Name: isolation and cultivation of adult rat cardiomyocytes
Uploaded: 2017-10-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

Die Autoren danken Nadine Woitasky und Peter Volk für technische Hilfe. Darüber hinaus danken den Autoren für ihre Hilfe bei der Vorbereitung der Handschrift Frau Claudia Lorenz (medizinische Schriftsteller, ACCEDIS). Dieser Handschrift wurde finanziell unterstützt von der DFG (Schlu 324/7-1).

die Untersuchung nach der Anleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren durch die US National Institute of Health (NIH Publikation Nr. 85-23, revidiert 1996) veröffentlicht. In der Regel männliche Wistar-Ratten im Alter von 3 bis 4 Monaten und mit einem durchschnittlichen Gewicht von 250-350 g sind für dieses Protokoll verwendet. Eine Ratte Herz ist ausreichend für 20 Kultur Gerichte (1 mL pro Schale; innen-ø: 35 mm) mit einer ungefähren Zelldichte von 1,5 x 10 4 Zellen/1000 mm 2.<...

<ol>
	<li>Schl&#252;ter, K. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cardiomyocytes - Active Players in Cardiac Disease. , (2016).</li><li>Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+calcium+stable+adult+cardiac+myocytes.">Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).</li><li>Schl&#252;ter, K. -. D., Schreiber, D., Fabbro, D., McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+ventricular+cardiomyocytes:+isolation+and+culture.">Adult ventricular cardiomyocytes: isolation and culture.</a> Protein Tyrosine Kinases: From Inhibitors to Useful Drugs. 290, 305-314 (2005).</li><li>Eppenberger, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+analysis+of+the+regeneration+of+myofibrils+in+long-term+cultures+of+adult+cardiomyocytes+of+the+rat.">Immunocytochemical analysis of the regeneration of myofibrils in long-term cultures of adult cardiomyocytes of the rat.</a> Dev. Biol. 130 (1), 1-15 (1988).</li><li>Burrows, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cultivation+of+tissues+of+the+chick-embryo+outside+the+body.">The cultivation of tissues of the chick-embryo outside the body.</a> JAMA. 55 (24), 2057-2058 (1910).</li><li>Cavanaugh, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsation,+migration+and+division+in+dissociated+chick+embryo+heart+cells+in+vitro.">Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro.</a> J Exp Zool A Eco Genet Physiol. 128 (3), 573-589 (1955).</li><li>Muir, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+observation+on+the+cellular+structure+of+cardiac+muscle.">Further observation on the cellular structure of cardiac muscle.</a> J. Anat. 99, 27-46 (1965).</li><li>Powell, T., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+technique+for+the+isolation+and+purification+of+adult+cardiac+muscle+cells+having+respiratory+control+and+a+tolerance+to+calcium.">A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium.</a> Biochem. Biophys. Res. Com. 72 (1), 327-333 (1976).</li><li>Schwarzfeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+development+in+cell+culture+of+myocardial+cells+of+the+adult+rat.">Isolation and development in cell culture of myocardial cells of the adult rat.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 13 (6), 563-575 (1981).</li><li>Kubin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncostatin+M+is+a+major+mediator+of+cardiomyocyte+dedifferentiation+and+remodeling.">Oncostatin M is a major mediator of cardiomyocyte dedifferentiation and remodeling.</a> Cell Stem Cell. 9 (5), 420-432 (2011).</li><li>Nippert, F., Schreckenberg, R., Hess, A., Weber, M., Schl&#252;ter, K. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+Swiprosin-1+on+the+formation+of+pseudopodia-like+structures+and+&#946;-adrenoceptor+coupling+in+cultured+adult+rat+ventricular+cardiomyocytes.">The effects of Swiprosin-1 on the formation of pseudopodia-like structures and &#946;-adrenoceptor coupling in cultured adult rat ventricular cardiomyocytes.</a> PLoS ONE. 11 (12), e0167655 (2016).</li><li>Moses, R. L., Claycomb, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorganization+and+reestablishment+of+cardiac+muscle+cell+ultrastructure+in+cultured+adult+rat+ventricular+muscle+cells.">Disorganization and reestablishment of cardiac muscle cell ultrastructure in cultured adult rat ventricular muscle cells.</a> J. Ultrastruct. Res. 81 (3), 358-374 (1982).</li><li>Eppenberger-Eberhardt, M., Flamme, I., Kurer, V., Eppenberger, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reexpression+of+&#945;-smooth+muscle+actin+isoform+in+cultured+adult+rat+cardiomyocytes.">Reexpression of &#945;-smooth muscle actin isoform in cultured adult rat cardiomyocytes.</a> Dev. Biol. 139 (2), 269-278 (1990).</li><li>Fedak, P. W., Verma, S., Weisel, R. D., Skrtic, M., Li, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+remodeling+and+failure:+from+molecules+to+man+(Part+III).">Cardiac remodeling and failure: from molecules to man (Part III).</a> Cardiovasc. Pathol. 14 (3), 109-119 (2005).</li><li>Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+myocardial+regeneration.">Mechanisms of myocardial regeneration.</a> Trends Cardiovasc. Med. 21 (2), 52-58 (2011).</li><li>Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+remodeling-concepts+and+clinical+implications:+A+consensus+paper+from+an+international+forum+on+cardiac+remodeling.">Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an international forum on cardiac remodeling.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 35 (3), 569-582 (2000).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular biology of the cell. , (2015).</li><li>P&#246;ling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Janus+face+of+OSM-mediated+cardiomyocyte+dedifferentiation+during+cardiac+repair+and+disease.">The Janus face of OSM-mediated cardiomyocyte dedifferentiation during cardiac repair and disease.</a> Cell Cycle. 11 (3), 439-445 (2014).</li><li>Decker, M. L., Behnke-Barclay, M., Cook, M. G., Lesch, M., Decker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+evaluation+of+the+contractile+apparatus+in+primary+cultures+of+rabbit+cardiac+myocytes.">Morphometric evaluation of the contractile apparatus in primary cultures of rabbit cardiac myocytes.</a> Circ. Res. 69 (1), 86-94 (1991).</li></ol>

Das Verhalten der Erwachsenen Herzzellen in Vivo ist beeinflusst durch viele Interaktionen mit anderen Zellen (z.B.Neuronen, Endothelzellen, Fibroblasten, Entzündungszellen) und die elektrischen Synzytien bilden sie1. Studium Stress Anpassung der adulten Kardiomyozyten ausschließlich erfordert daher, die Isolierung und Kultivierung ARVC. Die wichtigsten Auswirkungen der Isolierung und Kultivierung ARVC sind: 1) trennen sie von der extrazellulären Matrix und Zell-Zell Kontakte;...

Adulten Herzmuskelzellen in Vivo Arbeit als eine elektrische Synzytien nach Zell-Zell-Kontakten zwischen Myozyten. Darüber hinaus werden sie von benachbarten Zellen wie kardialen Fibroblasten, Endothelzellen, Neuronen und Entzündungszellen1beeinflusst. Um die Fähigkeit der Kardiomyozyten Anpassung ihrer intrazellulären Organisation zu studieren verändert Lastbedingungen, wie gesehen in Herzhypertrophie, die ein erster Schritt zur Herzinsuffizienz, die Isolierung und Kultivierung von Erwachsenen ventrikuläre Ratte führt Herzmuskelzellen (ARVC) ist notwendig2,3,4. In der Vergangenheit wurden Kardiomyozyten zunächst isoliert von embryonalen Küken Herzen5,6. Wenige Jahre später, wurde die erste Isolierung der unheilbar differenzierter Herzmuskelzellen mit Kalzium Erschöpfung7beschrieben. Allerdings diese adulten Kardiomyozyten waren nicht Kalzium tolerant und daher nicht für funktionelle Assays verwendet werden konnten. Schließlich, im Jahr 1976 ein neues Protokoll aktiviert Powell und Twist Erwachsenen ventrikuläre Herzzellen unter physiologischen Bedingungen8zu untersuchen. Als ersten Schritt isoliert sie Erwachsene Herzzellen unter niedrigen Kalzium-Konzentrationen und danach erhöhte Kalzium zu physiologischen Konzentrationen in einem schrittweisen Verfahren. Heute die meisten Protokolle zur Isolierung und Kultivierung von adulten Kardiomyozyten arbeiten mit diesem Kalzium-Protokoll und Kollagenase für die enzymatische Verdauung von dichten Zell-Zell Kontakte1verwenden.
Für einen erfolgreichen Anbau ist fetalen Kälberserum (FCS) oder Oncostatin M (OSM) erforderlich. ARVC führen eine de - und re - differentiation mit umfangreichen strukturellen Veränderungen einschließlich Sarkomers Demontage und Reformation9,10,11,12. Dieser Prozess ist durch einen erneuten Ausdruck der fetalen Typ Gene, wie β-Myosin heavy Chain (β-MHC) begleitet, wie man von Hypertrophie und eine Bildung von Pseudopodien-ähnliche Strukturen, auch genannt Verbreitung4,11, 13. Darüber hinaus Swiprosin-1 (EFHD2), ein neu identifizierten Protein spielt eine wichtige Rolle bei der erneuten Differenzierung der kultivierten ARVC11. Infolgedessen ARVC in Kultur verwandeln sich in weit verbreiteten, polymorphe Zellen, die Kontraktionen spontan nach zwei bis drei Wochen in Kultur2,4,14zeigen.
Die jüngsten Entdeckungen haben gezeigt, dass kardiale Re und de differentiation wie sie unter Kulturbedingungen Mimik Auftritt gesehen in Vivo während kardiale Umbau10,15bietet. Kardialen remodeling ist ein Schlüsselprozess bei Herzkrankheiten16. Da Herzerkrankungen noch die häufigste Todesursache in den industrialisierten Gesellschaften sind, ist es wichtig, ein besseres Verständnis der Biologie der adulten Kardiomyozyten (wer, 2015). Isolierung und Kultivierung ARVC können helfen, um neue Strategien und Medikamente für die Behandlung von Herzkrankheiten zu entwickeln. Mit diesem Manuskript ist ein Protokoll für die Isolierung und Kultivierung ARVC zur Verfügung gestellt. Darüber hinaus werden einige kritische Teile dieser Methode in die Diskussion Abschnitt hervorgehoben.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Langendorff perfusion system</td>
			<td>inhouse construction</td>
			<td></td>
			<td>double-walled with a water 
			based heating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue chopper Mc Ilwain</td>
			<td>Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aortic Cannula, OD 1,8 mm</td>
			<td>inhouse construction</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abdominal shears</td>
			<td>Aeskulap</td>
			<td>BC772R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capsule forceps</td>
			<td>Eickemeyer</td>
			<td>171307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissor large</td>
			<td>Aeskulap</td>
			<td>BC562R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissor small</td>
			<td>Aeskulap</td>
			<td>BC163R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mash with Polyamid</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>4-1413</td>
			<td>mash size 200 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic disc</td>
			<td>Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Typ II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and cultivation of adult rat cardiomyocytes

In einem intakten Herzen beeinflussen benachbarte Zellen adulten Kardiomyozyten. Mit der Methode der Isolierung und Kultivierung von adulten Kardiomyozyten ist eine genaue Untersuchung des Verhaltens dieser Zellen unter bestimmten Behandlungen und Umgebungen möglich. Diese Handschrift enthält ein Protokoll für erfolgreiche Isolierung und Kultivierung von Erwachsenen Ratte ventrikuläre Kardiomyozyten (ARVC).
Die Ratte ist durch zervikale Dislokation Tiefe Narkose geopfert. Dann, das Herz wird extrahiert und die Aorta ist aufgedeckt. Anschließend wird die Perfusion auf dem Langendorff Perfusion System mit Kalzium Erschöpfung und Kollagenase-Behandlung durchgeführt. Danach bekommt ventrikuläre Gewebe gehackt, wieder in Umlauf gebracht, und gefiltert, gefolgt von drei Zentrifugation Schritte mit allmählicher Zugabe von CaCl2 bis physiologischer Calcium-Konzentration erreicht ist. ARVC sind beschichtet, auf Zelle Kultur Gerichte. Nach dem Aktualisieren der Zellkulturmedium, können ARVC kultiviert bis zu sechs Tage lang ohne Änderung der Serum-haltigen Kulturmedium. Isolierung von ARVC ist ein Kalzium sensibler Prozess. Kleine Änderungen in der intrazellulären Calcium-Konzentration führen eine Abnahme in der Qualität und Rentabilität der isolierten Zellen.
Frisch isolierte ARVC Rod geformt sind. In den ersten Tagen des Anbaus verlieren sie die stabförmige Morphologie und Form Pseudopodien-ähnliche Strukturen (Verbreitung). Während dieser morphologischen Bildung ARVC zunächst verschlechtern ihre kontraktile Elemente, gefolgt von einer Reformation durch Aktin Stress Fasern und de Novo Sarcomerogenesis. Nach einer Woche des Anbaus die meisten ARVC zeigen eine weit verbreitete Erscheinung mit einem eindeutig nachweisbar Kreuz Streifenbildung. Dieser Prozess ist empfindlich auf intrazellulären Calcium-Konzentration, wie Behandlung mit Ionomycin Ausbreitung vermindert. Wichtigsten Marker in diesem Prozess der de - und re - differentiation sind β-Myosin heavy Chain (β-MHC), Oncostatin M (OSM) und Swiprosin-1 (EFHD2). Jüngste Studien haben vorgeschlagen, dass kardiale Re und de differentiation Auftritt unter Kulturbedingungen Funktionen gesehen in Vivo bei kardialen remodeling imitiert. Isolierung und Kultivierung ARVC spielen daher eine Schlüsselrolle für das Verständnis der Biologie der Herzmuskelzellen.

Erwachsenen Herzzellen in Kultur: Abbildung 1 zeigt eine Übersicht über frisch isolierte adulten Kardiomyozyten 2 h nach dem letzten waschen. Etwa 75 % aller Herzzellen hatte eine stabförmige Morphologie. Die restliche 25 % zeigten eine ungewöhnliche Erscheinung mit einer Runde Morphologie und keine nachweisbaren intakte Zellmembran (Abbildung 1). Am Ende des Anbaus (6. Tag), bis zu 15 % der alle Herzmuskelze...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Isolierung und Kultivierung von Erwachsenen Ratte ventrikuläre Kardiomyozyten (ARVC). Isolierte ARVC kann für kurz- und langfristige Anbau verwendet werden. Die Isolierung und Kultivierung ARVC können eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung von neuen Behandlungsschemata für kardiale Erkrankungen spielen.

Isolierung und Kultivierung von Erwachsenen Ratte Kardiomyozyten

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Isolierung und funktionelle Charakterisierung der Menschen ventrikuläre Kardiomyozyten von Fresh Chirurgische Proben

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Forschung

Medizin

Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

Isolierung von Vorhofflimmern Herzzellen aus einem Rattenmodell der metabolischen Syndrom im Zusammenhang mit Herzinsuffizienz mit erhaltener Auswurffraktion

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of ...

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

Eine effiziente Methode der Absiebung, intakten Glomeruli von Erwachsenen Ratte Niere zu isolieren

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

Isolierung von Atrial Myozyten von erwachsenen Mäusen

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Murine Myokardinfarkt Modell mit permanenten Ligation der linken Anterior absteigende Koronararterie

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Ultraschall-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In Vitro-Bewertung der Herzfunktion mit gehäuteten Kardiomyozyten

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Isolation and Cultivation of Mandibular Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats

Isolierung und Kultivierung von MandibularKnochenmark Mesenchymal Stammzellen bei Ratten

Here we present an efficient method for isolating and culturing mandibular bone marrow mesenchymal stem cells (mBMSCs) in vitro to rapidly obtain numerous ...

Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.

Sarkomere-Verkürzung von pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten unter Verwendung fluoreszierender Sarkomere-Proteine.

Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) can be produced from both embryonic and induced pluripotent stem (ES/iPS) cells. These cells ...

Modifications of the Langendorff Method for Simultaneous Isolation of Atrial and Ventricular Myocytes from Adult Mice

Modifikationen der Langendorff-Methode zur gleichzeitigen Isolierung von atrialen und ventrikulären Myozyten aus erwachsenen Mäusen

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction ...