Name: rapid detection of neurodevelopmental phenotypes in human neural precursor cells (npcs)
Uploaded: 2018-03-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs at JoVE.com

この作品は、医学研究と自閉症の治療 (CAUT13APS010; ニュージャージーの知事の評議会によって支えられました。CAUT14APL031;CAUT15APL041)、ナンシー Lurie マークの家族財団、Mindworks 慈善鉛信頼、および大きい MetroWest ニュージャージーのユダヤ人のコミュニティ基礎。

1. 安全手順と安全キャビネットのメンテナンス
<ol><li>
バイオ セーフティ レベル 2 (BSL-2) 安全手順
	<ol>
<li>BSL 2 材料での作業で機関のガイドラインに従ってください。金融機関のプラクティスに従って BSL 2 材料の処分します。部屋および BSL 2 材料に使用される装置を示します。すべて個人保護用具 (PPE)、白衣、手袋などを着用してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
安全キャビ...

ここに示すプロトコルは基本的な神経発達のプロセスを研究し、成長因子と薬による由来神経前駆細胞を用いたテスト迅速かつ簡単な方法を示しています。による技術は、影響を受けた個人から人間の神経細胞をライブに前例のないアクセスをご提供する、神経疾患の病態に関する研究に革命をもたらしました。確かに、レット症候群、ティモシー症候群、脆弱 X 症候群を含む発達障害の多?...

単純な生物とマウス モデルの使用は、基本的な脳の発達と病気の発症のメカニズムを解明しました。これらの進歩にもかかわらず多くの神経疾患の病因は、単純な生物でないすべての調査結果がヒトの疾患の複雑な側面に直接関連するのでとらえどころのないままです。さらに、複雑な人間の脳はしばしばモデル発達困難し、動物の疾患します。進化とひと誘導多能性幹細胞 (hiPSCs) の技術の進歩で、体細胞は幹細胞に再プログラム、人間の病気を研究する神経細胞に分化できます。(ゲノミクス、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、メタボロミクス) hiPSCs と「弔」技術進歩は、人間の脳の発達の理解に革命を約束します。これらの技術今可能する「精密医療」アプローチ ケースバイ ケースに基づいて精神神経疾患評価に。
による疾患モデリング] フィールドに現在の主食は、単分子膜の特定の神経細胞に細胞を区別するためにまたは脳開発1、2の面を要約する、organoid と呼ばれる 3次元培養システムを使用するには 3。これらのシステムは、非常に貴重な勉強と人間の発達と病気4,5,6、7のユニークな側面の覆いを取るされています。ただし、培養神経細胞およびオルガノイドしばしば必要どこでも数週間から文化ヶ月勉強する準備ができている前に。これらのプロトコルおよびこれらの文化のシステムは多くの場合実行できる実験の数とテストすることができます (成長因子や薬物) のような変数の数を制限を維持するために必要なリソースの量の時間がかかる性質。また、ポスト mitotic ニューロンとオルガノイドを利用した多くの研究は、樹状突起やシナプス形成などの開発で後で発生するプロセスに焦点を当てています。これらのプロセスは、自閉症や統合失調症などの発達障害の病理に関与している中、決定的な神経分化する前に発生する発達イベント前、にとっても重要病因8 ,9,10、11,12,13。確かに、最近のゲノム研究は増殖、プロセスの副産物と移行で構成されます - 胎児の期間は自閉症病因11,14で特に重要であるを示す.したがって、神経幹・前駆細胞集団これら以前のプロセスを理解するを検討することが重要です。Organoid システムは、人間の脳の開発のより良い考えを要約を自分の 3 D 自然と組織構造のため、これらの以前のイベントのいくつかの研究に利用されている前駆プール含みます。しかし、オルガノイドの前駆細胞の人口は疎頻繁、神経幹や前駆細胞5,15よりも放射状グリア細胞のましょう。したがって、積極的に増殖の細胞の神経発達の初期の段階を勉強する高スループット方法を持つことが有益ででしょう。
演習では、我々 はこと由来神経前駆細胞 (Npc) は増殖性が高い、増殖、細胞遊走などの神経発達のプロセスを研究する神経幹・前駆細胞の混合された人口を使用してプロトコルを作成していると初期過程 (突起) の拡張機能です。これらの試金は正常ラットとマウス皮質文化16,17,18,19,20、神経発達を研究する何十年も私たちの研究室で使用される技術から開発されました。 21,22,23。重要なは、それも表現型およびラットおよびマウスの培養システムで定義されている規制信号がアクティブある生体内で、これらのテクニックの16,の値を示すメカニズムの有力な予測が示された17,18,19,24。Npc に hiPSCs の初期分化後これらのメソッドにより数日のうちで重要な発達過程を研究することであります。これらのメソッドは、多くの利点を持っている: (1) 彼らは、少し高度な機器を必要と簡単に実装できる、結果、および (3) の再現性の迅速な確認を可能にする時間の短い期間で実験 (2) 多数のレプリケートを行うことが迅速かつ低コストでコーティング行列、成長因子の影響、薬の活動など文化変数をテストできます。さらに、我々 は多様な発達過程の重要な調節因子として細胞の成長因子の役割を確立の活用します。Npc が直接増殖、神経突起の伸長と細胞移動のようなイベントを刺激し、彼らは制御条件19で明白ではない欠陥を発見する能力を高めるために発見した発達の信号を選択にさらされました。,25,26,27,28します。 同様に、薬の評価のしやすさは様々 な治療上の介在の有効性をテストする精密医学技術を採用する強力な道を提供します。したがって、このプロトコルは高スループット、再現性、および初期の脳の発達、病気の発症や神経発達学的表現型の増殖因子と薬の潜在的な有益な効果を勉強する簡単な方法を促進します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1091">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:323px;">PSC Neural Induction Medium: 
			Protocol Link: https://goo.gl/euub7a&#160;</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">A1647801</td>
			<td style="width:472px;">This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Advanced DMEM/F12 Medium</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">12634-010</td>
			<td style="width:472px;">Component of 100% Expansion Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Neurobasal Medium</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">21103049</td>
			<td style="width:472px;">Component of both NIM and 100% Expansion Medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:323px;">hESC-qualified Matrigel</td>
			<td style="width:185px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">354277</td>
			<td style="width:472px;">hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Y-27632 (2HCl), 1 mg</td>
			<td style="width:185px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:111px;">72302</td>
			<td style="width:472px;">ROCK inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:323px;">6 well plates</td>
			<td style="width:185px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">COR-3506</td>
			<td style="width:472px;">Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">24 well plates</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">2021-05</td>
			<td style="width:472px;">Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">35 mm dishes</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">2021-01</td>
			<td style="width:472px;">Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Natural Mouse Laminin</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:111px;">23017-015</td>
			<td style="width:472px;">Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">F1141</td>
			<td style="width:472px;">Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">P0899</td>
			<td style="width:472px;">Substrate for coating plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">15140122</td>
			<td style="width:472px;">Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:185px;">Gibco</td>
			<td style="width:111px;">A11105-01</td>
			<td style="width:472px;">1X Cell Detachment Solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">2.5% Trypsin (10X)</td>
			<td style="width:185px;">Gibco</td>
			<td style="width:111px;">15090-046</td>
			<td style="width:472px;">10X enzymatic solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">0.5 M EDTA</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td>AM9261</td>
			<td style="width:472px;">used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">tritiated [3H]-thymidine</td>
			<td style="width:185px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:111px;">NET027E001</td>
			<td style="width:472px;">Radioactive tritium, thymidine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation Vials</td>
			<td style="width:185px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:111px;">03-337-1</td>
			<td style="width:472px;">Vials for liquid scintillation counting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">EcoLite(+)</td>
			<td style="width:185px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:111px;">0188247501&#160;</td>
			<td style="width:472px;">Liquid scintillation cocktail</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counter</td>
			<td style="width:185px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:111px;">8043-30-1194</td>
			<td style="width:472px;">Liquid Scintillation Counter</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:323px;">Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019</td>
			<td style="width:185px;">Molecular Devices &#38; Skatron Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:472px;">Semi-automatic cell harvester</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Click-iT EdU Alexa Fluor&#174; 488 Imaging Kit</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">C10337</td>
			<td style="width:472px;">EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">15250061</td>
			<td style="width:472px;">Assessing viability of cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Grade GF/C filter paper</td>
			<td style="width:185px;">GE Healthcare Life Sciences, Whatman</td>
			<td style="width:111px;">1822-849</td>
			<td style="width:472px;">Glass fiber filter paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Human Basic FGF-2</td>
			<td style="width:185px;">Peprotech</td>
			<td style="width:111px;">100-18B</td>
			<td style="width:472px;">growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38)</td>
			<td>BACHEM</td>
			<td>H-8430</td>
			<td>neuropeptide</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid detection of neurodevelopmental phenotypes in human neural precursor cells (npcs)

一連の増殖、移行、および神経突起伸長; によって区別以前の段階で、正確に管弦楽に編曲されたプロセスを経て人間の脳の発達後の段階が軸索・樹状突起やシナプスの形成によって特徴付けられます。神経発達障害にしばしばこれらのプロセスの 1 つ以上が破壊され、脳の形成と機能の異常に 。ひと誘導多能性幹細胞 (こと) 技術の出現により、研究者は今ニューロンを含む、あらゆる細胞に分化できる細胞の豊富な供給を持っています。これらの細胞は、通常の脳の発達と病気の発症を検討する使用ことができます。末期神経病の使用をモデル化する hiPSCs を使用してプロトコル数区別ニューロンまたは使用 3次元培養システムと呼ぶ organoids。これらのメソッドは、人間の病気の病因を調査で非常に貴重な証明されている、いくつかの欠点があります。HiPSCs ニューロンへの分化とオルガノイドの生成は、実験と評価することができる変数の数に影響を与えることができる時間のかかる、高価なプロセスです。さらに、ポスト mitotic ニューロンと organoids 樹状突起やシナプス形成など、疾患に関連するプロセスの研究を許可する拡散と移行のような以前のプロセスの研究彼ら排除します。自閉症などの発達障害では、十分な遺伝学的および事後の証拠は初期発達過程における欠陥を示します。神経系前駆細胞 (Npc)、増殖性が高い細胞集団、個体発生のプロセスと病気発生について質問するための適切なモデルがあります。我々 は今、人間 Npc をマウスおよびラットの皮質の文化の開発を勉強から学んだ方法論を拡張します。Npc の使用は、私たち病気に関連した表現を調査し、わずか数日で増殖、移行、および分化を含むどのように異なる変数 (例えば、成長因子、薬物) 影響発達プロセスを定義することができます。最終的には、病気特有のメカニズムと神経発達障害における表現型を識別するために、再現性と高スループット方法でこのツールセットを使用できます。

これらの研究の 1 つの目標は、npc の細胞数の増加は、増殖活動を定義します。合計セル人口の細胞抽出液に放射性トレーサー トリチウム チミジンの取り込みを測定し、S 期に従事しているすべてのセルを反映しているかどうかは高スループット方法の DNA 合成を評価するこ5 分や 2 時間の全体の合成。さらに、これらの試金は S 相と総細胞数, 単一細胞のより労働集?...

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Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs

増殖、移行、および神経突起伸長はしばしば脳神経疾患で摂動など発達のプロセスします。このように、迅速かつ再現性をもって人間の iPSC 由来の Npc でこれらの神経発達のプロセスを評価するためのプロトコルを提案する.これらのプロトコルには、NPC 発育に及ぼす関連成長因子と治療の評価ができます。

ひと神経前駆細胞 (Npc) における神経発達学的表現型の迅速な検出

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs)

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

末梢血造血前駆細胞からヒト神経幹細胞の直接誘導

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Basicおよび前臨床研究のための密閉型細胞培養系でヒト多能性および神経幹細胞を培養します

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

ヒト心臓組織からの血管周囲多能前駆細胞集団の単離

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

マイクロ電極アレイ上のネットワーク・アクティビティを測定するための人工多能性幹細胞の急速な神経分化

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

初期の神経発達障害をモデル化するためのiPSC由来のヒト脳オルガノイドの生成

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

人間の胚または誘導多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の急速な監督の分化

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

培養ひと胎児脳神経幹細胞の免疫細胞化学的解析のジカ ウイルス感染症

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

体節誘導体誘導される人間からの体外世代多能性幹細胞します。

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

ヒト誘導多能性幹細胞由来神経細胞の治療移植によるマウス脳損傷の制御された皮質衝撃モデル

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...