Name: isolation and cultivation of neural progenitors followed by chromatin-immunoprecipitation of histone 3 lysine 79 dimethylation mark
Uploaded: 2018-01-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark at JoVE.com

אנו מודים הנרייטה Bertemes שעזרת להקים פרוטוקול טיפוח CGN בתוך המעבדה. הנייר בשיטה זו נתמכה על ידי במימון DFG CRC992 אפיגנטיקה רפואי על ידי מימון לטלוויזיה. המחברים להכיר את התמיכה של קבוצת גלקסי פרייבורג (freiburg): Pavankumar Videm, ביורן Grüning, פרופסור רולף Backofen, ביואינפורמטיקה, אוניברסיטת פרייבורג, גרמניה ממומן על ידי שיתופי מחקר מרכז 992 אפיגנטיקה רפואי (DFG גרנט SFB 992/1/2012) גרמניה הפדרלית שר החינוך ואת המחקר (BMBF גרנט 031 A538A RBC (de. אי)).

רווחת בעלי חיים ועדות של אוניברסיטת פרייבורג, רשויות מקומיות אישר כל ניסויים בבעלי חיים (G12/13, G16/11) מצויה בפרוטוקול הבא.
1. תכשירים
<ol><li>
ההכנות CPCs בידוד
	<ol>
<li>להגדיר מתוזמן ההזדווגות, כדי להשיג את העוברים בשלבים שונים של התפתחות קליפת המוח (בין E11.5 ו E14.5). השתמש עכברים ...

<ol>
	<li>Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtype+specification+in+the+cerebral+cortex.">Neuronal subtype specification in the cerebral cortex.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8, 427-437 (2007).</li><li>Kandel, E. R., Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroscience:+breaking+down+scientific+barriers+to+the+study+of+brain+and+mind.">Neuroscience: breaking down scientific barriers to the study of brain and mind.</a> Science. 290, 1113-1120 (2000).</li><li>G&#246;tz, M., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+development:+the+art+of+generating+cell+diversity.">Cortical development: the art of generating cell diversity.</a> Dev. Camb. Engl. 132, 3327 (2005).</li><li>Hirabayashi, Y., Gotoh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+control+of+neural+precursor+cell+fate+during+development.">Epigenetic control of neural precursor cell fate during development.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 377-388 (2010).</li><li>Davis, A. A., Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+self-renewing+multipotential+stem+cell+in+embryonic+rat+cerebral+cortex.">A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex.</a> Nature. 372, 263-266 (1994).</li><li>Sauvageot, C. M., Stiles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+controlling+cortical+gliogenesis.">Molecular mechanisms controlling cortical gliogenesis.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 12, 244-249 (2002).</li><li>McConnell, S. K., Kaznowski, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+dependence+of+laminar+determination+in+developing+neocortex.">Cell cycle dependence of laminar determination in developing neocortex.</a> Science. 254, 282-285 (1991).</li><li>Desai, A. R., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+restriction+in+fate+potential+by+neural+progenitors+during+cerebral+cortical+development.">Progressive restriction in fate potential by neural progenitors during cerebral cortical development.</a> Dev. Camb. Engl. 127, 2863-2872 (2000).</li><li>Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellum:+history.">Cerebellum: history.</a> Neuroscience. 162, 549-559 (2009).</li><li>Marzban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+commitment+in+the+developing+cerebellum.">Cellular commitment in the developing cerebellum.</a> Front. Cell. Neurosci. 8, (2015).</li><li>Azevedo, F. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equal+numbers+of+neuronal+and+nonneuronal+cells+make+the+human+brain+an+isometrically+scaled-up+primate+brain.">Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain.</a> J. Comp. Neurol. 513, 532-541 (2009).</li><li>Machold, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+is+expressed+in+temporally+discrete+pools+of+cerebellar+rhombic-lip+neural+progenitors.">Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors.</a> Neuron. 48, 17-24 (2005).</li><li>Luger, K., M&#228;der, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution.">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389, 251-260 (1997).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+modification+mapping+in+human+brain+reveals+aberrant+expression+of+histone+H3+lysine+79+dimethylation+in+neural+tube+defects.">Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects.</a> Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).</li><li>Zhang, Y., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+regulation+by+histone+methylation:+interplay+between+different+covalent+modifications+of+the+core+histone+tails.">Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails.</a> Genes Dev. 15, 2343-2360 (2001).</li><li>Sanders, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation+of+histone+H4+lysine+20+controls+recruitment+of+Crb2+to+sites+of+DNA+damage.">Methylation of histone H4 lysine 20 controls recruitment of Crb2 to sites of DNA damage.</a> Cell. 119, 603-614 (2004).</li><li>Martin, C., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+functions+of+histone+lysine+methylation.">The diverse functions of histone lysine methylation.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 838-849 (2005).</li><li>Greer, E. L., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+methylation:+a+dynamic+mark+in+health,+disease+and+inheritance.">Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance.</a> Nat. Rev. Genet. 13, 343-357 (2012).</li><li>Ng, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysine+methylation+within+the+globular+domain+of+histone+H3+by+Dot1+is+important+for+telomeric+silencing+and+Sir+protein+association.">Lysine methylation within the globular domain of histone H3 by Dot1 is important for telomeric silencing and Sir protein association.</a> Genes Dev. 16, 1518-1527 (2002).</li><li>Kebede, A. F., Schneider, R., Daujat, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+types+and+sites+of+histone+modifications+emerge+as+players+in+the+transcriptional+regulation+contest.">Novel types and sites of histone modifications emerge as players in the transcriptional regulation contest.</a> FEBS J. 282, 1658-1674 (2015).</li><li>Roidl, D., Hacker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+methylation+during+neural+development.">Histone methylation during neural development.</a> Cell Tissue Res. 356, 539-552 (2014).</li><li>Mersfelder, E. L., Parthun, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tale+beyond+the+tail:+histone+core+domain+modifications+and+the+regulation+of+chromatin+structure.">The tale beyond the tail: histone core domain modifications and the regulation of chromatin structure.</a> Nucleic Acids Res. 34, 2653-2662 (2006).</li><li>van Leeuwen, F., Gafken, P. R., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dot1p+Modulates+Silencing+in+Yeast+by+Methylation+of+the+Nucleosome+Core.">Dot1p Modulates Silencing in Yeast by Methylation of the Nucleosome Core.</a> Cell. 109, 745-756 (2002).</li><li>Jones, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+H3K79+methyltransferase+Dot1L+is+essential+for+mammalian+development+and+heterochromatin+structure.">The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure.</a> PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).</li><li>Woo Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RE-IIBP+Methylates+H3K79+and+Induces+MEIS1-mediated+Apoptosis+via+H2BK120+Ubiquitination+by+RNF20.">RE-IIBP Methylates H3K79 and Induces MEIS1-mediated Apoptosis via H2BK120 Ubiquitination by RNF20.</a> Sci. Rep. 5, 12485 (2015).</li><li>Vlaming, H., van Leeuwen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+upstreams+and+downstreams+of+H3K79+methylation+by+DOT1L.">The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L.</a> Chromosoma. , (2016).</li><li>Jones, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+H3K79+methyltransferase+Dot1L+is+essential+for+mammalian+development+and+heterochromatin+structure.">The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure.</a> PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+mammalian+erythropoiesis+requires+the+Dot1L+methyltransferase.">Early mammalian erythropoiesis requires the Dot1L methyltransferase.</a> Blood. 116, 4483-4491 (2010).</li><li>Cattaneo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOT1L-mediated+H3K79me2+modification+critically+regulates+gene+expression+during+cardiomyocyte+differentiation.">DOT1L-mediated H3K79me2 modification critically regulates gene expression during cardiomyocyte differentiation.</a> Cell Death Differ. 23, 555-564 (2016).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+modification+mapping+in+human+brain+reveals+aberrant+expression+of+histone+H3+lysine+79+dimethylation+in+neural+tube+defects.">Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects.</a> Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).</li><li>B&#252;ttner, N., Johnsen, S. A., K&#252;gler, S., Vogel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Af9/Mllt3+interferes+with+Tbr1+expression+through+epigenetic+modification+of+histone+H3K79+during+development+of+the+cerebral+cortex.">Af9/Mllt3 interferes with Tbr1 expression through epigenetic modification of histone H3K79 during development of the cerebral cortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7042-7047 (2010).</li><li>Roidl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOT1L+Activity+Promotes+Proliferation+and+Protects+Cortical+Neural+Stem+Cells+from+Activation+of+ATF4-DDIT3-Mediated+ER+Stress+In+Vitro.">DOT1L Activity Promotes Proliferation and Protects Cortical Neural Stem Cells from Activation of ATF4-DDIT3-Mediated ER Stress In Vitro.</a> Stem Cells Dayt. Ohio. 34, 233-245 (2016).</li><li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+viewer.">Integrative genomics viewer.</a> Nat. Biotechnol. 29, 24-26 (2011).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat. Methods. 9, 357-359 (2012).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+(MACS).">Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9, R137 (2008).</li><li>Ram&#237;rez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=deepTools2:+a+next+generation+web+server+for+deep-sequencing+data+analysis.">deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis.</a> Nucleic Acids Res. 44, W160-W165 (2016).</li><li>Roidl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histone modifications during cerebral cortex development. , (2015).</li><li>Turner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP+with+Native+Chromatin:+Advantages+and+Problems+Relative+to+Methods+Using+Cross-Linked+Material.">ChIP with Native Chromatin: Advantages and Problems Relative to Methods Using Cross-Linked Material.</a> Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , (2001).</li><li>Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cortical+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells.">Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> J. Neurosci. Methods. 209, 219-226 (2012).</li></ol>

ישנם שתי דרכים עיקריות לביצוע כרומטין immunoprecipitation כדי לזהות את תפוסת גנומית של שינויים היסטון, גורמי שעתוק, הקוראים קוד היסטון, סופרים או מחקים. אחת היא שיטת צ'יפ מקורי בעזרת נוקלאז מתעכל, יליד כרומטין עבור immunoprecipitation, והשני הוא הציג השיטה באמצעות כרומטין מחברים-קבוע, הוטו, שבו את נוקליאוזומ?...

הפונקציות חושית, מוטורי, קוגניטיבי של המוח הם מורכבים מאוד רגישים לשינויים פיזיים וסביבתיים. המוח מורכב שלושה חלקים כללי הינד-, אמצע, הקדמי, אשר מחוברים עמוקות. בתוך הקדמי, ניתן לחלק את telencephalon של telencephalon הגבי (DT), של telencephalon הגחוני (וי טי). DT של עכברים מורכב שש שכבות קורטיקלית אשר נוצרים בין E11.5 לבין E18.5 אופן "הפוכה"1. VT כולל את הרוחביים ganglionic בפיתוח, המהווים את2,של גרעיני הבסיס3מאוחר יותר. מספר סוגי תאים יכולים להיות מסווגים במערכת העצבים המרכזית יונקים כמו נוירונים, האסטרוציטים או oligodendrocytes להפוך4, אשר להתפתח באופן מרחבי בעיות מפרק5. קודם כל, עצבי ובתאים (NPCs) להצמיח סוגים שונים של נוירונים, interneurons VT ולאחר ההקרנה נוירונים ב- DT, ובהמשך תאי גליה (למשל, האסטרוציטים6). במהלך פיתוח קורטיקלית, השכבה השטחית ביותר (שכבה אני), אשר מכיל תאים Cajal Retzius, נוצר לראשונה. לאחר מכן, בין E12.5 ו E14.5, NPCs צור עצביים לשכבות העמוקות (השישי, V) בזמן בין 14.5, 16.5, אבות להצמיח השכבה העליונה (IV-II) נוירונים7,8. זהות עצביים צוין על ידי מורפוגן-induced בעיות מפרק מרחבי תעתיק תוכניות שונות, בנוסף על-ידי תוכניות epigenetic2.
המוח הקטן, אשר הוא מעורב קואורדינציה, ממוקם על hindbrain ומפתחת בין E10 בערך P20 עכברים9. הוא מכיל קליפת אסטרוציטומה ואת הגרעינים אסטרוציטומה10. קליפת אסטרוציטומה למבוגרים מורכב משלוש שכבות, שבהפסד מולקולרית, השכבה Purkinje תא, השכבה הפנימית ביותר פרטנית המכיל נוירונים פרטנית10. התאים גרגר אסטרוציטומה הנוירונים הקטן ביותר, מייצגים כ- 80% של הנוירונים בכל המוח חוליות11. להתפתח סימנים מקדימים ממוקם באזור נבטי חיצוניים והם נודדים דרך השכבה Purkinje תא היעד שלהם12. כמו ב- telencephalon, ההתפתחות של הצרבלום מוסדר על ידי אורגניזם חשוב מספר, אשר יש פונקציות ספציפיות זמן-מרחב ותלוי וליזום תוכניות תעתיק10מוגדרים.
הפיתוח של שכבות קורטיקליים ו אסטרוציטומה נשלטת על ידי ביטוי גנים ברמת השעתוק של אורגניזם מסוים ועל, לכן, ידי המדינה כרומטין של ה-DNA. בתצוגה פשוטה, כרומטין הברית יכולה להיות מחולקת euchromatin כפעיל transcriptionally הטרוכרומטין כמו אזורים שקטים transcriptionally. נוקלאוזום היחידה הבסיסית של כרומטין מכיל שני עותקים של כל היסטון הליבה H2A, ויזת עבודה H2B, H3 ו- H4, מוקף 147 בסיסי זוגות של הדנ א13. שינויים היסטוניים עוברות שינוי מאוד post-translationally על ידי מתילציה, acetylation, זרחון, ubiquitination, sumoylation, ADP-ribosylation, דיאמינציה פרולין isomerization14,15. היסטון ליזין מתילציה נחשב השינוי היסטון היציב ביותר ששולטת שעתוק, שכפול, רקומבינציה16, נזק לדנ א תגובה17, ו החתמה גנומית18. Lysines יכול להיות מונו, di- או תלת-מפוגל19 , מופיעים לא רק על זנבות היסטון נגיש, אלא גם בתוך תחום הכדוריים של שינויים היסטוניים20. Methylations ספציפי ב H3K4 ו H3K36 קשורים בעיקר עם euchromatin, methylations מסוים H3K9, H3K27 או H4K20 מצויים בעיקר באזורים heterochromatic, למרות כל שאריות ממוקמים בתוך הזנב היסטון14, 19,21. מתילציה H3K79 הינו ממוקם בתוך תחום הכדוריים היסטון, שויכה פעילות גנים ברמת השעתוק, אבל גם עם אזורים גנומית אינרטי transcriptionally22. השינוי אבולוציונית כולו מאז זה נצפתה שמרים, התימוס עגל, עוף ו האנושי23. מונו H3K79 di, trimethylation (H3K79me1, me2, me3) הם מזורז על ידי24,methyltransferases DOT1L25 היסטון גרעיני להגדיר תחום המכיל חלבון 2 (Nsd2)26. DOT1L הייתה שם התפשטות, DNA לתקן ו סלולריים reprograming27. אובדן Dot1l בעכברים מוביל למוות טרום לידתי סביב28,E10.529שלב התפתחותי. במהלך התפתחות הלב, בידול myocardiocyte, DOT1L חיוני עבור ג'ין ביטוי תקנה30. במערכת העצבים המרכזית, פונקציה DOT1L עשוי להיות מעורב בשפופרת פגמים בתעלה פיתוח31, מעורב בדיכוי Tbr1-ביטוי במהלך פיתוח הקדמי32, עשוי לתפקד בוויסות של ER-מתח התגובה הגנים33. תלויי-הקשר הפעלה או המדחיק הפעולה של H3K79me, במיוחד עם ויוו מצבים כמו הפיתוח של מערכת העצבים המרכזית, הוא תאריך רק חלקית הבין32. מאז H3K79 מתילציה ממוקם בתחום הכדוריים היסטון 3, זה sterically פחות נגיש לעומת שינויים על זנבות היסטון גמיש23. כדי להבין את תפקוד H3K79 מתילציה, דרושות שיטות ניתוח לשחזור ואמין כדי לקבוע את מיקום שלה ואת הסביבה גנומית. שיטות העבודה אנו מציגים שיטות בידוד של אבות עצביות שונות (CPCs של קליפת המוח) ו- CGNPs עבור המוח הקטן, טיפול יעיל של מעכבי DOT1L שיטה שבב לנתח מתילציה H3K79 דרך qPCR או רצף זמן שונים נקודות במהלך הפיתוח קורטיקליים ו אסטרוציטומה. לקבלת מבט כולל על הפרוטוקול והאפשרויות שלה, ראה איור 1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8245</td>
			<td>Category: Antibody 
			Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-H3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1791</td>
			<td>Category: Antibody 
			Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-H3K79me2</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>pAb-051-050</td>
			<td>Category: Antibody 
			Abbreviation/Comment: ChIP antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-H3K79me2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab-051-050</td>
			<td>Category: Antibody 
			Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit-IgG</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410206</td>
			<td>Category: Antibody 
			Abbreviation/Comment: ChIP Ctrl antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tubulin alpha</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108629</td>
			<td>Category: Antibody 
			Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-Transferrin (1 mg/ml)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1147</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: For CCM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement (50x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: For CCM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>G2940CA</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: For analysis of sheared chromatin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor NextGen</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: Ultrasonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid pH 8.4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: For CPC culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect RT PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855201</td>
			<td>Category: ChIP Analysis 
			Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320-033</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: For CGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein A</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10001D</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: Magnetic beads, for ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPZ-5676</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7062</td>
			<td>Category: DOT1L inhibition 
			Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid</td>
			<td>SERVA</td>
			<td>39760.01</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum 10% (v/v)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: For CPC isolation and CGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: For CGNP isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione (1.25 mg/ml)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4251</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: For CCM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3187</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: For cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq mastermix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A6002</td>
			<td>Category: ChIP Analysis 
			Abbreviation/Comment: DNA polymerase master mix for qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025-100</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: For CCM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: For CPC culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4408</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: LiCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: For CGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 3300</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3300</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: Fluorospectrometer for DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E7645S</td>
			<td>Category: ChIP Analysis 
			Abbreviation/Comment: Kit for Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E7335</td>
			<td>Category: ChIP Analysis 
			Abbreviation/Comment: Oligos for Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: For CCM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 Alternative</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>492016</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: For ChIP buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>335</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: PFA, for cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15640055</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: PSN, for CCM and CGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoGreen Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P11496</td>
			<td>Category: ChIP Analysis 
			Abbreviation/Comment: Visualizing dye for DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6407</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: For CGNP isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: For CPC culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: KCl, for CGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: For ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3115879001</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: For ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen MinElute</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: Kit for DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6513</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: For ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGC0946</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7079</td>
			<td>Category: DOT1L inhibition 
			Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8551.1</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: for Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: NaCl, for ChIP buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30970</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: For ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecylsulfate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>183</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: SDS, for ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic hedgehock (SHH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SRP6004</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: For CGNP isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superoxide dismutase (1mg/ml)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7571</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: For CCM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9090</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: TRIS, for ChIP buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X100</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: For ChIP buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0,05% (w/v)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59417C</td>
			<td>Category: Cell culture 
			Abbreviation/Comment: For CPC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>28320</td>
			<td>Category: ChIP 
			Abbreviation/Comment: For bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Other Lab devices: Neubauer counting chamber, Incubator, Rotator, Shaker, Disection set, Water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCM: Cortical cell medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGM: CGNP cell culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and cultivation of neural progenitors followed by chromatin-immunoprecipitation of histone 3 lysine 79 dimethylation mark

התפתחות המוח הוא תהליך מורכב, שבשליטת באופן מרחבי בעיות מפרק מעברי צבע של אורגניזם ותוכניות תעתיק שונה. בנוסף, שינויים epigenetic כרומטין, כמו היסטון מתילציה, יש תפקיד חשוב עבור ביסוס ושמירה על גורלם תא ספציפי בתוך התהליך הזה. הרוב המכריע של היסטון מתילציה מתרחשת על הזנב היסטון גמיש, הנגיש מכפילי היסטון, מחקים של חלבונים קורא היסטון. לעומת זאת, H3K79 מתילציה ממוקם בתחום הכדוריים היסטון 3, הייתה שם בפונקציות התפתחותיים שונים. מתילציה H3K79 אבולוציונית כולו, ניתן למצוא מגוון רחב של מינים של הומו ספיינס כדי האפייה. השינוי מתרחש בקרב אוכלוסיות תאים שונים בתוך אורגניזמים, כולל אבות עצבית. המיקום של מתילציה H3K79 בתחום הכדוריים של היסטון 3 מקשה להעריך. כאן, אנו מציגים שיטות כדי לבודד, קדמון קורטיקלית התרבות תאים (CPCs) של רקמת מוח קליפתי עובריים (E11.5-E14.5) או אסטרוציטומה נוירון פרטנית אבות (CGNPs) מרקמות כמחנכת (P5-P7), וכדי ביעילות immunoprecipitate H3K79me2 עבור ה-PCR כמותי (qPCR) ורצף הגנום כולו.

ערכת כללי של קדמון העצבי בידוד, טיפוח, שבב H3K79me2 ושיטות ניתוח שבב: איור 1 מציג תרשים זרימה כדי לבצע שבב H3K79me2 של ובתאים קורטיקלית בנקודות זמן שונות במהלך התפתחות המוח עובריים או של נוירון פרטנית אסטרוציטומה אבות בשלבים כמחנכת. כצעד ראשון, המוח צריך ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark at JoVE.com

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

בידוד, טיפוח של אבות עצבית ואחריו Immunoprecipitation-כרומטין של היסטון 3 ליזין 79 Dimethylation מארק

אנו מציגים שיטה לשחזור ויעילים כדי לבודד את תרבות ובתאים עצבית של רקמת מוח עובריים ופוסט עבור immunoprecipitation כרומטין (ChIP) של היסטון 3 ליזין 79 dimethylation (H3K79me2) - סימן היסטון ממוקם במרחק תחום הכדוריים של היסטון 3.

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Neuroscience

Unit 2

Analyzing Gene Expression and Function

SCIENTISTS IN ACTION

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

הפקה של חילוץ העובר צ&#39;יק לגידול Murine בתאי גזע עצביים קרסט

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

אפיון פיזיולוגיים, מורפולוגי והעצבית של נוירונים מווסתת על ידי תנועת

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

הכרומטין immunoprecipitation מרקמות השורש הגבי הגרעינים בעקבות פציעה axonal

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

זיהוי של היפוקסיה Microregional בקליפת עכבר מוחין על ידי הדמיה של שני הפוטונים אנדוגני NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

עכבר לשחזור Sciatic עצב קראש והערכה לאחר ההתחדשות של ניתוח הר שלם שריר

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

בידוד והתרבות של תאים עובריים עצביים עכברוש: ​​פרוטוקול מהיר

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

נוהל אופטימליים עבור Fluorescence המופעל בידוד מיון (FACS) תא של אבות עצביות האוטונומית מאיברים בטן של עכברים עוברית

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

Promotion of Survival and Differentiation of Neural Stem Cells with Fibrin and Growth Factor Cocktails after Severe Spinal Cord Injury

קידום ההישרדות וההתמיינות של תאי גזע עצביים עם פיברין וקוקטיילי גורם גדילה לאחר פגיעה בחוט השדרה חמורה

Neural stem cells (NSCs) can self-renew and differentiate into neurons and glia. Transplanted NSCs can replace lost neurons and glia after spinal cord ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Assay נדידת תאים כמותיות לMurine אבות עצביים enteric

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...