Name: in vitro sumoylation assay to study sumo e3 ligase activity
Uploaded: 2018-01-29T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity at JoVE.com

Эта работа была поддержана от грантов от министерства науки и технологии (большинство, 105-2320-B-010-007-MY3 КЦП), национального института здравоохранения исследований (НПУ-EX105-10215BC КЦП), министерства науки и технологии (наиболее 105-2314-Б-400-019 для ХИК) и от национального института медицинских исследований (НПЗУ мг-105-SP-10, НПЗУ мг-106-SP-10-ХИК.). Эта работа была также поддерживается частично с национальным университетом Yang Ming на публикации рукописи КЦП. Спонсоры имел никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или возмещение рукописи.

1. Подготовка бакуловирусы выражение конструкций
<ol><li>
Очищать сумо E3 лигаза K-bZIP путем клонирования cDNA K-bZIP19 в вектор бакуловирусы двойного выражения (см. таблицу материалы) с N-терминальный epitope тегом. Мы имели успех с помощью тега octapeptide (указывается в протоколе как век?...

<ol>
	<li>Bies, J., Markus, J., Wolff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+attachment+of+the+SUMO-1+protein+to+the+negative+regulatory+domain+of+the+c-Myb+transcription+factor+modifies+its+stability+and+transactivation+capacity.">Covalent attachment of the SUMO-1 protein to the negative regulatory domain of the c-Myb transcription factor modifies its stability and transactivation capacity.</a> J Biol Chem. 277 (11), 8999-9009 (2002).</li><li>Lin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+SUMO-interacting+motif+in+Daxx+SUMO+modification,+subnuclear+localization,+and+repression+of+sumoylated+transcription+factors.">Role of SUMO-interacting motif in Daxx SUMO modification, subnuclear localization, and repression of sumoylated transcription factors.</a> Mol Cell. 24 (3), 341-354 (2006).</li><li>Welsh, M., Jamalpour, M., Zang, G., Akerblom, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+Src+Homology-2+domain+containing+protein+B+(SHB)+in+beta+cells.">The role of the Src Homology-2 domain containing protein B (SHB) in beta cells.</a> J Mol Endocrinol. 56 (1), 21-31 (2016).</li><li>Huang, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+pathogenesis+of+SHP2+in+developmental+disorders+and+tumorigenesis.">Structure, function, and pathogenesis of SHP2 in developmental disorders and tumorigenesis.</a> Curr Cancer Drug Targets. 14 (6), 567-588 (2014).</li><li>Perry, J. J., Tainer, J. A., Boddy, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SIM-ultaneous+role+for+SUMO+and+ubiquitin.">A SIM-ultaneous role for SUMO and ubiquitin.</a> Trends Biochem Sci. 33 (5), 201-208 (2008).</li><li>Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+function+of+RNF4+family+proteins+in+eukaryotes:+targeting+a+ubiquitin+ligase+to+SUMOylated+proteins.">Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins.</a> EMBO J. 26 (18), 4102-4112 (2007).</li><li>Ouyang, J., Shi, Y., Valin, A., Xuan, Y., Gill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+binding+of+CoREST1+to+SUMO-2/3+contributes+to+gene-specific+repression+by+the+LSD1/CoREST1/HDAC+complex.">Direct binding of CoREST1 to SUMO-2/3 contributes to gene-specific repression by the LSD1/CoREST1/HDAC complex.</a> Mol Cell. 34 (2), 145-154 (2009).</li><li>Lyst, M. J., Stancheva, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+SUMO+modification+in+transcriptional+repression+and+activation.">A role for SUMO modification in transcriptional repression and activation.</a> Biochem Soc Trans. 35, 1389-1392 (2007).</li><li>Liu, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modification+by+SUMO-1+stimulates+the+promoters+of+translation+machinery+genes.">Chromatin modification by SUMO-1 stimulates the promoters of translation machinery genes.</a> Nucleic Acids Res. 40 (20), 10172-10186 (2012).</li><li>Rosonina, E., Duncan, S. M., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+functions+in+constitutive+transcription+and+during+activation+of+inducible+genes+in+yeast.">SUMO functions in constitutive transcription and during activation of inducible genes in yeast.</a> Genes Dev. 24 (12), 1242-1252 (2010).</li><li>Chang, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromatin+modification+by+SUMO-2/3+but+not+SUMO-1+prevents+the+epigenetic+activation+of+key+immune-related+genes+during+Kaposi's+sarcoma+associated+herpesvirus+reactivation.">The chromatin modification by SUMO-2/3 but not SUMO-1 prevents the epigenetic activation of key immune-related genes during Kaposi's sarcoma associated herpesvirus reactivation.</a> BMC Genomics. 14, 824 (2013).</li><li>Neyret-Kahn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumoylation+at+chromatin+governs+coordinated+repression+of+a+transcriptional+program+essential+for+cell+growth+and+proliferation.">Sumoylation at chromatin governs coordinated repression of a transcriptional program essential for cell growth and proliferation.</a> Genome Res. 23 (10), 1563-1579 (2013).</li><li>Tatham, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+chains+of+SUMO-2+and+SUMO-3+are+conjugated+to+protein+substrates+by+SAE1/SAE2+and+Ubc9.">Polymeric chains of SUMO-2 and SUMO-3 are conjugated to protein substrates by SAE1/SAE2 and Ubc9.</a> J Biol Chem. 276 (38), 35368-35374 (2001).</li><li>Mattoscio, D., Segre, C. V., Chiocca, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+manipulation+of+cellular+protein+conjugation+pathways:+The+SUMO+lesson.">Viral manipulation of cellular protein conjugation pathways: The SUMO lesson.</a> World J Virol. 2 (2), 79-90 (2013).</li><li>Gareau, J. R., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SUMO+pathway:+emerging+mechanisms+that+shape+specificity,+conjugation+and+recognition.">The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).</li><li>Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+E2-mediated+SUMO+conjugation+revealed+by+a+complex+between+ubiquitin-conjugating+enzyme+Ubc9+and+RanGAP1.">Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1.</a> Cell. 108 (3), 345-356 (2002).</li><li>Knipscheer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubc9+sumoylation+regulates+SUMO+target+discrimination.">Ubc9 sumoylation regulates SUMO target discrimination.</a> Mol Cell. 31 (3), 371-382 (2008).</li><li>Vethantham, V., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+sumoylation+of+recombinant+proteins+and+subsequent+purification+for+use+in+enzymatic+assays.">In vitro sumoylation of recombinant proteins and subsequent purification for use in enzymatic assays.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009 (1), 5121 (2009).</li><li>Lin, S. F., Robinson, D. R., Miller, G., Kung, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+encodes+a+bZIP+protein+with+homology+to+BZLF1+of+Epstein-Barr+virus.">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus encodes a bZIP protein with homology to BZLF1 of Epstein-Barr virus.</a> J Virol. 73 (3), 1909-1917 (1999).</li><li>Yang, W. S., Hsu, H. W., Campbell, M., Cheng, C. Y., Chang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K-bZIP+Mediated+SUMO-2/3+Specific+Modification+on+the+KSHV+Genome+Negatively+Regulates+Lytic+Gene+Expression+and+Viral+Reactivation.">K-bZIP Mediated SUMO-2/3 Specific Modification on the KSHV Genome Negatively Regulates Lytic Gene Expression and Viral Reactivation.</a> PLoS Pathog. 11 (7), 1005051 (2015).</li><li>Connor, C. D., Metcalf, E., Wrighton, C. J., Harris, T. J., Saunders, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RsrII--a+novel+restriction+endonuclease+with+a+heptanucleotide+recognition+site.">RsrII--a novel restriction endonuclease with a heptanucleotide recognition site.</a> Nucleic Acids Res. 12 (17), 6701-6708 (1984).</li><li>Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+endonuclease+R-EcoRI+fragments+of+DNA+from+lambdoid+bacteriophages+and+other+viruses+by+agarose-gel+electrophoresis.">Analysis of endonuclease R-EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis.</a> J Virol. 14 (5), 1235-1244 (1974).</li><li>Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+physiology+in+Luria-Bertani+broth.">Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth.</a> J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).</li><li>Gingold, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+transformation.">Bacterial transformation.</a> Methods Mol Biol. 2, 237-240 (1985).</li><li>Brulois, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+manipulation+of+a+new+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+bacterial+artificial+chromosome+clone.">Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone.</a> J Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Ahmed, S., Holt, M., Riedel, D., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-scale+isolation+of+synaptic+vesicles+from+mammalian+brain.">Small-scale isolation of synaptic vesicles from mammalian brain.</a> Nat Protoc. 8 (5), 998-1009 (2013).</li></ol>

В пробирке SUMOylation протокол, описанный здесь обычно используется для установления статуса SUMOylation выявленных Ubc9 субстратов. Основные ограничения, используя стандартный протокол для изучения SUMOylation функция сумо E3 лигаза является обилие активации сумо E1 и E2 спрягать ферментов Ubc9, кот?...

СУМО модификации первоначально была определена как реверсивные столб-поступательные изменения (ПТМ), который регулирует белок стабильности1. В дополнение к прямой спряжение сумо может быть присоединен к белку через non ковалентные взаимодействия по сумо взаимодействия мотивы (SIMs)2. Похож на тирозил-фосфорилирования молекул, укрывательство Src гомологии 2 (Ш2) или phosphotyrosine привязку (ПТБ) доменов3,4, сумо модификации предоставляет дополнительные взаимодействия платформу для селективного набор SIM-содержащих эффекторные белки5,6. Помимо регулирования передачи сигнала SUMOylation транскрипционный анализ факторов и chromatin remodeling молекул служат для модулировать ген выражение7,8. Исследования структуры генома всей SUMOylation показали, что сумо модификация связан с позитивным9,10 или отрицательные10,11,12 транскрипции регулирование, отчасти из-за специфики paralogue SUMOylation.
Существует три основных сумо изоформ белка, спряжение подарок в mammalian клетках; к ним относятся сумо-1 и весьма гомологичных сумо-2 и сумо-3 (упоминаемый как сумо-2/3)13. СУМО обычно спрягаются для остатков лизина (K) в ψKxD/E консенсус мотив в целевого белка. SIM-карты в сумо E3 ligases отвечает за специфики paralogue14. В отличие от ubiquitination путей, содержащих сотни E3 ligases там были лишь несколько сумо E3 ligases определены15. СУМО E3 ligases определяются свойствами, включая их способность (i) связывают Ubc9, (ii) связывают общие сумо через SIM домена и (iii) повышение сумо передачи от Ubc9 на подложке. Лигаза E3 не является абсолютно необходимым для сумо спряжение16, но обеспечивает субстрата и специфичность сумо paralogue. Поскольку обычно только малую часть всего субстрата белка, сумо изменение, обнаружение SUMOylated белков в vivo это всегда вызов. Таким образом точные и воспроизводимые анализы необходимы для того, чтобы выяснить точное предназначение сумо модификации.
В пробирке SUMOylation assay, который оценивает очищенный Ubc9 способность катализировать SUMOylation субстрата белков, является широко признанным assay для изучения сумо модификация17. Однако сумо E3 лигаза деятельность в большинстве случаев не могут быть обнаружены или могут быть обнаружены только с мутировал лигаза сумо с высокой активностью лигаза сумо E3 и низкой субстратная специфичность по стандартному протоколу из-за присутствия обильное количество Ubc918 . Общий успех этот assay в значительной степени зависит от тщательного титрования очищенный Ubc9. В vitro Пробирная SUMOylation описано здесь отличается от стандартного SUMOylation протокола (см. Таблицу материалы). Наблюдение за увеличение глобальной модификации сумо во время возобновления саркома Капоши связанные герпеса (KSHV) побудило нас выявления вирусной лигаза сумо E3, которая может нести ответственность за регулирование вверх SUMOylation. После небольших скрининг взаимодействия белков вирусной сумо E3 лигаза K-bZIP, p53 был признан Роман субстрата. В этом протоколе мы показать в деталях клетках насекомых, шаги, связанные в выражение и очистки одичал тип K-bZIP, вирусный лигаза сумо E3 с сумо-2/3 специфика. Очищенный K-bZIP способность увеличить SUMOylation p53, известный сумо субстрата, оценивается присутствии снижение количества E1 и E2 ферментов. Используя этот измененный SUMOylation assay, исследователи могут надежно определить способности сумо E3 лигаза SUMOylate роман или известных субстратов, который является основным шагом в изучении белков SUMOylation. Кроме того этот метод помогает идентифицировать Роман сумо E3 ligases с низкой лигаза активность, но высокий субстратная специфичность.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:853px;" width="854">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">pFastBac</td>
			<td style="width:153px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10359-016</td>
			<td style="width:219px;">dual expression baculovirus vector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pCR2.1-TOPO vector</td>
			<td style="width:153px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>PCR product vector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">competent cell&#160; E. coli DH5&#945;</td>
			<td style="width:153px;">Yeastern Biotech</td>
			<td style="width:119px;">FYE678-80VL</td>
			<td>competent E. coli cells A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">E. coli DH10Bac</td>
			<td style="width:153px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10359-016</td>
			<td>competent E. coli cells B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">FugeneHD</td>
			<td style="width:153px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">04709705001</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31985062</td>
			<td>reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">T4 Ligase</td>
			<td style="width:153px;">NEW England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">CpoI (RsrII)</td>
			<td style="width:153px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ER0741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Bluo-gal</td>
			<td style="width:153px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">B1690</td>
			<td>galactosidase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">IPTG</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6758-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Grace&#8217;s Insect Medium</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11605094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:153px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9393-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">K0254-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">gentamicin</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">tetracyclin</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">87128-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">LB Broth</td>
			<td style="width:153px;">Merk</td>
			<td style="width:119px;">1.10285.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">HEPES</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H4034-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">NaCl</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S9888-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">KCl</td>
			<td style="width:153px;">Merk</td>
			<td style="width:119px;">1.04936.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:363px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S5136-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:363px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:153px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:119px;">3246-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:153px;">Merk</td>
			<td style="width:119px;">1.13760.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:153px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">TRIS (Base)</td>
			<td style="width:153px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:119px;">4109-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Non-fat milk</td>
			<td style="width:153px;">Fonterra</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">glycerol</td>
			<td style="width:153px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:119px;">2136-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:153px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0694-1L</td>
			<td>detergent A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Tween 20</td>
			<td style="width:153px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0777-500ML</td>
			<td>detergent B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Poloxamer 188 solution</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P5556-100ML</td>
			<td>detergent C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Protease Inhibitor Cocktail Tablet</td>
			<td style="width:153px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">04 693 132 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">3x Flag peptide</td>
			<td style="width:153px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">anti-FLAG m2 Magnetic beads</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M8823</td>
			<td>antibody-tagged magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">SUMOlink SUMO-1 Kit</td>
			<td style="width:153px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">40120</td>
			<td>standard SUMOylation protocol&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">SUMOlink SUMO-2/3 Kit</td>
			<td style="width:153px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">40220</td>
			<td>standard SUMOylation protocol&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:153px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">QIAGEN Plasmid Mini Kit</td>
			<td style="width:153px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">12123</td>
			<td>plasmid extraction kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Polypropylene tubes</td>
			<td style="width:153px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:153px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Cell lifter</td>
			<td style="width:153px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">CNG3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Loading tip</td>
			<td style="width:153px;">Sorenson BioScience</td>
			<td style="width:119px;">28480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">PVDF</td>
			<td style="width:153px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">NEF1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Blotting filter paper</td>
			<td style="width:153px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1703932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Mini slab gel apparatus (Bio-Rad Mini Protean II Cell)</td>
			<td style="width:153px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1658001 EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell</td>
			<td style="width:153px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1703940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Pierce ECL Western Blotting</td>
			<td style="width:153px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">32106</td>
			<td>ECL reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">suspension mixer</td>
			<td style="width:153px;">Digisystem laboratory instruments&#160; Inc.</td>
			<td style="width:119px;">SM-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">orbital shaker</td>
			<td>Kansin instruments Co.</td>
			<td>OS701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">ImageQuant LAS 4000 
			biomolecular imager</td>
			<td style="width:153px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28955810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Sf9</td>
			<td style="width:153px;">Thermo Scientific</td>
			<td>B82501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">anti-p53 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#9282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">anti-rabbit antibody</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro sumoylation assay to study sumo e3 ligase activity

Модификация маленький убиквитин как модификатор (сумо) является важным столб-поступательные изменения (ПТМ), которая опосредует сигнала прежде всего путем модулирования белок белковых взаимодействий. Подобно убиквитин модификации, SUMOylation режиссер последовательного фермента Каскад, включая E1-активация ферментов (SAE1/SAE2), E2-спряжение фермента (Ubc9), E3-лигаза (то есть, основные сборки взаимодействия семьи, RanBP2 и Pc2). Однако, в отличие от ubiquitination, E3 лигаза не является необходимым для реакции, но не обеспечивают точность и эффективность для сопряжения сумо. Белки, изменена SUMOylation может быть идентифицирован в vivo пробирного через иммунопреципитации субстрата специфических антител и immunoblotting с сумо специфические антитела. Однако демонстрация белка сумо E3 лигаза деятельности требует растворения в пробирке SUMOylation анализов с использованием очищенные ферменты, субстрат и сумо белков. Поскольку в реакциях, в пробирке , обычно SAE1/SAE2 и Ubc9, только достаточно для сумо спряжение, повышение SUMOylation по предполагаемым лигаза E3 не всегда легко обнаружить. Здесь мы описываем изменение в пробирке SUMOylation протокол, который последовательно идентифицирует сумо модификации с помощью системы в vitro воссоздана. Шаг за шагом протокол для очистки каталитически активных K-bZIP, вирусный лигаза E3 сумо-2/3, также представил. SUMOylation деятельность очищенный K-bZIP показываются на p53, известных целевых сумо. Этот протокол может быть использован не только для выяснения Роман сумо E3 ligases, но и для выявления их специфичности paralog сумо.

Согласно информации, представленной изготовителем, стандартное количество E1 и E2 фермента в SUMOylation assay-50 Нм до 500 Нм, соответственно. Минимальное количество E2 спрягать фермента Ubc9, которая способна SUMOylate p53 был сначала определяется в пробирке SUMOylation assay. Как низко как ...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity at JoVE.com

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

В отличие от убиквитин ligases было выявлено несколько ligases E3 сумо. Это изменение в пробирке SUMOylation протокол имеет возможность идентифицировать Роман сумо E3 ligases assay растворения в пробирке .

В пробирке SUMOylation Assay для изучения сумо E3 лигаза активность

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Тестирование зрительной чувствительности к скорости и направления движения в Ящерицы

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

В пробирке FluoroBlok опухолевой инвазии Пробирной

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Опробование киназы Деятельность LRRK2 В пробирке</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Do-It-Yourself Устройство для восстановления криоконсервированных образцов случайно уронил в криогенных резервуаров

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Эндотелия Формирование Анализ сотового трубка для<em&gt; In Vitro</em&gt; Изучение ангиогенеза

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

В пробирке метилирования Пробирной по изучению белка аргинин метилирования

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Экстракорпоральное анализе измерить фосфатидилэтаноламина метилтрансферазы активность

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

Измерение<em&gt; In Vitro</em&gt; АТФазы для ферментативного определения характеристик

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate ...

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

В естественных условиях Обнаружение и анализ SUMOylation белка Rb в клетках человека

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, ...

Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine

Всеобъемлющий рабочий процесс для идентификации генома и выражение мета анализа семьи ATL E3 убиквитин лигаза гена в Грейпвайне

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the ...