Name: isolation and cultivation of adult rat cardiomyocytes
Uploaded: 2017-10-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

Forfatterne takke Nadine Woitasky og Peter Volk for teknisk bistand. Derudover, takke forfatterne fru Claudia Lorenz (medicinsk forfatter, ACCEDIS) for hendes hjælp til at forberede håndskriftet. Dette manuskript blev støttet økonomisk af DFG (Schlu 324/7-1).

undersøgelsen er foretaget efter vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr udgivet af os National Institute of Health (NIH publikation nr. 85-23, revideret 1996). I almindelighed, mandlige wistar rotter i alderen 3 til 4 måneder og med en gennemsnitlig vægt på 250-350 g bruges til denne protokol. En rotte hjerte er tilstrækkelig for 20 kultur retter (1 mL pr parabol, indvendig diameter: 35 mm) med en omtrentlig celle tæthed på 1,5 x 10 4 celler/1000 mm 2.
 1...

<ol>
	<li>Schl&#252;ter, K. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cardiomyocytes - Active Players in Cardiac Disease. , (2016).</li><li>Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+calcium+stable+adult+cardiac+myocytes.">Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).</li><li>Schl&#252;ter, K. -. D., Schreiber, D., Fabbro, D., McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+ventricular+cardiomyocytes:+isolation+and+culture.">Adult ventricular cardiomyocytes: isolation and culture.</a> Protein Tyrosine Kinases: From Inhibitors to Useful Drugs. 290, 305-314 (2005).</li><li>Eppenberger, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+analysis+of+the+regeneration+of+myofibrils+in+long-term+cultures+of+adult+cardiomyocytes+of+the+rat.">Immunocytochemical analysis of the regeneration of myofibrils in long-term cultures of adult cardiomyocytes of the rat.</a> Dev. Biol. 130 (1), 1-15 (1988).</li><li>Burrows, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cultivation+of+tissues+of+the+chick-embryo+outside+the+body.">The cultivation of tissues of the chick-embryo outside the body.</a> JAMA. 55 (24), 2057-2058 (1910).</li><li>Cavanaugh, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsation,+migration+and+division+in+dissociated+chick+embryo+heart+cells+in+vitro.">Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro.</a> J Exp Zool A Eco Genet Physiol. 128 (3), 573-589 (1955).</li><li>Muir, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+observation+on+the+cellular+structure+of+cardiac+muscle.">Further observation on the cellular structure of cardiac muscle.</a> J. Anat. 99, 27-46 (1965).</li><li>Powell, T., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+technique+for+the+isolation+and+purification+of+adult+cardiac+muscle+cells+having+respiratory+control+and+a+tolerance+to+calcium.">A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium.</a> Biochem. Biophys. Res. Com. 72 (1), 327-333 (1976).</li><li>Schwarzfeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+development+in+cell+culture+of+myocardial+cells+of+the+adult+rat.">Isolation and development in cell culture of myocardial cells of the adult rat.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 13 (6), 563-575 (1981).</li><li>Kubin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncostatin+M+is+a+major+mediator+of+cardiomyocyte+dedifferentiation+and+remodeling.">Oncostatin M is a major mediator of cardiomyocyte dedifferentiation and remodeling.</a> Cell Stem Cell. 9 (5), 420-432 (2011).</li><li>Nippert, F., Schreckenberg, R., Hess, A., Weber, M., Schl&#252;ter, K. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+Swiprosin-1+on+the+formation+of+pseudopodia-like+structures+and+&#946;-adrenoceptor+coupling+in+cultured+adult+rat+ventricular+cardiomyocytes.">The effects of Swiprosin-1 on the formation of pseudopodia-like structures and &#946;-adrenoceptor coupling in cultured adult rat ventricular cardiomyocytes.</a> PLoS ONE. 11 (12), e0167655 (2016).</li><li>Moses, R. L., Claycomb, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorganization+and+reestablishment+of+cardiac+muscle+cell+ultrastructure+in+cultured+adult+rat+ventricular+muscle+cells.">Disorganization and reestablishment of cardiac muscle cell ultrastructure in cultured adult rat ventricular muscle cells.</a> J. Ultrastruct. Res. 81 (3), 358-374 (1982).</li><li>Eppenberger-Eberhardt, M., Flamme, I., Kurer, V., Eppenberger, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reexpression+of+&#945;-smooth+muscle+actin+isoform+in+cultured+adult+rat+cardiomyocytes.">Reexpression of &#945;-smooth muscle actin isoform in cultured adult rat cardiomyocytes.</a> Dev. Biol. 139 (2), 269-278 (1990).</li><li>Fedak, P. W., Verma, S., Weisel, R. D., Skrtic, M., Li, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+remodeling+and+failure:+from+molecules+to+man+(Part+III).">Cardiac remodeling and failure: from molecules to man (Part III).</a> Cardiovasc. Pathol. 14 (3), 109-119 (2005).</li><li>Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+myocardial+regeneration.">Mechanisms of myocardial regeneration.</a> Trends Cardiovasc. Med. 21 (2), 52-58 (2011).</li><li>Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+remodeling-concepts+and+clinical+implications:+A+consensus+paper+from+an+international+forum+on+cardiac+remodeling.">Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an international forum on cardiac remodeling.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 35 (3), 569-582 (2000).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular biology of the cell. , (2015).</li><li>P&#246;ling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Janus+face+of+OSM-mediated+cardiomyocyte+dedifferentiation+during+cardiac+repair+and+disease.">The Janus face of OSM-mediated cardiomyocyte dedifferentiation during cardiac repair and disease.</a> Cell Cycle. 11 (3), 439-445 (2014).</li><li>Decker, M. L., Behnke-Barclay, M., Cook, M. G., Lesch, M., Decker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+evaluation+of+the+contractile+apparatus+in+primary+cultures+of+rabbit+cardiac+myocytes.">Morphometric evaluation of the contractile apparatus in primary cultures of rabbit cardiac myocytes.</a> Circ. Res. 69 (1), 86-94 (1991).</li></ol>

