Name: isolation and cultivation of adult rat cardiomyocytes
Uploaded: 2017-10-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

De auteurs danken Nadine Woitasky en Peter Volk voor technische bijstand. Bovendien, danken de auteurs mevrouw Claudia Lorenz (medische schrijver, ACCEDIS) voor haar hulp bij de voorbereiding van het manuscript. Dit manuscript werd financieel ondersteund door DFG (Schlu 324/7-1).

het onderzoek wordt uitgevoerd volgens de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren gepubliceerd door de ons National Institute of Health (NIH publicatie nr. 85-23, herziene versie van 1996). In het algemeen, mannelijke wistar ratten van 3 tot 4 maanden oud en met een gemiddeld gewicht van 250-350 g worden gebruikt voor dit protocol. Een rat hart is voldoende voor 20 cultuur gerechten (1 mL per schotel; inwendige diameter: 35 mm) met een geschatte celdichtheid van 1.5 x 10 4 cellen/1000 mm 2...

<ol>
	<li>Schl&#252;ter, K. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cardiomyocytes - Active Players in Cardiac Disease. , (2016).</li><li>Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+calcium+stable+adult+cardiac+myocytes.">Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).</li><li>Schl&#252;ter, K. -. D., Schreiber, D., Fabbro, D., McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+ventricular+cardiomyocytes:+isolation+and+culture.">Adult ventricular cardiomyocytes: isolation and culture.</a> Protein Tyrosine Kinases: From Inhibitors to Useful Drugs. 290, 305-314 (2005).</li><li>Eppenberger, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+analysis+of+the+regeneration+of+myofibrils+in+long-term+cultures+of+adult+cardiomyocytes+of+the+rat.">Immunocytochemical analysis of the regeneration of myofibrils in long-term cultures of adult cardiomyocytes of the rat.</a> Dev. Biol. 130 (1), 1-15 (1988).</li><li>Burrows, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cultivation+of+tissues+of+the+chick-embryo+outside+the+body.">The cultivation of tissues of the chick-embryo outside the body.</a> JAMA. 55 (24), 2057-2058 (1910).</li><li>Cavanaugh, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsation,+migration+and+division+in+dissociated+chick+embryo+heart+cells+in+vitro.">Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro.</a> J Exp Zool A Eco Genet Physiol. 128 (3), 573-589 (1955).</li><li>Muir, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+observation+on+the+cellular+structure+of+cardiac+muscle.">Further observation on the cellular structure of cardiac muscle.</a> J. Anat. 99, 27-46 (1965).</li><li>Powell, T., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+technique+for+the+isolation+and+purification+of+adult+cardiac+muscle+cells+having+respiratory+control+and+a+tolerance+to+calcium.">A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium.</a> Biochem. Biophys. Res. Com. 72 (1), 327-333 (1976).</li><li>Schwarzfeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+development+in+cell+culture+of+myocardial+cells+of+the+adult+rat.">Isolation and development in cell culture of myocardial cells of the adult rat.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 13 (6), 563-575 (1981).</li><li>Kubin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncostatin+M+is+a+major+mediator+of+cardiomyocyte+dedifferentiation+and+remodeling.">Oncostatin M is a major mediator of cardiomyocyte dedifferentiation and remodeling.</a> Cell Stem Cell. 9 (5), 420-432 (2011).</li><li>Nippert, F., Schreckenberg, R., Hess, A., Weber, M., Schl&#252;ter, K. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+Swiprosin-1+on+the+formation+of+pseudopodia-like+structures+and+&#946;-adrenoceptor+coupling+in+cultured+adult+rat+ventricular+cardiomyocytes.">The effects of Swiprosin-1 on the formation of pseudopodia-like structures and &#946;-adrenoceptor coupling in cultured adult rat ventricular cardiomyocytes.</a> PLoS ONE. 11 (12), e0167655 (2016).</li><li>Moses, R. L., Claycomb, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorganization+and+reestablishment+of+cardiac+muscle+cell+ultrastructure+in+cultured+adult+rat+ventricular+muscle+cells.">Disorganization and reestablishment of cardiac muscle cell ultrastructure in cultured adult rat ventricular muscle cells.</a> J. Ultrastruct. Res. 81 (3), 358-374 (1982).</li><li>Eppenberger-Eberhardt, M., Flamme, I., Kurer, V., Eppenberger, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reexpression+of+&#945;-smooth+muscle+actin+isoform+in+cultured+adult+rat+cardiomyocytes.">Reexpression of &#945;-smooth muscle actin isoform in cultured adult rat cardiomyocytes.</a> Dev. Biol. 139 (2), 269-278 (1990).</li><li>Fedak, P. W., Verma, S., Weisel, R. D., Skrtic, M., Li, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+remodeling+and+failure:+from+molecules+to+man+(Part+III).">Cardiac remodeling and failure: from molecules to man (Part III).</a> Cardiovasc. Pathol. 14 (3), 109-119 (2005).</li><li>Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+myocardial+regeneration.">Mechanisms of myocardial regeneration.</a> Trends Cardiovasc. Med. 21 (2), 52-58 (2011).</li><li>Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+remodeling-concepts+and+clinical+implications:+A+consensus+paper+from+an+international+forum+on+cardiac+remodeling.">Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an international forum on cardiac remodeling.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 35 (3), 569-582 (2000).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular biology of the cell. , (2015).</li><li>P&#246;ling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Janus+face+of+OSM-mediated+cardiomyocyte+dedifferentiation+during+cardiac+repair+and+disease.">The Janus face of OSM-mediated cardiomyocyte dedifferentiation during cardiac repair and disease.</a> Cell Cycle. 11 (3), 439-445 (2014).</li><li>Decker, M. L., Behnke-Barclay, M., Cook, M. G., Lesch, M., Decker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+evaluation+of+the+contractile+apparatus+in+primary+cultures+of+rabbit+cardiac+myocytes.">Morphometric evaluation of the contractile apparatus in primary cultures of rabbit cardiac myocytes.</a> Circ. Res. 69 (1), 86-94 (1991).</li></ol>

Het gedrag van volwassen cardiomyocytes in vivo wordt beïnvloed door veel interacties met andere cellen (bijvoorbeeld, neuronen, endotheliale cellen, fibroblasten, ontstekingscellen) en de elektrische syncytium die zij vormen1. Bestuderen van stress aanpassing van volwassen cardiomyocytes uitsluitend, vereist daarom het isolement en de teelt van ARVC. De belangrijkste gevolgen van isoleren en het cultiveren van ARVC zijn: 1) verbreekt van extracellulaire matrix en cel-cel contac...

Werken als een elektrische syncytium op basis van cel-cel contacten tussen myocytes volwassen cardiomyocytes in vivo . Bovendien, worden zij beïnvloed door aangrenzende cellen zoals cardiale fibroblasten, endotheliale cellen en neuronen ontstekingscellen1. Om te bestuderen van de mogelijkheid van cardiomyocytes aan te passen hun intracellulaire organisatie gewijzigd beladingstoestanden, zoals gezien tijdens de hypertrofie van het hart, die een eerste stap leidt tot hartfalen, de isolatie en de teelt van volwassen ventriculaire ratten cardiomyocytes (ARVC) is nodig2,3,4. Historisch, waren cardiomyocytes eerst geïsoleerd uit embryonale chick harten5,6. Een paar jaar later, werd de eerste isolatie van terminaal gedifferentieerde cardiomyocytes beschreven met behulp van calcium uitputting7. Echter is deze volwassen cardiomyocytes waren niet calcium tolerant en kan daarom niet worden gebruikt voor functionele testen. Ten slotte, in 1976 een nieuw protocol ingeschakeld Powell en Twist te onderzoeken van volwassen ventriculaire cardiomyocytes onder fysiologische omstandigheden8. Als een eerste stap geïsoleerd ze volwassen cardiomyocytes onder lage calcium concentraties en daarna verhoogd calcium aan fysiologische concentraties in een stapsgewijze procedure. Vandaag meeste protocollen voor het isoleren en de teelt van volwassen cardiomyocytes werk met dit protocol calcium en collagenase gebruiken voor de enzymatische vertering van de dichte cel contacten1.
Voor een succesvolle teelt is foetaal kalfsserum (FCS) of oncostatin M (OSM) vereist. ARVC uitvoeren een de - en re - differentiation met uitgebreide structurele veranderingen, met inbegrip van de Sarcomeer demontage en Reformatie9,10,11,12 Dit proces gaat gepaard met een nieuwe expressie van genen die foetale-type, zoals β-myosin zware ketting (β-MHC), zoals bekend van hypertrofie, en een vorming van pseudopodia-achtige structuren, een afkorting voor verspreiding4,11, 13. Voorts swiprosin-1 (EFHD2), een nieuw geïdentificeerde eiwit, speelt een belangrijke rol in het proces van re differentiatie van gekweekte ARVC11. Dientengevolge, ARVC in cultuur transformeren in grootschalige, polymorfe cellen, waaruit spontaan weeën na twee tot drie weken in cultuur2,4,14.
Recente ontdekkingen hebben onthuld dat cardiale re - en de - differentiation zoals het gebeurt onder de kweekomstandigheden nabootsers functies gezien in vivo tijdens cardiale remodelleert10,15. Cardiale remodelleren is een belangrijke proces tijdens hartziekten16. Zoals hartziekten nog steeds de belangrijkste doodsoorzaak in de geïndustrialiseerde samenlevingen zijn, een beter begrip van de biologie van volwassen cardiomyocytes is belangrijk (die; 2015). Isolatie en teelt van ARVC kunnen helpen bij het ontwikkelen van nieuwe strategieën en medicijnen voor de behandeling van hartziekten. Met dit manuscript, wordt een protocol voor het isoleren en de teelt van ARVC geleverd. Bovendien, sommige kritieke onderdelen van deze methode zijn gemarkeerd in de sectie discussie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Langendorff perfusion system</td>
			<td>inhouse construction</td>
			<td></td>
			<td>double-walled with a water 
			based heating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue chopper Mc Ilwain</td>
			<td>Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aortic Cannula, OD 1,8 mm</td>
			<td>inhouse construction</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abdominal shears</td>
			<td>Aeskulap</td>
			<td>BC772R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capsule forceps</td>
			<td>Eickemeyer</td>
			<td>171307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissor large</td>
			<td>Aeskulap</td>
			<td>BC562R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissor small</td>
			<td>Aeskulap</td>
			<td>BC163R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mash with Polyamid</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>4-1413</td>
			<td>mash size 200 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic disc</td>
			<td>Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Typ II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and cultivation of adult rat cardiomyocytes

In een intact hart invloed op aangrenzende cellen volwassen cardiomyocytes. Met de methode van isolatie en teelt van volwassen cardiomyocytes is een nauwkeurig onderzoek van het gedrag van deze cellen onder specifieke behandelingen en omgevingen mogelijk. Dit manuscript presenteert een protocol voor succesvolle isolatie en teelt van volwassen ratten ventriculaire cardiomyocytes (ARVC).
De rat wordt opgeofferd door cervicale dislocatie onder diepe verdoving. Vervolgens het hart wordt geëxtraheerd en de aorta wordt blootgelegd. Perfusie op het Langendorff perfusie systeem met calcium uitputting en collagenase behandeling wordt vervolgens uitgevoerd. Daarna, ventriculaire weefsel krijgt gehakt, opnieuw verspreid, en gefilterd, gevolgd door drie centrifugeren stappen met geleidelijke toevoeging van CaCl2 totdat fysiologische calcium concentratie wordt bereikt. ARVC zijn vergulde op cel cultuur gerechten. Na het vernieuwen van het kweekmedium cel, mag ARVC worden verbouwd tot maximaal zes dagen zonder het kweekmedium serum-bevattende. Isolatie van ARVC is een calcium-gevoelige proces. Kleine veranderingen in de concentratie van intracellulair calcium leiden tot een afname van de kwaliteit en de levensvatbaarheid van de geïsoleerde cellen.
Vers geïsoleerd ARVC zijn staaf vormige. In de eerste dagen van de teelt van verliezen ze de staafvormig morfologie en formulier pseudopodia-achtige structuren (spreiding). Tijdens deze morfologische formatie degraderen ARVC aanvankelijk hun contractiele elementen, gevolgd door een Reformatie door middel van actine stress vezels en DOVO sarcomerogenesis. Na een week van teelt, meeste ARVC Toon een wijdverbreide verschijning met een duidelijk waarneembare kruis strepen. Dit proces is gevoelig voor de concentratie van intracellulair calcium, zoals behandeling met ionomycin verspreiden verzwakt. Belangrijke markeringen in dit proces van de - en re - differentiation zijn β-myosin zware ketting (β-MHC), oncostatin M (OSM), en swiprosin-1 (EFHD2). Recente studies hebben gesuggereerd dat cardiale re - en de - differentiation onder cultuuromstandigheden voorkomende functies gezien in vivo tijdens het remodelleren van de cardiale nabootst. Daarom, isolatie en teelt van ARVC spelen een sleutelrol in het begrip van de biologie van cardiomyocytes.

Volwassen cardiomyocytes in cultuur: Figuur 1 toont een overzicht van vers geïsoleerde volwassen cardiomyocytes 2 h na de laatste wassen. Ongeveer 75% van alle cardiomyocytes had een staafvormig morfologie. De resterende 25% bleek een ongewone verschijning met een ronde morfologie en geen detecteerbare intact celmembraan (Figuur 1). Aan het einde van de teelt (dag 6), tot 15% van alle cardiomyocytes toonde versp...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

Hier presenteren we een protocol voor het isoleren en de teelt van volwassen ratten ventriculaire cardiomyocytes (ARVC). Geïsoleerde ARVC kan worden gebruikt voor de teelt van korte en lange termijn. De isolatie en de teelt van ARVC kunnen spelen een sleutelrol bij de ontwikkeling van nieuwe behandeling regimes voor hartziekten.

Isolatie en teelt van volwassen ratten Cardiomyocytes

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Isolatie en functionele karakterisering van Human ventriculaire cardiomyocyten van Fresh Chirurgische Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

Isolatie van atriale Cardiomyocytes van een Rat Model van metabole syndroom-gerelateerde hartfalen met bewaarde ejectie Fractie

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of ...

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

Een efficiënte zeven methode te isoleren Intact Glomeruli van de nier van volwassen ratten

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

Isolatie van atriale Myocyten van volwassen muizen

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Murine myocardinfarct model met behulp van permanente Ligatie van linker anterieure aflopende coronaire slagader

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Ultrasoon-verhoogde primaire volwassen fibroblast-isolatie

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In Vitro Beoordeling van cardiale functie met behulp van gevilde cardiomyocyten

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Isolation and Cultivation of Mandibular Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats

Isolatie en teelt van mandibulaire beenmerg mesenchymale stamcellen bij ratten

Here we present an efficient method for isolating and culturing mandibular bone marrow mesenchymal stem cells (mBMSCs) in vitro to rapidly obtain numerous ...

Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.

Sarcomere Verkorting van Pluripotente Stamcel-Afgeleide Cardiomyocyten met behulp van Fluorescerende-Tagged Sarcomere Eiwitten.

Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) can be produced from both embryonic and induced pluripotent stem (ES/iPS) cells. These cells ...

Modifications of the Langendorff Method for Simultaneous Isolation of Atrial and Ventricular Myocytes from Adult Mice

Modificaties van de Langendorff-methode voor gelijktijdige isolatie van atriale en ventriculaire myocyten van volwassen muizen

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction ...