnyttet til at studere nogle af disse tidligere hændelser. Men stamfader befolkningen i organoids er ofte sparsom og mere som radial gliaceller end neurale stamceller eller stamfader celler5,15. Det ville således være gavnligt at have en høj overførselshastighed metode til at studere tidlige stadier af nervesystemets udvikling i befolkningens aktivt proliferativ celle.
I laboratoriet, har vi lavet en protokol, der bruger hiPSC-afledte neurale forløber celler (NPC), en blandet befolkning af neurale stamceller og stamceller, der er meget proliferativ, at studere Neuro-udviklingsmæssige processer såsom spredning, celle migration, og indledende proces (neurite) forlængelse. Disse undersøgelser blev udviklet fra teknikker, der anvendes i vores lab i årtier at kunne studere nervesystemets udvikling i rotter og mus kortikale kulturer16,17,18,19,20, 21,22,23. Vigtigere, blev det også vist sig at fænotyper og regulerende signaler defineret i rotter og mus kultur systemer er meget intelligent af mekanismer, der er aktive i vivo, der angiver værdien af disse teknikker16, 17,18,19,24. Efter indledende differentiering af hiPSCs til NPCs, disse metoder giver os mulighed at studere vitale udviklingsmæssige processer i løbet af få dage. Disse metoder har mange fordele: (1) de kræver lidt avanceret udstyr og er nem at implementere, (2) talrige eksperimentelle replikater kan gennemføres i en kort periode, giver mulighed for hurtig bekræftelse af reproducerbarhed af resultaterne, og (3) kultur variabler som belægning matricer, virkningerne af vækstfaktorer og aktivitet af narkotika kan testes, hurtigt og omkostningseffektivt. Desuden, vi drage fordel af ekstracellulære vækstfaktorer veletableret rolle som kritiske regulatorer af forskellige udviklingsprocesser. NPCs var udsat for at vælge udviklingsmæssige signaler, der direkte stimulerer begivenheder som spredning, neurite udvækst og celle migration, og har fundet de forbedre evnen til at identificere mangler, der ikke er synlige i kontrol betingelser19 , 25 , 26 , 27 , 28. på samme måde at lette vurderingen af lægemidler giver en kraftfuld avenue for at vedtage præcision medicin teknikker for at teste effektiviteten af forskellige terapeutiske indgreb. Således, denne protokol giver en høj overførselshastighed, reproducerbar, og enkel metode til at studere tidlige hjernens udvikling, sygdom patogenese og de potentielle gavnlige effekter af vækstfaktorer og narkotika på udviklingsforstyrrelser fænotyper.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1091">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:323px;">PSC Neural Induction Medium: 
			Protocol Link: https://goo.gl/euub7a&#160;</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">A1647801</td>
			<td style="width:472px;">This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Advanced DMEM/F12 Medium</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">12634-010</td>
			<td style="width:472px;">Component of 100% Expansion Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Neurobasal Medium</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">21103049</td>
			<td style="width:472px;">Component of both NIM and 100% Expansion Medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:323px;">hESC-qualified Matrigel</td>
			<td style="width:185px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">354277</td>
			<td style="width:472px;">hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Y-27632 (2HCl), 1 mg</td>
			<td style="width:185px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:111px;">72302</td>
			<td style="width:472px;">ROCK inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:323px;">6 well plates</td>
			<td style="width:185px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">COR-3506</td>
			<td style="width:472px;">Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">24 well plates</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">2021-05</td>
			<td style="width:472px;">Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">35 mm dishes</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">2021-01</td>
			<td style="width:472px;">Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Natural Mouse Laminin</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:111px;">23017-015</td>
			<td style="width:472px;">Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">F1141</td>
			<td style="width:472px;">Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">P0899</td>
			<td style="width:472px;">Substrate for coating plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">15140122</td>
			<td style="width:472px;">Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:185px;">Gibco</td>
			<td style="width:111px;">A11105-01</td>
			<td style="width:472px;">1X Cell Detachment Solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">2.5% Trypsin (10X)</td>
			<td style="width:185px;">Gibco</td>
			<td style="width:111px;">15090-046</td>
			<td style="width:472px;">10X enzymatic solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">0.5 M EDTA</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td>AM9261</td>
			<td style="width:472px;">used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">tritiated [3H]-thymidine</td>
			<td style="width:185px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:111px;">NET027E001</td>
			<td style="width:472px;">Radioactive tritium, thymidine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation Vials</td>
			<td style="width:185px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:111px;">03-337-1</td>
			<td style="width:472px;">Vials for liquid scintillation counting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">EcoLite(+)</td>
			<td style="width:185px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:111px;">0188247501&#160;</td>
			<td style="width:472px;">Liquid scintillation cocktail</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counter</td>
			<td style="width:185px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:111px;">8043-30-1194</td>
			<td style="width:472px;">Liquid Scintillation Counter</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:323px;">Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019</td>
			<td style="width:185px;">Molecular Devices &#38; Skatron Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:472px;">Semi-automatic cell harvester</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Click-iT EdU Alexa Fluor&#174; 488 Imaging Kit</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">C10337</td>
			<td style="width:472px;">EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">15250061</td>
			<td style="width:472px;">Assessing viability of cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Grade GF/C filter paper</td>
			<td style="width:185px;">GE Healthcare Life Sciences, Whatman</td>
			<td style="width:111px;">1822-849</td>
			<td style="width:472px;">Glass fiber filter paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Human Basic FGF-2</td>
			<td style="width:185px;">Peprotech</td>
			<td style="width:111px;">100-18B</td>
			<td style="width:472px;">growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38)</td>
			<td>BACHEM</td>
			<td>H-8430</td>
			<td>neuropeptide</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid detection of neurodevelopmental phenotypes in human neural precursor cells (npcs)

Menneskelige hjerne udvikling skrider frem gennem en serie af netop orkestreret processer, med tidligere stadier fornem spredning, migration og neurite udvækst; og senere stadier karakteriseret ved axon/dendrit udvækst og synapse dannelse. I nervesystemets udvikling, er ofte en eller flere af disse processer forstyrret, fører til abnormiteter i hjernen dannelsen og funktionen. Med fremkomsten af menneskelige inducerede pluripotente stamceller (hiPSC) teknologi har forskere nu en rigelig forsyning af humane celler, der kan opdeles i stort set enhver celletype, herunder neuroner. Disse celler kan bruges til at studere både normal hjernens udvikling og sygdom patogenese. Et antal protokoller ved hjælp af hiPSCs at modellere neuropsykiatriske sygdomme brug terminalt differentieret neuroner eller brug 3D kultur systemer betegnes organoids. Mens disse metoder har vist sig uvurderlige i at studere menneskelig sygdom patogenese, er der nogle ulemper. Differentiering af hiPSCs i neuroner og generation af organoids er lange og dyre processer, der kan påvirke antallet af eksperimenter og variabler, der kan vurderes. Hertil kommer, mens post mitotiske neuroner og organoids giver mulighed for undersøgelse af sygdom-relaterede processer, herunder dendrit udvækst og synaptogenesis, udelukker de undersøgelse af tidligere processer som spredning og migration. I nervesystemets såsom autisme, rigelige genetiske og post mortem tyder på, mangler i tidlige udviklingsprocesser. Neurale forløber celler (NPC), en meget proliferativ celle population, kan være en velegnet model til at stille spørgsmål om ontogenetiske processer og sygdom indledning. Vi udvider nu metoder lært af at studere udvikling i mus og rotter kortikale kulturer til menneskelige NPCs. Brug af NPCs tillader os at undersøge sygdomsrelaterede fænotyper og definere hvordan forskellige variabler (fx, vækstfaktorer, narkotika) indvirkning udviklingsmæssige processer herunder spredning, migrering og differentiering i kun et par dage. I sidste ende, dette værktøjssæt kan bruges i en reproducerbar og høj overførselshastighed måde for at identificere sygdoms-specifikke mekanismer og fænotyper i nervesystemets udvikling.

Ét mål af disse undersøgelser er at definere den proliferativ aktivitet af NPC'ere, dvs en stigning i celle antal. Dette opnås ved at vurdere DNA syntese af cellen total befolkning, en høj overførselshastighed tilgang, der måler iblanding af radioaktive sporstof tritiumholdigt thymidine i celle ekstrakter, og afspejler alle celler involveret i S-fase, uanset om de er syntese i 5 minutter eller hele to timer. Derudover tillade disse assays bestemmelse af andelen af celler, som angiv...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs at JoVE.com

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs

Neuro-udviklingsmæssige processer såsom spredning, migration og neurite udvækst er ofte desorienterede i neuropsykiatriske sygdomme. Dermed, vi præsenterer protokoller for at hurtigt og reproducerbar vurdere disse Neuro-udviklingsmæssige processer i menneskelig iPSC-afledte NPCs. Disse protokoller tillader også vurdering af virkningerne af relevante vækstfaktorer og therapeutics på NPC udvikling.

Hurtig påvisning af udviklingsforstyrrelser fænotyper i menneskelige neurale forløber celler (NPC)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs)

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Direkte Induktion af humane neurale stamceller fra perifert blod hæmatopoietiske stamceller

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Dyrkning Menneskelig pluripotente og neurale stamceller i en Lukket Cell Culture System for Basic og Prækliniske Research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

Isolering af Perivaskulær multipotente precursorcelle populationer fra humant hjertevæv

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Hurtig neuronal differentiering af induceret pluripotente stamceller til måling Network Aktivitet på Micro-elektrode Arrays

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Instrueret differentiering af Primitive og endelige hæmatopoietisk ophav fra humane pluripotente stamceller

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Generation af iPSC-afledte menneskelige hjerne organoider til Model Tidlig forstyrrelser i nervesystemets

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Hurtig, instrueret differentiering af retinale Pigment epitel celler fra menneskelige embryonale eller induceret pluripotente stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Zika Virus infektion af kulturperler menneskelige fostrets hjerne neurale stamceller til andre analyse

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation af Somite derivater fra menneskelige induceret celler pluripotente stamceller

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Kontrolleret kortikal indvirkning model af mus hjerneskade med terapeutisk transplantation af menneskeskabte pluripotente stamcelle-afledte neurale celler

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...