Funktionsmåden for voksen cardiomyocytes i vivo er påvirket af mange interaktioner med andre celler (f.eks., neuroner, endothelial celler, fibroblaster, inflammatoriske celler) og den elektriske syncytium, som de udgør1. Studerer stress tilpasning af voksen cardiomyocytes udelukkende kræver derfor, at isolering og dyrkning af ARVC. De vigtigste virkninger af afsondrethed og dyrke ARVC er: 1) afbryde dem fra ekstracellulære matrix og cell-celle kontakter; 2) afbryde dem fra k...

Voksen cardiomyocytes i vivo arbejde som en elektrisk syncytium baseret på celle-celle kontakter mellem myocytes. Derudover er de påvirket af tilstødende celler som hjerte fibroblaster, endothelial celler, neuroner og inflammatoriske celler1. For at studere cardiomyocytes evne til at tilpasse deres intracellulære organisation til ændret belastningsforhold, som set under Hjertehypertrofi, som er et indledende skridt fører til hjertesvigt, isolering og dyrkning af voksen ventrikulær rotte cardiomyocytes (ARVC) er nødvendigt2,3,4. Historisk, blev cardiomyocytes først isoleret fra embryonale chick hjerter5,6. Et par år senere, blev den første isolation af terminalt differentieret cardiomyocytes beskrevet ved hjælp af calcium udtynding7. Men disse voksen cardiomyocytes var ikke calcium tolerant og kunne derfor ikke bruges til funktionelle assays. Endelig, i 1976 en ny protokol aktiveret Powell og Twist at undersøge voksen ventrikulær cardiomyocytes under fysiologiske forhold8. Som et første skridt isoleres de voksne cardiomyocytes under lavt calcium koncentrationer og derefter øget calcium til fysiologiske koncentrationer i en trinvis procedure. I dag, de fleste protokoller til isolering og dyrkning af voksen cardiomyocytes arbejde med denne protokol, calcium og bruge collagenase for enzymatisk fordøjelsen af tætte celle-celle kontakter1.
For en vellykket dyrkning er føtalt kalveserum (FCS) eller oncostatin M (OSM) påkrævet. ARVC udføre en de - og re - differentiation med omfattende strukturelle ændringer herunder sarkomeret demontering og reformationen9,10,11,12. Denne proces er ledsaget af en fornyet udtryk for føtal-type gener, som β-myosin heavy chain (β-MHC), som det kendes fra hypertrofi, og dannelsen af pseudopodia-lignende strukturer, også kaldet sprede4,11, 13. Desuden swiprosin-1 (EFHD2), en nyligt identificerede proteiner, spiller en vigtig rolle ved at re differentiering af dyrkede ARVC11. Som et resultat, omdanne ARVC i kultur udbredt, polymorfe celler, som spontant Vis sammentrækninger efter to til tre uger i kultur2,4,14.
De seneste opdagelser har afsløret, at hjertets re og deaktivere differentiation som det sker kultur betingelser efterligner funktioner set i vivo under hjerte remodeling10,15. Hjerte remodellering er en central proces under hjerte sygdomme16. Som hjerte sygdomme er stadig den vigtigste dødsårsag i de industrialiserede samfund, en bedre forståelse af voksen cardiomyocytes biologi er vigtigt (der; 2015). Isolering og dyrkning af ARVC kan bidrage til at udvikle nye strategier og lægemidler til behandling af hjerte sygdomme. Med dette manuskript, er en protokol til isolering og dyrkning af ARVC leveret. Desuden, nogle vigtige dele af denne metode er fremhævet i afsnittet diskussion.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Langendorff perfusion system</td>
			<td>inhouse construction</td>
			<td></td>
			<td>double-walled with a water 
			based heating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue chopper Mc Ilwain</td>
			<td>Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aortic Cannula, OD 1,8 mm</td>
			<td>inhouse construction</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abdominal shears</td>
			<td>Aeskulap</td>
			<td>BC772R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capsule forceps</td>
			<td>Eickemeyer</td>
			<td>171307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissor large</td>
			<td>Aeskulap</td>
			<td>BC562R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissor small</td>
			<td>Aeskulap</td>
			<td>BC163R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mash with Polyamid</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>4-1413</td>
			<td>mash size 200 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic disc</td>
			<td>Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Typ II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and cultivation of adult rat cardiomyocytes

