Name: rapid detection of neurodevelopmental phenotypes in human neural precursor cells (npcs)
Uploaded: 2018-03-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dal Consiglio del governatore New Jersey per la ricerca medica e trattamento di autismo (CAUT13APS010; CAUT14APL031; CAUT15APL041), Nancy Lurie segna la Fondazione di famiglia, Mindworks Charitable Trust di piombo e la Fondazione di comunità ebraica di maggiore MetroWest NJ.

1. armadio di sicurezza biologica manutenzione e procedure di sicurezza
<ol><li>
Procedure di sicurezza livello di biosicurezza 2 (BSL-2)
	<ol>
<li>Seguire le linee guida dell'istituzione lavorando con materiali BSL-2. Smaltire materiali BSL-2 secondo le pratiche dell'istituzione. Indicare le camere e le attrezzature che vengono utilizzati per BSL-2 materiali. Indossare tutti i dispositivi di protezione individuale (PPE), camice e guanti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Armadio di sicurezza biologica m...

I protocolli presentati qui illustrano i metodi di semplici e veloci per lo studio dei processi fondamentali dello sviluppo neurologico e verificare i fattori di crescita e farmaci che utilizzano cellule precursori neurali hiPSC-derivati. la tecnologia hiPSC ha rivoluzionato lo studio della patogenesi delle malattie neurodevelopmental fornendoci un accesso senza precedenti a vivere umane cellule neuronali da individui affetti. Infatti, ci sono stati numerosi studi hiPSC di disturbi dello sviluppo neurologico, tra cui la ...

L'uso di organismi più semplici e modelli murini ha chiarito i meccanismi di sviluppo di base del cervello così come la patogenesi della malattia. Nonostante questi progressi, l'eziologia di molti disturbi neuropsichiatrici resta sfuggente, perché non tutti i risultati negli organismi più semplici sono direttamente rilevanti per aspetti complessi della malattia umana. Inoltre, la maggiore complessità del cervello umano spesso rende difficile lo sviluppo umano di modello e disturbi negli animali. Con l'evoluzione e il progresso della tecnologia (hiPSCs) le cellule staminali pluripotenti indotte umane, cellule somatiche può essere riprogrammate in cellule staminali e quindi differenziate in cellule di un neurone per studiare la malattia umana. Gli avanzamenti nelle tecnologie hiPSCs e "omiche" (genomica, trascrittomica, proteomica e metabolomica) promettono di rivoluzionare la comprensione dello sviluppo del cervello umano. Queste tecnologie rendono ora possibile un approccio di "precisione medicina" per la caratterizzazione della malattia neuropsichiatrica caso per caso.
La graffetta corrente nel campo di malattia-modellazione hiPSC è di differenziare le cellule in sottotipi neuronali specifici in un monostrato o a utilizzare un sistema di cultura 3D chiamato un organoid per ricapitolare gli aspetti del cervello sviluppo1,2, 3. Questi sistemi sono stati incredibilmente preziosi nello studio e scoprire aspetti unici di sviluppo umano e malattia4,5,6,7. Tuttavia, sia colture neuronali e organoids spesso richiedono ovunque da settimane a mesi nella cultura prima che siano pronti a studiare. La natura che richiede tempo di questi protocolli e la quantità di risorse necessarie per mantenere che questi sistemi di cultura spesso limitano il numero di esperimenti che possono essere effettuati e il numero di variabili (come fattori di crescita o farmaci) che possono essere testati. Inoltre, molti studi che utilizzano organoids e neuroni post-mitotici sono concentrati sui processi come la formazione di dendrite escrescenza o sinapsi, che si verificano più avanti nello sviluppo. Mentre questi processi sono stati implicati nella patologia di disturbi dello sviluppo come l'autismo e la schizofrenia, all'inizio dello sviluppo eventi che si verificano prima definitiva differenziazione neuronale sono anche importanti per la patogenesi della malattia8 ,9,10,11,12,13. Infatti, recenti studi genomici mostrano che il periodo di metà-fetale, che è composto di proliferazione, conseguenza del processo e la migrazione, è particolarmente importante nell'autismo patogenesi11,14. Pertanto, è importante studiare le staminali neurali e popolazioni di cellule progenitrici per comprendere meglio questi processi precedenti. Organoid sistemi, che sono lo sviluppo del cervello umano di riepilogo considerato al meglio a causa della loro natura 3D e la struttura organizzata, contengono un pool di cellule progenitrici che è stato utilizzato per studiare alcuni di questi eventi precedenti. Tuttavia, la popolazione di cellule progenitrici in organoids è spesso scarsa e più come cellule gliali radiali di neurali staminali o progenitrici cellule5,15. Così, sarebbe utile avere un metodo di throughput elevato per studiare le prime fasi del neurosviluppo in una popolazione delle cellule attivamente proliferative.
In laboratorio, abbiamo creato un protocollo che utilizza le cellule precursori neurali hiPSC-derivato (NPC), una popolazione mista di progenitrici cellule staminali neurali e che è altamente proliferative, di studiare i processi neurodevelopmental quali la proliferazione, migrazione cellulare, e estensione del processo iniziale (neurite). Queste analisi sono state sviluppate da tecniche utilizzate nel nostro laboratorio per decenni per studiare con successo neurosviluppo nei ratti e topi culture corticali16,17,18,19,20, 21,22,23. D'importanza, inoltre è stato indicato che fenotipi e segnali di regolazione definiti nei sistemi di coltura di ratti e topi sono altamente predittivi di meccanismi che sono attivi in vivo, che indica il valore di queste tecniche16, 17,18,19,24. Dopo la differenziazione iniziale di hiPSCs di NPC, questi metodi ci permettono di studiare processi vitali dello sviluppo in pochi giorni. Questi metodi hanno molti vantaggi: (1) richiedono poco sofisticate apparecchiature e sono facili da implementare, (2) numerose repliche sperimentali possono essere condotti in un breve periodo di tempo, permettendo per conferma veloce della riproducibilità dei risultati e (3) variabili di cultura come matrici di rivestimento, gli effetti dei fattori di crescita e l'attività dei farmaci possono essere testate in modo rapido ed economico. Inoltre, approfittiamo del ruolo ormai consolidato di fattori di crescita extracellulari come regolatori critici di diversi processi di sviluppo. I PNG sono stati esposti per selezionare i segnali dello sviluppo che direttamente stimolano eventi come proliferazione, neuriti e migrazione cellulare e hanno trovato che migliorano la capacità di identificare i difetti che non sono evidenti in condizioni di controllo19 , 25 , 26 , 27 , 28. allo stesso modo, la facilità di valutazione farmaci fornisce un potente viale per adottare tecniche di medicina di precisione per verificare l'efficacia dei vari interventi terapeutici. Così, questo protocollo facilita un throughput elevato, riproducibile e semplice metodologia per studiare lo sviluppo iniziale del cervello, patogenesi della malattia e gli effetti benefici potenziali di fattori di crescita e di droghe sui fenotipi neurodevelopmental.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1091">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:323px;">PSC Neural Induction Medium: 
			Protocol Link: https://goo.gl/euub7a&#160;</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">A1647801</td>
			<td style="width:472px;">This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Advanced DMEM/F12 Medium</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">12634-010</td>
			<td style="width:472px;">Component of 100% Expansion Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Neurobasal Medium</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">21103049</td>
			<td style="width:472px;">Component of both NIM and 100% Expansion Medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:323px;">hESC-qualified Matrigel</td>
			<td style="width:185px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">354277</td>
			<td style="width:472px;">hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Y-27632 (2HCl), 1 mg</td>
			<td style="width:185px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:111px;">72302</td>
			<td style="width:472px;">ROCK inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:323px;">6 well plates</td>
			<td style="width:185px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">COR-3506</td>
			<td style="width:472px;">Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">24 well plates</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">2021-05</td>
			<td style="width:472px;">Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">35 mm dishes</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">2021-01</td>
			<td style="width:472px;">Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Natural Mouse Laminin</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:111px;">23017-015</td>
			<td style="width:472px;">Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">F1141</td>
			<td style="width:472px;">Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">P0899</td>
			<td style="width:472px;">Substrate for coating plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">15140122</td>
			<td style="width:472px;">Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:185px;">Gibco</td>
			<td style="width:111px;">A11105-01</td>
			<td style="width:472px;">1X Cell Detachment Solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">2.5% Trypsin (10X)</td>
			<td style="width:185px;">Gibco</td>
			<td style="width:111px;">15090-046</td>
			<td style="width:472px;">10X enzymatic solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">0.5 M EDTA</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td>AM9261</td>
			<td style="width:472px;">used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">tritiated [3H]-thymidine</td>
			<td style="width:185px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:111px;">NET027E001</td>
			<td style="width:472px;">Radioactive tritium, thymidine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation Vials</td>
			<td style="width:185px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:111px;">03-337-1</td>
			<td style="width:472px;">Vials for liquid scintillation counting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">EcoLite(+)</td>
			<td style="width:185px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:111px;">0188247501&#160;</td>
			<td style="width:472px;">Liquid scintillation cocktail</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counter</td>
			<td style="width:185px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:111px;">8043-30-1194</td>
			<td style="width:472px;">Liquid Scintillation Counter</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:323px;">Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019</td>
			<td style="width:185px;">Molecular Devices &#38; Skatron Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:472px;">Semi-automatic cell harvester</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Click-iT EdU Alexa Fluor&#174; 488 Imaging Kit</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">C10337</td>
			<td style="width:472px;">EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">15250061</td>
			<td style="width:472px;">Assessing viability of cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Grade GF/C filter paper</td>
			<td style="width:185px;">GE Healthcare Life Sciences, Whatman</td>
			<td style="width:111px;">1822-849</td>
			<td style="width:472px;">Glass fiber filter paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Human Basic FGF-2</td>
			<td style="width:185px;">Peprotech</td>
			<td style="width:111px;">100-18B</td>
			<td style="width:472px;">growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38)</td>
			<td>BACHEM</td>
			<td>H-8430</td>
			<td>neuropeptide</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid detection of neurodevelopmental phenotypes in human neural precursor cells (npcs)

Lo sviluppo del cervello umano procede attraverso una serie di precisamente orchestrati processi, con fasi precedenti illustri di proliferazione, migrazione e neuriti; e fasi successive, caratterizzate dalla formazione di escrescenza e sinapsi dell'assone/dendrite. In disturbi dello sviluppo neurologico, spesso uno o più di questi processi sono interrotti, che conduce alle anomalie nella formazione del cervello e funzione. Con l'avvento della tecnologia (hiPSC) sulle cellule staminali umane pluripotenti indotte, i ricercatori hanno ora un'abbondante fornitura di cellule umane che possono essere differenziati in praticamente qualsiasi tipo di cellula, compresi i neuroni. Queste cellule possono essere utilizzate per studiare lo sviluppo normale del cervello e la patogenesi della malattia. Un numero di protocolli di utilizzo hiPSCs per modello malattia neuropsichiatrica uso terminalmente differenziate neuroni o sistemi di coltura 3D uso definito organoids. Mentre questi metodi hanno dimostrato preziosi per lo studio della patogenesi della malattia umana, ci sono alcuni svantaggi. Differenziazione di hiPSCs in neuroni e generazione dei organoids sono processi lunghi e costosi che possono influenzare il numero di esperimenti e le variabili che possono essere valutate. Inoltre, mentre organoids e neuroni post-mitotici consentono lo studio dei processi di relazione con la malattia, tra cui dendrite escrescenza e sinaptogenesi, precludono lo studio dei processi precedenti come proliferazione e la migrazione. In disturbi dello sviluppo neurologico, come l'autismo, la prova genetica e post-mortem abbondante indica difetti nei processi di sviluppo precoce. Le cellule precursori neurali (NPC), una popolazione altamente proliferative delle cellule, possono essere un modello adatto in cui porre domande su processi ontogenetici e l'inizio di malattia. Estendiamo ora metodologie imparati dallo studio sviluppo nel topo e ratto culture corticali di NPC umani. L'uso dei PNG permette di indagare fenotipi correlati alla malattia e definire come le diverse variabili (ad es., fattori di crescita, farmaci) impatto inerente allo sviluppo processi tra cui la proliferazione, migrazione e differenziazione in pochi giorni. In definitiva, questo set di strumenti utilizzabile in modo riproducibile e ad alta produttività per identificare i meccanismi specifici di malattia e fenotipi in disturbi dello sviluppo neurologico.

Uno degli obiettivi di questi studi consiste nel definire l'attività proliferativa degli NPC, vale a dire un aumento nei numeri delle cellule. Questo risultato è ottenuto mediante la valutazione di sintesi del DNA della popolazione cellulare totale, un approccio di alto-rendimento che misura l'incorporazione di timidina contenente tritio tracciante radioattivo in estratti cellulari e riflette tutte le celle impegnate nella fase S, siano essi sintetizzando per 5 minuti o le ore due inter...

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Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs

Neurodevelopmental processi come proliferazione, migrazione e neuriti sono spesso perturbati in malattie neuropsichiatriche. Così, vi presentiamo protocolli per in modo rapido e riproducibile valutare questi processi neurodevelopmental in umano iPSC-derivati NPC. Questi protocolli permettono anche di valutare gli effetti di fattori di crescita e di terapeutica sullo sviluppo di NPC.

Rilevamento rapido dei fenotipi di Neurodevelopmental in cellule precursori neurali umane (NPC)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs)

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Induzione diretta di cellule staminali neurali umane da cellule periferiche del sangue emopoietiche progenitrici

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Coltura umane pluripotenti e neurali cellule staminali in un sistema di coltura cellulare chiuso per base e preclinica di ricerca

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

Isolamento di perivascolare Multipotent precursori delle cellule popolazioni dal cardiache umane Tissue

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Rapid neuronale differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte per misurare l&#39;attività di rete su array Micro-elettrodo

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Regia di differenziazione dei progenitori ematopoietici primitivi e definitivo da cellule staminali pluripotenti umane

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Generazione di IPSC-derivati ​​cervello umano organoidi per creare un modello disturbi dello sviluppo neurologico precoce

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Rapida, regia di differenziazione delle cellule epiteliali del pigmento retinico da cellule staminali pluripotenti umane embrionali o indotto

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Infezione del Virus di Zika delle cellule staminali neurali del cervello fetale umano colto per analisi Immunocytochemical

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generazione in Vitro di Somite derivati da umani indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Modello di impatto corticale controllato di lesioni cerebrali del topo con trapianto terapeutico di cellule neurali derivate da cellule staminali indotte dall'uomo

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...