Name: rapid detection of neurodevelopmental phenotypes in human neural precursor cells (npcs)
Uploaded: 2018-03-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por el Consejo del gobernador de Nueva Jersey para investigación médica y el tratamiento del autismo (CAUT13APS010; CAUT14APL031; CAUT15APL041), Nancy Lurie marca Family Foundation, Mindworks fondo plomo benéfico y la Fundación de la comunidad judía de Nueva Jersey mayor de MetroWest.

1. procedimientos y seguridad mantenimiento del gabinete de seguridad de la biotecnología
<ol><li>
Procedimientos de seguridad de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2)
	<ol>
<li>Siga las directrices de la institución en el trabajo con materiales de BSL-2. Disponer de materiales de BSL-2 según las prácticas de la institución. Indican salas y equipos que se utilizan para materiales de BSL-2. Use todo el equipo protector personal (PPE), incluyendo guantes y bata de laboratorio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
<str...

Los protocolos presentados aquí ilustran métodos rápidos y simples para estudiar los procesos fundamentales del desarrollo neurológico y factores de crecimiento y fármacos mediante células precursoras neuronales derivados de hiPSC. hiPSC tecnología ha revolucionado el estudio de la patogénesis de las enfermedades del neurodesarrollo nos proporciona un acceso sin precedentes a vivir las células neuronales humanas de los individuos afectados. De hecho, se han realizado numerosos estudios hiPSC de trastornos del de...

El uso de organismos más simples y modelos de ratón ha dilucidado los mecanismos de desarrollo básico del cerebro así como la patogénesis de la enfermedad. A pesar de estos avances, la etiología de muchos desordenes neuropsiquiátricos permanece esquiva porque no todos los resultados en los organismos más simples son directamente pertinentes a aspectos complejos de la enfermedad humana. Además, la mayor complejidad del cerebro humano a menudo hace difícil para el desarrollo humano modelo y trastornos en los animales. Con la evolución y progreso de la tecnología de células madre (hiPSCs) pluripotentes inducidas humanas, células somáticas pueden ser reprogramadas en células madre y entonces diferenciar en células neuronales para estudiar enfermedades humanas. Avances en las tecnologías hiPSCs y "ómicas" (genómica, transcriptómica, proteómica, metabolómica) prometen revolucionar la comprensión del desarrollo del cerebro humano. Estas tecnologías ahora hacen posible un enfoque de "medicina de precisión" a la caracterización de enfermedades neuropsiquiátricas en caso por caso.
La grapa tipo actual en el campo de la enfermedad-modelado hiPSC es diferenciar las células en determinados subtipos neuronales en una monocapa o utilizar un sistema de cultivo 3D llamado un organoide para recapitular los aspectos del cerebro desarrollo1,2, 3. Estos sistemas han sido increíblemente valiosos en el estudio y descubrimiento de aspectos singulares del desarrollo humano y la enfermedad4,5,6,7. Sin embargo, culturas neuronales y organitas a menudo requieren en cualquier lugar desde semanas a meses en la cultura antes de estar listos para estudiar. La naturaleza desperdiciadora de tiempo de estos protocolos y la cantidad de recursos necesarios para mantener que estos sistemas de cultivo a menudo limitan el número de experimentos que se pueden realizar y el número de variables (como factores de crecimiento o drogas) que se puede probar. Por otra parte, muchos estudios utilizando organoides y poste-mitotic neuronas se han centrado en procesos como la formación del fruto o sinapsis dendrita, que ocurren más adelante en el desarrollo. Mientras que estos procesos han sido implicados en la patología de trastornos del desarrollo tales como autismo y esquizofrenia, antes del desarrollo eventos que ocurren antes de la diferenciación neuronal definitiva también son importantes para la patogénesis de la enfermedad8 ,9,10,11,12,13. De hecho, recientes estudios genómicos muestran que el período mediados de-fetal, que se compone de la migración, proliferación y consecuencia del proceso, es particularmente importante en la patogenesia de autismo11,14. Por lo tanto, es importante estudiar el tallo neural y poblaciones de la célula progenitora para entender mejor estos procesos anteriores. Sistemas de organoide, que están considerado mejor Recapitulemos el desarrollo del cerebro humano debido a su naturaleza 3D y estructura organizada, contienen una piscina del progenitor que se ha utilizado para estudiar algunos de estos eventos anteriores. Sin embargo, a menudo es escasa la población progenitora de organoides y más como las células gliales radiales que nervios madre o progenitora células5,15. Por lo tanto, sería beneficioso tener un método de alto rendimiento para estudiar las primeras etapas de desarrollo neurológico en una población activamente proliferativa de la célula.
En el laboratorio, hemos creado un protocolo que utiliza células precursora neuronal hiPSC derivados (PNJ), una población mezclada del tallo neural y células progenitoras que es altamente proliferativas, para el estudio del neurodesarrollo procesos como proliferación, migración de la célula, y extensión del proceso inicial (neurita). Estos ensayos se desarrollaron de las técnicas utilizadas en nuestro laboratorio durante décadas para estudiar con éxito neurodesarrollo en rata y ratón culturas corticales16,17,18,19,20, 21,22,23. Lo importante, también fue demostrado que señales regulatorias definidas en los sistemas de cultivo de rata y ratón y fenotipos son altamente predictivas de mecanismos que son activos en vivo, indicando el valor de estas técnicas16, 1718,de,19,24. Tras la diferenciación inicial de hiPSCs a NPCs, estos métodos nos permiten estudiar los procesos de desarrollo vitales en cuestión de días. Estos métodos tienen muchas ventajas: (1) requieren equipos poco sofisticados y son fáciles de implementar, (2) numerosas repeticiones experimentales pueden llevarse a cabo en un corto periodo de tiempo, lo que permite la confirmación rápida de la reproducibilidad de los resultados y (3) variables de cultura como matrices de capa, efectos de factores de crecimiento y actividad de las drogas se pueden probar rápidamente y rentable. Además, aprovechamos el papel bien establecido extracelulares de factores de crecimiento como reguladores críticos de diversos procesos de desarrollo. NPCs fueron expuestas para seleccionar las señales del desarrollo que directamente estimulan eventos como proliferación, consecuencia del neurite y migración celular y han encontrado que aumentar la capacidad de identificar defectos que no son evidentes en condiciones de control19 , 25 , 26 , 27 , 28. Asimismo, la facilidad de evaluar drogas ofrece una vía poderosa para adoptar técnicas de la medicina de precisión para comprobar la eficacia de diferentes intervenciones terapéuticas. Así, este protocolo facilita un alto rendimiento, reproducible y sencilla metodología para estudiar el desarrollo temprano del cerebro, patogénesis de la enfermedad y los efectos beneficiosos potenciales factores de crecimiento y fármacos en fenotipos del neurodesarrollo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1091">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:323px;">PSC Neural Induction Medium: 
			Protocol Link: https://goo.gl/euub7a&#160;</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">A1647801</td>
			<td style="width:472px;">This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Advanced DMEM/F12 Medium</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">12634-010</td>
			<td style="width:472px;">Component of 100% Expansion Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Neurobasal Medium</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">21103049</td>
			<td style="width:472px;">Component of both NIM and 100% Expansion Medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:323px;">hESC-qualified Matrigel</td>
			<td style="width:185px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">354277</td>
			<td style="width:472px;">hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Y-27632 (2HCl), 1 mg</td>
			<td style="width:185px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:111px;">72302</td>
			<td style="width:472px;">ROCK inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:323px;">6 well plates</td>
			<td style="width:185px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">COR-3506</td>
			<td style="width:472px;">Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">24 well plates</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">2021-05</td>
			<td style="width:472px;">Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">35 mm dishes</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">2021-01</td>
			<td style="width:472px;">Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Natural Mouse Laminin</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:111px;">23017-015</td>
			<td style="width:472px;">Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">F1141</td>
			<td style="width:472px;">Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">P0899</td>
			<td style="width:472px;">Substrate for coating plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">15140122</td>
			<td style="width:472px;">Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:185px;">Gibco</td>
			<td style="width:111px;">A11105-01</td>
			<td style="width:472px;">1X Cell Detachment Solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">2.5% Trypsin (10X)</td>
			<td style="width:185px;">Gibco</td>
			<td style="width:111px;">15090-046</td>
			<td style="width:472px;">10X enzymatic solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">0.5 M EDTA</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td>AM9261</td>
			<td style="width:472px;">used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">tritiated [3H]-thymidine</td>
			<td style="width:185px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:111px;">NET027E001</td>
			<td style="width:472px;">Radioactive tritium, thymidine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation Vials</td>
			<td style="width:185px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:111px;">03-337-1</td>
			<td style="width:472px;">Vials for liquid scintillation counting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">EcoLite(+)</td>
			<td style="width:185px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:111px;">0188247501&#160;</td>
			<td style="width:472px;">Liquid scintillation cocktail</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counter</td>
			<td style="width:185px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:111px;">8043-30-1194</td>
			<td style="width:472px;">Liquid Scintillation Counter</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:323px;">Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019</td>
			<td style="width:185px;">Molecular Devices &#38; Skatron Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:472px;">Semi-automatic cell harvester</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Click-iT EdU Alexa Fluor&#174; 488 Imaging Kit</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">C10337</td>
			<td style="width:472px;">EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">15250061</td>
			<td style="width:472px;">Assessing viability of cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Grade GF/C filter paper</td>
			<td style="width:185px;">GE Healthcare Life Sciences, Whatman</td>
			<td style="width:111px;">1822-849</td>
			<td style="width:472px;">Glass fiber filter paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Human Basic FGF-2</td>
			<td style="width:185px;">Peprotech</td>
			<td style="width:111px;">100-18B</td>
			<td style="width:472px;">growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38)</td>
			<td>BACHEM</td>
			<td>H-8430</td>
			<td>neuropeptide</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid detection of neurodevelopmental phenotypes in human neural precursor cells (npcs)

Desarrollo del cerebro humano se desarrolla a través de una serie de procesos precisamente orquestadas, con etapas anteriores distinguidos por la proliferación, la migración y la consecuencia del neurite; y etapas posteriores, caracterizadas por la formación de fruto y sinapsis axón/dendrita. En trastornos del desarrollo neurológico, a menudo uno o más de estos procesos se interrumpen, conduciendo a anormalidades en la formación del cerebro y la función. Con el advenimiento de la tecnología de la célula de vástago (hiPSC) pluripotentes inducidas humanas, los investigadores ahora tienen una fuente abundante de células humanas que pueden diferenciarse en cualquier tipo de célula, incluyendo las neuronas. Estas células pueden utilizarse para estudiar el desarrollo cerebral normal y patogénesis de la enfermedad. Un número de protocolos utilizando hiPSCs para modelar enfermedades neuropsiquiátricas uso terminal distinguido neuronas o uso cultura 3D sistemas llaman organoides. Mientras que estos métodos han probado inestimables en el estudio de la patogénesis de la enfermedad humana, existen algunos inconvenientes. Diferenciación de hiPSCs en neuronas y la generación de organoides son procesos largos y costosos que pueden afectar el número de experimentos y las variables que pueden evaluarse. Además, mientras que organoides y poste-mitotic neuronas permiten el estudio de los procesos relacionados con la enfermedad, como consecuencia de la dendrita y sinaptogénesis, impide el estudio de anteriores procesos como proliferación y migración. En trastornos del neurodesarrollo como autismo, abundante evidencia genética y post-mortem indica defectos en los procesos de desarrollo tempranos. Células precursoras neuronales (PNJ), una población altamente proliferativa de la célula, pueden ser un modelo adecuado en el que hacer preguntas sobre los procesos ontogenéticos y la iniciación de la enfermedad. Ahora extendemos metodologías aprendidas del estudio de desarrollo en ratón y rata culturas corticales a NPCs humanos. El uso de NPCs nos permite investigar los fenotipos relacionados con la enfermedad y definir cómo diferentes variables (p. ej., factores de crecimiento, medicamentos) impacto del desarrollo procesos como proliferación, migración y diferenciación en pocos días. En definitiva, este conjunto de herramientas puede utilizarse de forma reproducible y alto rendimiento para identificar mecanismos específicos de la enfermedad y fenotipos en trastornos del neurodesarrollo.

Uno de los objetivos de estos estudios es definir la actividad proliferativa de los PNJs, es decir, un aumento en el número de células. Esto se logra mediante la evaluación de la síntesis de ADN de la población celular total, un enfoque de alto rendimiento que mide la incorporación de timidina tritiado de trazador radioactivo en extractos celulares y refleja todas las células en fase S, ya sean sintetizar por 5 minutos o las dos horas enteras. Además, estos ensayos permiten la det...

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Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs

Desarrollo neurológico procesos como proliferación, migración y consecuencia del neurite son a menudo perturbados en enfermedades neuropsiquiátricas. Así, presentamos protocolos evaluar rápida y reproducible estos procesos del neurodesarrollo en NPCs humanos derivado de iPSC. Estos protocolos permiten la evaluación de los efectos relevantes factores de crecimiento y terapias en desarrollo de NPC.

Rápida detección de los fenotipos del neurodesarrollo en las células precursoras neuronales humanos (PNJ)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs)

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

La inducción directa de las células madre neurales humanas a partir de células de sangre periférica progenitoras hematopoyéticas

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

El cultivo humanas pluripotentes y células madre neurales en un sistema de cultivo celular cerrado para la investigación básica y preclínica

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

Aislamiento de Perivasculares Multipotentes poblaciones de células precursoras de Cardíaca Tejido humano

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Neuronal rápida diferenciación de células madre pluripotentes inducidas para la medición de actividad de red en matrices de micro-electrodos

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Dirige la diferenciación de progenitores hematopoyéticos primitivo y definitivo de las células madre Pluripotent humanas

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Generación de derivados de IPSC organoides cerebro humano para modelar los trastornos del neurodesarrollo temprano

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Diferenciación rápida y dirigida de las células epiteliales del pigmento retiniano de humanos embrionarios o inducidas pluripotenciales células

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Infección por el Virus Zika de células madre neurales de cerebro Fetal humano cultivadas para análisis de Immunocytochemical

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

En la generación de Vitro del Somite derivados humanos inducida por células madre pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Modelo de impacto cortical controlado de lesión cerebral de ratón con trasplante terapéutico de células neuronales derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...