I en intakt hjerte påvirke tilstødende celler voksne cardiomyocytes. Med metoden til isolering og dyrkning af voksen cardiomyocytes er en nøjagtig undersøgelse af funktionaliteten af disse celler under specifikke behandlinger og miljøer muligt. Dette manuskript præsenterer en protokol for vellykket isolering og dyrkning af voksen rotte ventrikulær cardiomyocytes (ARVC).
Rotten er ofret af cervikal dislokation under dyb anæstesi. Derefter, hjertet er udvundet og aorta er afdækket. Efterfølgende, er perfusion på Langendorff perfusion system med calcium udtynding og collagenase behandling udført. Bagefter, ventrikulær væv bliver hakket, recirkuleret, og filtreret, efterfulgt af tre centrifugering trin med gradvis tilføjelse af CaCl2 indtil fysiologiske calcium koncentrationen er nået. ARVC er belagt på celle kultur retter. Efter forfriskende cellekulturmedium, kan ARVC være dyrket i op til seks dage uden at ændre næringssubstratet serum-holdige. Isolering af ARVC er en følsom proces, calcium. Små ændringer i den intracellulære calcium koncentration forårsage et fald i kvaliteten og levedygtigheden af de isolerede celler.
Frisk isoleret ARVC er stang formet. Inden for de første dage af dyrkningen mister de de stavformet morfologi og form pseudopodia-lignende strukturer (spredning). Under denne morfologiske dannelse ARVC oprindeligt forringe deres kontraktile elementer efterfulgt af en reformation gennem actin stress fibre og de novo sarcomerogenesis. Efter en uge med dyrkning, de fleste ARVC viser en udbredt udseende med en klart påviselig cross striation. Denne proces er følsomme over for intracellulære calcium koncentration, som behandling med ionomycin dæmper spredning. Vigtige markører i denne proces af de - og re - differentiation er β-myosin heavy chain (β-MHC), oncostatin Mikkelsen (OSM) og swiprosin-1 (EFHD2). Nylige undersøgelser har antydet, at hjertets re og deaktivere differentiation optræder under kultur efterligner funktioner set i vivo under hjerte remodellering. Derfor, isolering og dyrkning af ARVC spiller en central rolle i forståelsen af cardiomyocytes biologi.

Voksen cardiomyocytes i kultur: Figur 1 viser en oversigt over frisk isolerede voksen cardiomyocytes 2 h efter den sidste vask. Ca. 75% af alle cardiomyocytes havde en stavformet morfologi. De resterende 25% viste en usædvanligt udseende med en runde morfologi og ingen påviselige intakt cellemembranen (figur 1). I slutningen af dyrkning (dag 6), op til 15% af alle cardiomyocytes viste spredning, ca. 10% forblev...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

Vi præsenterer her, en protokol til isolering og dyrkning af voksen rotte ventrikulær cardiomyocytes (ARVC). Isolerede ARVC kan bruges til kort- og langsigtede dyrkning. Isolering og dyrkning af ARVC kan spille en central rolle i udviklingen af nye behandlingsregimer for hjerte sygdomme.

Isolering og dyrkning af voksen rotte Cardiomyocytes

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Isolering og funktionel karakterisering af human Ventrikulær kardiomyocytter fra Fresh Kirurgiske Prøver

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

Isolering af atrieflimren Cardiomyocytes fra en rotte Model af metabolisk syndrom-relaterede hjertesvigt med bevarede uddrivningsfraktion

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of ...

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

En effektiv Sieving metode til at isolere intakt Glomeruli fra voksen rotte nyre

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

Isolering af atrial Myocytes fra voksne mus

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Murine myokardieinfarkt model ved hjælp af permanent ligation af venstre anterior faldende koronararterie

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Ultralyd-forstærket primær voksen fibroblast isolation

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In Vitro vurdering af hjertefunktion ved hjælp af flået kardiomyocytter

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Isolation and Cultivation of Mandibular Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats

Isolation og dyrkning af mandibular knoglemarv mesenchymale stamceller hos rotter

Here we present an efficient method for isolating and culturing mandibular bone marrow mesenchymal stem cells (mBMSCs) in vitro to rapidly obtain numerous ...

Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.

Sarcomere Afkortning af pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter ved hjælp af fluorescerende-tagged Sarcomere proteiner.

Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) can be produced from both embryonic and induced pluripotent stem (ES/iPS) cells. These cells ...

Modifications of the Langendorff Method for Simultaneous Isolation of Atrial and Ventricular Myocytes from Adult Mice

Ændringer af Langendorff-metoden til samtidig isolering af atrie- og ventrikulære myocytter fra voksne mus

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction ...