Name: isolation and cultivation of neural progenitors followed by chromatin-immunoprecipitation of histone 3 lysine 79 dimethylation mark
Uploaded: 2018-01-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark at JoVE.com

Nous remercions Henriette Bertemes pour aider à l’établissement du protocole de culture CGN au sein du laboratoire. Ce livre de la méthode était soutenu par l’épigénétique financés par le DFG CRC992 médicale en finançant à la télévision. Les auteurs tiennent à souligner le soutien de l’équipe de galaxie de Freiburg : Pavankumar Videm, Björn Grüning et Prof. Rolf Backofen, bioinformatique, Université de Freiburg, en Allemagne, financé par Collaborative Research Centre 992 médical épigénétique (subvention DFG SFB/992/1 2012) et ministère fédéral allemand de l’éducation et la recherche (BMBF subvention 031 A538A RBC (de. NBI)).

Comités de protection des animaux de l’Université de Fribourg et les autorités locales a approuvé toutes les expériences animales (G12/13, G16/11), mentionnés dans le protocole suivant.
1. les préparatifs
<ol><li>
Préparations pour l’isolement de la SCD
	<ol>
<li>Mis sur pied chronométrée accouplement afin d’obtenir des embryons à des stades différents du développement du cortex (entre E11.5 et E14.5). Utilisez la souris de la souche NMRI (Naval Medical Re...

<ol>
	<li>Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtype+specification+in+the+cerebral+cortex.">Neuronal subtype specification in the cerebral cortex.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8, 427-437 (2007).</li><li>Kandel, E. R., Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroscience:+breaking+down+scientific+barriers+to+the+study+of+brain+and+mind.">Neuroscience: breaking down scientific barriers to the study of brain and mind.</a> Science. 290, 1113-1120 (2000).</li><li>G&#246;tz, M., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+development:+the+art+of+generating+cell+diversity.">Cortical development: the art of generating cell diversity.</a> Dev. Camb. Engl. 132, 3327 (2005).</li><li>Hirabayashi, Y., Gotoh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+control+of+neural+precursor+cell+fate+during+development.">Epigenetic control of neural precursor cell fate during development.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 377-388 (2010).</li><li>Davis, A. A., Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+self-renewing+multipotential+stem+cell+in+embryonic+rat+cerebral+cortex.">A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex.</a> Nature. 372, 263-266 (1994).</li><li>Sauvageot, C. M., Stiles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+controlling+cortical+gliogenesis.">Molecular mechanisms controlling cortical gliogenesis.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 12, 244-249 (2002).</li><li>McConnell, S. K., Kaznowski, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+dependence+of+laminar+determination+in+developing+neocortex.">Cell cycle dependence of laminar determination in developing neocortex.</a> Science. 254, 282-285 (1991).</li><li>Desai, A. R., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+restriction+in+fate+potential+by+neural+progenitors+during+cerebral+cortical+development.">Progressive restriction in fate potential by neural progenitors during cerebral cortical development.</a> Dev. Camb. Engl. 127, 2863-2872 (2000).</li><li>Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellum:+history.">Cerebellum: history.</a> Neuroscience. 162, 549-559 (2009).</li><li>Marzban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+commitment+in+the+developing+cerebellum.">Cellular commitment in the developing cerebellum.</a> Front. Cell. Neurosci. 8, (2015).</li><li>Azevedo, F. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equal+numbers+of+neuronal+and+nonneuronal+cells+make+the+human+brain+an+isometrically+scaled-up+primate+brain.">Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain.</a> J. Comp. Neurol. 513, 532-541 (2009).</li><li>Machold, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+is+expressed+in+temporally+discrete+pools+of+cerebellar+rhombic-lip+neural+progenitors.">Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors.</a> Neuron. 48, 17-24 (2005).</li><li>Luger, K., M&#228;der, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution.">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389, 251-260 (1997).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+modification+mapping+in+human+brain+reveals+aberrant+expression+of+histone+H3+lysine+79+dimethylation+in+neural+tube+defects.">Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects.</a> Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).</li><li>Zhang, Y., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+regulation+by+histone+methylation:+interplay+between+different+covalent+modifications+of+the+core+histone+tails.">Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails.</a> Genes Dev. 15, 2343-2360 (2001).</li><li>Sanders, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation+of+histone+H4+lysine+20+controls+recruitment+of+Crb2+to+sites+of+DNA+damage.">Methylation of histone H4 lysine 20 controls recruitment of Crb2 to sites of DNA damage.</a> Cell. 119, 603-614 (2004).</li><li>Martin, C., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+functions+of+histone+lysine+methylation.">The diverse functions of histone lysine methylation.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 838-849 (2005).</li><li>Greer, E. L., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+methylation:+a+dynamic+mark+in+health,+disease+and+inheritance.">Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance.</a> Nat. Rev. Genet. 13, 343-357 (2012).</li><li>Ng, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysine+methylation+within+the+globular+domain+of+histone+H3+by+Dot1+is+important+for+telomeric+silencing+and+Sir+protein+association.">Lysine methylation within the globular domain of histone H3 by Dot1 is important for telomeric silencing and Sir protein association.</a> Genes Dev. 16, 1518-1527 (2002).</li><li>Kebede, A. F., Schneider, R., Daujat, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+types+and+sites+of+histone+modifications+emerge+as+players+in+the+transcriptional+regulation+contest.">Novel types and sites of histone modifications emerge as players in the transcriptional regulation contest.</a> FEBS J. 282, 1658-1674 (2015).</li><li>Roidl, D., Hacker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+methylation+during+neural+development.">Histone methylation during neural development.</a> Cell Tissue Res. 356, 539-552 (2014).</li><li>Mersfelder, E. L., Parthun, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tale+beyond+the+tail:+histone+core+domain+modifications+and+the+regulation+of+chromatin+structure.">The tale beyond the tail: histone core domain modifications and the regulation of chromatin structure.</a> Nucleic Acids Res. 34, 2653-2662 (2006).</li><li>van Leeuwen, F., Gafken, P. R., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dot1p+Modulates+Silencing+in+Yeast+by+Methylation+of+the+Nucleosome+Core.">Dot1p Modulates Silencing in Yeast by Methylation of the Nucleosome Core.</a> Cell. 109, 745-756 (2002).</li><li>Jones, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+H3K79+methyltransferase+Dot1L+is+essential+for+mammalian+development+and+heterochromatin+structure.">The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure.</a> PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).</li><li>Woo Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RE-IIBP+Methylates+H3K79+and+Induces+MEIS1-mediated+Apoptosis+via+H2BK120+Ubiquitination+by+RNF20.">RE-IIBP Methylates H3K79 and Induces MEIS1-mediated Apoptosis via H2BK120 Ubiquitination by RNF20.</a> Sci. Rep. 5, 12485 (2015).</li><li>Vlaming, H., van Leeuwen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+upstreams+and+downstreams+of+H3K79+methylation+by+DOT1L.">The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L.</a> Chromosoma. , (2016).</li><li>Jones, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+H3K79+methyltransferase+Dot1L+is+essential+for+mammalian+development+and+heterochromatin+structure.">The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure.</a> PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+mammalian+erythropoiesis+requires+the+Dot1L+methyltransferase.">Early mammalian erythropoiesis requires the Dot1L methyltransferase.</a> Blood. 116, 4483-4491 (2010).</li><li>Cattaneo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOT1L-mediated+H3K79me2+modification+critically+regulates+gene+expression+during+cardiomyocyte+differentiation.">DOT1L-mediated H3K79me2 modification critically regulates gene expression during cardiomyocyte differentiation.</a> Cell Death Differ. 23, 555-564 (2016).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+modification+mapping+in+human+brain+reveals+aberrant+expression+of+histone+H3+lysine+79+dimethylation+in+neural+tube+defects.">Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects.</a> Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).</li><li>B&#252;ttner, N., Johnsen, S. A., K&#252;gler, S., Vogel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Af9/Mllt3+interferes+with+Tbr1+expression+through+epigenetic+modification+of+histone+H3K79+during+development+of+the+cerebral+cortex.">Af9/Mllt3 interferes with Tbr1 expression through epigenetic modification of histone H3K79 during development of the cerebral cortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7042-7047 (2010).</li><li>Roidl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOT1L+Activity+Promotes+Proliferation+and+Protects+Cortical+Neural+Stem+Cells+from+Activation+of+ATF4-DDIT3-Mediated+ER+Stress+In+Vitro.">DOT1L Activity Promotes Proliferation and Protects Cortical Neural Stem Cells from Activation of ATF4-DDIT3-Mediated ER Stress In Vitro.</a> Stem Cells Dayt. Ohio. 34, 233-245 (2016).</li><li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+viewer.">Integrative genomics viewer.</a> Nat. Biotechnol. 29, 24-26 (2011).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat. Methods. 9, 357-359 (2012).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+(MACS).">Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9, R137 (2008).</li><li>Ram&#237;rez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=deepTools2:+a+next+generation+web+server+for+deep-sequencing+data+analysis.">deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis.</a> Nucleic Acids Res. 44, W160-W165 (2016).</li><li>Roidl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histone modifications during cerebral cortex development. , (2015).</li><li>Turner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP+with+Native+Chromatin:+Advantages+and+Problems+Relative+to+Methods+Using+Cross-Linked+Material.">ChIP with Native Chromatin: Advantages and Problems Relative to Methods Using Cross-Linked Material.</a> Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , (2001).</li><li>Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cortical+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells.">Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> J. Neurosci. Methods. 209, 219-226 (2012).</li></ol>

Il y a deux façons principales pour effectuer l’immunoprécipitation de la chromatine pour détecter l’occupation génomique des modifications d’histone, facteurs de transcription, lecteurs de code histone, écrivains ou gommes à effacer. On est la méthode native de la puce à l’aide de nucléase digérée, chromatine native pour l’immunoprécipitation, et l’autre est la méthode présentée à l’aide de la chromatine PFA-fixes et cisaillée, dans lequel les nucléosomes et autres protéines ADN-attaché...

Les fonctions sensorielles, motrices et cognitives du cerveau sont très complexes et sensibles aux changements physiques et environnementaux. Le cerveau est constitué de trois parties générales le hind-, moyennes et du cerveau, qui sont profondément liées. Dans le cerveau antérieur, le télencéphale se divisent en une dorsale télencéphale (DT) et un télencéphale ventral (VT). La DT de souris se compose de six couches corticales qui sont forment entre E11.5 et E18.5 dans une façon de « inside-out »1. Le VT comprend les éminences ganglionnaires dans le développement, qui forment plus tard les ganglions de la base2,3. Plusieurs types de cellules peuvent être classés dans le système nerveux central chez les mammifères tels que les neurones, astrocytes, oligodendrocytes4ou qui se développent dans une manière temporo-spatiale5. Tout d’abord, les cellules progénitrices neurales (PNJ) donnent lieu à différents types de neurones, les interneurones dans le VT et des neurones de projection dans la DT et plus tard sur les cellules gliales (p. ex., les astrocytes,6). Au cours du développement cortical, couche la plus superficielle (couche I), qui contient des cellules de Cajal-Retzius, est formé en premier. Puis, entre E12.5 et E14.5, PNJs génèrent des plus profondes couches neuronales (VI, V) tandis qu’entre 14,5 et 16.5, progéniteurs donnent lieu à des neurones de la couche supérieure (IV-II)7,8. Aucune identité neuronale est spécifié par différents programmes temporo-spatiale transcriptionnelles induite sur les capacités et en outre par l’épigénétique programmes2.
Le cervelet, qui est impliqué dans la coordination motrice, est situé dans le cerveau postérieur et se développe entre E10 et environ P20 souris9. Il contient le cortex cérébelleux et les noyaux cérébelleux10. Le cortex cérébelleux adult se compose de trois couches, la couche moléculaire, la couche de cellules de Purkinje et la couche granulaire interne contenant des neurones granulaires10. Les microglies cérébelleuses sont les plus petits neurones et représentent environ 80 % de tous les neurones dans le cerveau de vertébrés11. Ils se développent à partir des précurseurs situés dans la zone externe de germinale et migrent à travers la couche de cellules de Purkinje à leur destination12. Comme dans le télencéphale, le développement du cervelet est régi par plusieurs morphogènes importants, qui ont des fonctions spécifique et espace-dépendant du temps et initier défini transcriptionnelle programmes10.
Le développement des couches corticales et cérébelleux est contrôlé par l’expression transcriptionnelle de morphogènes spécifiques et, ainsi, par l’état de la chromatine de l’ADN. Dans une vue simplifiée, les États de la chromatine se divisent en euchromatine comme activité de transcription et hétérochromatine comme régions transcriptionally silencieuses. Le nucléosome est l’unité fondamentale de la chromatine contient deux copies de chaque histone core H2A, H2B, H3 et H4, entouré de 147 paires de bases d’ADN13. Les histones sont hautement post-traductionnellement modifiées par méthylation, acétylation, phosphorylation, ubiquitination, sumoylation, ADP-ribosylation, désamination et proline isomérisation14,15. Méthylation de lysine histone est réputée être la modification d’histone plus stable qui contrôle la transcription, réplication, recombinaison16, dommages à l’ADN réponse17et l’empreinte génomique18. Lysines peuvent être mono-, di- ou tri-méthylés19 et apparaissent non seulement sur les queues d’histone accessible, mais aussi au sein du domaine globulaire d’histones20. Les méthylations spécifiques à H3K4 et H3K36 sont principalement liées à l’euchromatine, méthylations spécifiques au H3K9, H3K27 ou H4K20 se trouvent principalement dans des régions hétérochromatiques, bien que tous les résidus sont situés au sein de l’histone Queue14, 19,,21. Méthylation de l’H3K79 est située dans le domaine globulaire histone et a été associée à l’activité transcriptionnelle, mais aussi avec les régions génomiques transcriptionnellement inerte22. La modification est conservée évolutif puisqu’il a été observé chez la levure, thymus de veau, poulet et humaine23. H3K79 mono, di et triméthylation (H3K79me1, me2, me3) sont catalysées par l’histone methyltransferases DOT1L24,25 et le nucléaire SET contenant du domaine Protein 2 (Nsd2)26. DOT1L est impliqué dans la prolifération et réparation de l’ADN cellulaire reprogrammation27. Perte de Dot1l chez la souris entraîne un décès prénatal autour du stade de développement de28,E10.529. Au cours du développement du cœur et dans la différenciation myocardiocyte, DOT1L est essentiel pour gene expression règlement30. Dans le système nerveux central, DOT1L fonction pourrait être impliquée dans le tube neural development31, il est impliqué dans la répression des Tbr1-expression lors du prosencéphale développement32et peuvent fonctionner dans la régulation du stress du re gènes de réponse33. L’activation dépendante du contexte ou la répression action de H3K79me, en particulier avec in vivo des situations comme le développement du système nerveux central, est à ce jour, seulement partiellement compris32. Méthylation de l’H3K79 se trouve dans le domaine globulaire de l’histone 3, il est stériquement moins accessible par rapport à des modifications sur l’histone flexible queues23. Pour comprendre la fonction de méthylation de l’H3K79, des méthodes d’analyse fiables et reproductibles pour déterminer son emplacement et son environnement génomique sont nécessaires. Dans cet article des méthodes, nous présentons des méthodes d’isolation des différentes progéniteurs neurones (CPC pour le cortex) et CGNPs pour le cervelet, un traitement inhibiteur de la DOT1L efficace et une méthode de puce pour analyser H3K79 méthylation par qPCR ou séquençage en temps différents points au cours du développement cortical et cérébelleux. Pour une vue d’ensemble du protocole et de ses possibilités, voir la Figure 1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8245</td>
			<td>Category: Antibody 
			Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-H3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1791</td>
			<td>Category: Antibody 
			Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-H3K79me2</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>pAb-051-050</td>
			<td>Category: Antibody 
			Abbreviation/Comment: ChIP antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-H3K79me2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab-051-050</td>
			<td>Category: Antibody 
			Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit-IgG</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410206</td>
			<td>Category: Antibody 
			Abbreviation/Comment: ChIP Ctrl antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tubulin alpha</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108629</td>
			<td>Category: Antibody 
			Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-Transferrin (1 mg/ml)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1147</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: For CCM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement (50x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: For CCM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>G2940CA</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: For analysis of sheared chromatin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor NextGen</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: Ultrasonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid pH 8.4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: For CPC culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect RT PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855201</td>
			<td>Category: ChIP Analysis 
			Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320-033</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: For CGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein A</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10001D</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: Magnetic beads, for ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPZ-5676</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7062</td>
			<td>Category: DOT1L inhibition 
			Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid</td>
			<td>SERVA</td>
			<td>39760.01</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum 10% (v/v)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: For CPC isolation and CGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: For CGNP isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione (1.25 mg/ml)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4251</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: For CCM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3187</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: For cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq mastermix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A6002</td>
			<td>Category: ChIP Analysis 
			Abbreviation/Comment: DNA polymerase master mix for qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025-100</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: For CCM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: For CPC culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4408</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: LiCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: For CGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 3300</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3300</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: Fluorospectrometer for DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E7645S</td>
			<td>Category: ChIP Analysis 
			Abbreviation/Comment: Kit for Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E7335</td>
			<td>Category: ChIP Analysis 
			Abbreviation/Comment: Oligos for Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: For CCM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 Alternative</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>492016</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: For ChIP buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>335</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: PFA, for cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15640055</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: PSN, for CCM and CGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoGreen Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P11496</td>
			<td>Category: ChIP Analysis 
			Abbreviation/Comment: Visualizing dye for DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6407</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: For CGNP isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: For CPC culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: KCl, for CGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: For ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3115879001</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: For ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen MinElute</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: Kit for DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6513</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: For ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGC0946</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7079</td>
			<td>Category: DOT1L inhibition 
			Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8551.1</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: for Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: NaCl, for ChIP buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30970</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: For ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecylsulfate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>183</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: SDS, for ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic hedgehock (SHH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SRP6004</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: For CGNP isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superoxide dismutase (1mg/ml)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7571</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: For CCM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9090</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: TRIS, for ChIP buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X100</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: For ChIP buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0,05% (w/v)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59417C</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: For CPC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>28320</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: For bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Other Lab devices: Neubauer counting chamber, Incubator, Rotator, Shaker, Disection set, Water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCM: Cortical cell medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGM: CGNP cell culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and cultivation of neural progenitors followed by chromatin-immunoprecipitation of histone 3 lysine 79 dimethylation mark

Le développement du cerveau est un processus complexe, qui est contrôlé de manière temporo-spatiale par des gradients de morphogènes et différents programmes transcriptionnelles. En outre, des modifications épigénétiques chromatine, comme la méthylation des histones, ont un rôle important pour établir et maintenir des destins de cellule spécifique au sein de ce processus. La grande majorité de la méthylation des histones se produit sur la queue de l’histone flexible, qui est accessible aux modificateurs d’histone, gommes à effacer et histones lecteur. En revanche, la méthylation de l’H3K79 se trouve dans le domaine globulaire de l’histone 3 et est impliquée dans les différentes fonctions du développement. Méthylation de l’H3K79 est conservée évolutives et se trouvent dans un large éventail d’espèces de l’Homo sapiens à Saccharomyces cerevisiae. La modification se produit dans différentes populations cellulaires au sein d’organismes, y compris les progéniteurs neuraux. L’emplacement de la méthylation de H3K79 dans le domaine globulaire de l’histone 3, il est difficile à évaluer. Ici, nous présentons des méthodes pour isoler et progénitrices corticale de la culture des cellules (CPC) de tissus embryonnaires cerveau cortical (E11.5-E14.5) ou les progéniteurs des neurones granulaires cérébelleux (CGNPs) de tissus de postnatal (P5-P7) et efficacement immunoprécipitation H3K79me2 pour la PCR quantitative (qPCR) et le séquençage de génome.

Régime général d’isolement progénitrices neurales, culture, méthodes d’analyse H3K79me2 puce et puce : La figure 1 montre un diagramme pour effectuer H3K79me2 puce de cellules progénitrices corticales à différents moments au cours du développement du cerveau embryonnaire ou de cellules souches de neurones granulaires cérébelleux en étapes postnatals. Dans un premier temps, le cerveau doit être isolé et le télencéphale (en...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark at JoVE.com

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Isolement et culture des progéniteurs neurones suivie par immunoprécipitation de la chromatine de marque d’Histone 3 Lysine 79 MBD

Nous présentons une méthode efficace et reproductible pour isoler et de la culture des cellules progénitrices neurales de tissus du cerveau embryonnaire et postnatale pour l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) de l’histone 3 lysine 79 MBD (H3K79me2) - une marque d’histone agrave la domaine globulaire de l’histone 3.

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

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Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

Production d&#39;extrait d&#39;embryon de poulet pour la culture des neurones murins Cellules souches Crest

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

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to a limited extent after ...

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La détection de l&#39;hypoxie dans le cortex de souris microrégionale cérébrale par imagerie à deux photons de fluorescence endogène NADH

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