Name: isolation and cultivation of adult rat cardiomyocytes
Uploaded: 2017-10-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

Forfatterne takke Nadine Woitasky og Peter Volk for teknisk assistanse. I tillegg takker forfatterne fru Claudia Lorenz (medisinsk skribent, ACCEDIS) for henne hjelp i å forberede manuskriptet. Dette manuskriptet ble økonomisk støttet av DFG (Schlu 324/7-1).

undersøkelsen er gjennomført i henhold til guiden og bruk av forsøksdyr publisert av oss National Institute of Health (NIH publikasjonen nummer 85-23, revidert 1996). Generelt, mann wistar rotter alderen 3 til 4 måneder og med en gjennomsnittlig vekt på 250-350 g brukes for denne protokollen. En rotte hjertet er tilstrekkelig for 20 kultur retter (1 mL per fat, indre diameter: 35 mm) med en omtrentlig celle tetthet av 1,5 x 10 4 celler/1000 mm 2.
 1. forberedelse av M...

<ol>
	<li>Schl&#252;ter, K. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cardiomyocytes - Active Players in Cardiac Disease. , (2016).</li><li>Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+calcium+stable+adult+cardiac+myocytes.">Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).</li><li>Schl&#252;ter, K. -. D., Schreiber, D., Fabbro, D., McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+ventricular+cardiomyocytes:+isolation+and+culture.">Adult ventricular cardiomyocytes: isolation and culture.</a> Protein Tyrosine Kinases: From Inhibitors to Useful Drugs. 290, 305-314 (2005).</li><li>Eppenberger, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+analysis+of+the+regeneration+of+myofibrils+in+long-term+cultures+of+adult+cardiomyocytes+of+the+rat.">Immunocytochemical analysis of the regeneration of myofibrils in long-term cultures of adult cardiomyocytes of the rat.</a> Dev. Biol. 130 (1), 1-15 (1988).</li><li>Burrows, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cultivation+of+tissues+of+the+chick-embryo+outside+the+body.">The cultivation of tissues of the chick-embryo outside the body.</a> JAMA. 55 (24), 2057-2058 (1910).</li><li>Cavanaugh, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsation,+migration+and+division+in+dissociated+chick+embryo+heart+cells+in+vitro.">Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro.</a> J Exp Zool A Eco Genet Physiol. 128 (3), 573-589 (1955).</li><li>Muir, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+observation+on+the+cellular+structure+of+cardiac+muscle.">Further observation on the cellular structure of cardiac muscle.</a> J. Anat. 99, 27-46 (1965).</li><li>Powell, T., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+technique+for+the+isolation+and+purification+of+adult+cardiac+muscle+cells+having+respiratory+control+and+a+tolerance+to+calcium.">A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium.</a> Biochem. Biophys. Res. Com. 72 (1), 327-333 (1976).</li><li>Schwarzfeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+development+in+cell+culture+of+myocardial+cells+of+the+adult+rat.">Isolation and development in cell culture of myocardial cells of the adult rat.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 13 (6), 563-575 (1981).</li><li>Kubin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncostatin+M+is+a+major+mediator+of+cardiomyocyte+dedifferentiation+and+remodeling.">Oncostatin M is a major mediator of cardiomyocyte dedifferentiation and remodeling.</a> Cell Stem Cell. 9 (5), 420-432 (2011).</li><li>Nippert, F., Schreckenberg, R., Hess, A., Weber, M., Schl&#252;ter, K. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+Swiprosin-1+on+the+formation+of+pseudopodia-like+structures+and+&#946;-adrenoceptor+coupling+in+cultured+adult+rat+ventricular+cardiomyocytes.">The effects of Swiprosin-1 on the formation of pseudopodia-like structures and &#946;-adrenoceptor coupling in cultured adult rat ventricular cardiomyocytes.</a> PLoS ONE. 11 (12), e0167655 (2016).</li><li>Moses, R. L., Claycomb, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorganization+and+reestablishment+of+cardiac+muscle+cell+ultrastructure+in+cultured+adult+rat+ventricular+muscle+cells.">Disorganization and reestablishment of cardiac muscle cell ultrastructure in cultured adult rat ventricular muscle cells.</a> J. Ultrastruct. Res. 81 (3), 358-374 (1982).</li><li>Eppenberger-Eberhardt, M., Flamme, I., Kurer, V., Eppenberger, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reexpression+of+&#945;-smooth+muscle+actin+isoform+in+cultured+adult+rat+cardiomyocytes.">Reexpression of &#945;-smooth muscle actin isoform in cultured adult rat cardiomyocytes.</a> Dev. Biol. 139 (2), 269-278 (1990).</li><li>Fedak, P. W., Verma, S., Weisel, R. D., Skrtic, M., Li, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+remodeling+and+failure:+from+molecules+to+man+(Part+III).">Cardiac remodeling and failure: from molecules to man (Part III).</a> Cardiovasc. Pathol. 14 (3), 109-119 (2005).</li><li>Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+myocardial+regeneration.">Mechanisms of myocardial regeneration.</a> Trends Cardiovasc. Med. 21 (2), 52-58 (2011).</li><li>Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+remodeling-concepts+and+clinical+implications:+A+consensus+paper+from+an+international+forum+on+cardiac+remodeling.">Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an international forum on cardiac remodeling.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 35 (3), 569-582 (2000).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular biology of the cell. , (2015).</li><li>P&#246;ling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Janus+face+of+OSM-mediated+cardiomyocyte+dedifferentiation+during+cardiac+repair+and+disease.">The Janus face of OSM-mediated cardiomyocyte dedifferentiation during cardiac repair and disease.</a> Cell Cycle. 11 (3), 439-445 (2014).</li><li>Decker, M. L., Behnke-Barclay, M., Cook, M. G., Lesch, M., Decker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+evaluation+of+the+contractile+apparatus+in+primary+cultures+of+rabbit+cardiac+myocytes.">Morphometric evaluation of the contractile apparatus in primary cultures of rabbit cardiac myocytes.</a> Circ. Res. 69 (1), 86-94 (1991).</li></ol>

Virkemåten til voksen cardiomyocytes i vivo er påvirket av mange interaksjon med andre celler (f.eksneurons endotelceller, fibroblaster, inflammatoriske celler) og den elektriske syncytium som utgjør1. Derfor krever studerer stress tilpasning av voksen cardiomyocytes utelukkende isolasjon og dyrking av ARVC. De viktigste effektene av isolering og dyrke ARVC er: 1) koble dem fra ekstracellulær matrix og celle-celle kontakter; 2) koble dem fra kontraktile stimuli; 3) tvinge dem...

Voksen cardiomyocytes i vivo arbeid som en elektrisk syncytium basert på celle-celle kontakter mellom myocytter. I tillegg påvirkes de av tilstøtende celler som cardiac fibroblaster, endotelceller, nerveceller og inflammatoriske celler1. For å studere evne til cardiomyocytes å tilpasse organisasjonen intracellulær til endret opplastingsforhold, sett i løpet av hjerte-hypertrofi, som et første trinn fører til hjertesvikt, isolasjon og dyrking av voksen ventrikkel rotte cardiomyocytes (ARVC) er nødvendig2,3,4. Historisk ble cardiomyocytes først isolert fra embryonale chick hjerter5,6. Noen år senere, ble første isolering av terminalt differensiert cardiomyocytes beskrevet ved hjelp av kalsium uttømming7. Men disse voksen cardiomyocytes var ikke kalsium tolerant og kan derfor ikke brukes for funksjonell analyser. Til slutt, i 1976 en ny protokoll aktivert Powell og vri undersøke voksen ventrikulær cardiomyocytes under fysiologiske forhold8. Som et første skritt isolerte de voksen cardiomyocytes under lav kalsium konsentrasjon og deretter økt kalsium til fysiologiske konsentrasjoner i en trinnvis prosedyre. I dag, de fleste protokoller for isolasjon og dyrking av voksen cardiomyocytes arbeide med denne kalsium-protokollen og bruke collagenase på enzymatisk fordøyelsen av tett celle-celle kontakter1.
En vellykket dyrking er fosterets kalv serum (FCS) eller oncostatin M (OSM) nødvendig. ARVC utfører en de - og re - differentiation med omfattende strukturendringer inkludert sarcomere demontering og reformasjonen9,10,11,12. Denne prosessen er ledsaget av et nytt uttrykk av fetal-type gener som β-myosin tunge kjede (β-MHC), som kjent fra hypertrofi og en formasjon av pseudopodia-lignende strukturer, også kalt spre4,11, 13. videre swiprosin-1 (EFHD2), en nylig identifisert protein, spiller en viktig rolle under re differensiering av dyrket ARVC11. Resultatet ARVC i kultur forvandle omfattende, sammensatte celler, som spontant Vis sammentrekninger etter to til tre uker i kultur2,4,14.
Nyere funn har avdekket at cardiac re - og de differentiation som den forekommer under oppdrettsforholdene imiterer har sett i vivo under cardiac remodeling10,15. CARDIAC remodeling er en viktig prosess under hjerte sykdommer16. Som hjerte sykdommer er fortsatt den viktigste dødsårsaken i industrialiserte samfunn, en bedre forståelse av biologi voksen cardiomyocytes er viktig (som, 2015). Isolasjon og dyrking av ARVC kan bidra til å utvikle nye strategier og legemidler for behandling av hjerte sykdommer. Med dette manuskriptet tilbys en protokoll for isolasjon og dyrking av ARVC. Videre merkes kritiske deler av denne metoden under diskusjon.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Langendorff perfusion system</td>
			<td>inhouse construction</td>
			<td></td>
			<td>double-walled with a water 
			based heating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue chopper Mc Ilwain</td>
			<td>Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aortic Cannula, OD 1,8 mm</td>
			<td>inhouse construction</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abdominal shears</td>
			<td>Aeskulap</td>
			<td>BC772R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capsule forceps</td>
			<td>Eickemeyer</td>
			<td>171307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissor large</td>
			<td>Aeskulap</td>
			<td>BC562R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissor small</td>
			<td>Aeskulap</td>
			<td>BC163R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mash with Polyamid</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>4-1413</td>
			<td>mash size 200 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic disc</td>
			<td>Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Typ II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and cultivation of adult rat cardiomyocytes

I en intakt hjerte påvirke tilstøtende celler voksen cardiomyocytes. Med metoden for isolasjon og dyrking av voksen cardiomyocytes er en presis undersøkelse av virkemåten til disse cellene under spesifikke behandlinger og miljøer mulig. Dette manuskriptet presenterer en protokoll for vellykket isolasjon og dyrking av voksen rotte ventrikulær cardiomyocytes (ARVC).
Rotta er ofret av cervical forvridning under dyp anestesi. Deretter trekkes ut hjertet og aorta er avdekket. Deretter utføres perfusjon på Langendorff perfusjon systemet med kalsium uttømming og collagenase behandling. Etterpå blir ventrikkel vev hakket, re-sirkulerer, og filtrert, etterfulgt av tre sentrifugering trinn gradvis tillegg CaCl2 til fysiologiske kalsium konsentrasjon er nådd. ARVC er belagt celle kultur retter. Etter forfriskende celle kultur medium, kan ARVC dyrkes i opp til seks dager uten å endre serum inneholder kultur medium. Isolasjonen av ARVC er en kalsium følsom prosess. Små endringer i intracellulær kalsium konsentrasjon forårsake en nedgang i kvalitet og levedyktigheten til isolerte cellene.
Fersk isolert ARVC er rod formet. I de første dagene av dyrking mister stav-formet morfologi og form pseudopodia-lignende strukturer (spredning). Under denne morfologiske formasjonen ARVC først redusere deres kontraktile elementer etterfulgt av en reformasjon gjennom begrepsordbok stress fibrene og de novo sarcomerogenesis. Etter en uke dyrking, de fleste ARVC viser en utbredt opptreden med en tydelig synlig tvers striation. Denne prosessen er følsomme for intracellulær kalsium konsentrasjon, som behandling med ionomycin demper sprer seg. Viktige indikatorer i denne prosessen av de - og re - differentiation er β-myosin tunge kjede (β-MHC), oncostatin M (OSM) og swiprosin-1 (EFHD2). Nyere studier har antydet at cardiac re - og de differentiation oppstår under oppdrettsforholdene etterligner funksjoner sett i vivo under cardiac remodeling. Derfor spiller isolasjon og dyrking av ARVC en viktig rolle i å forstå biologi av cardiomyocytes.

Voksen cardiomyocytes i kultur: Figur 1 viser en oversikt over ferske isolert voksen cardiomyocytes 2t etter siste vask. Ca 75% av alle cardiomyocytes hadde en stav-formet morfologi. De resterende 25% viste et uvanlig utseende med en runde morfologi og ingen synlig intakt cellemembranen (figur 1). På slutten av dyrking (dag 6), opptil 15% av alle cardiomyocytes viste spredning, 10% forble i en runde morfologi ut...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

Her presenterer vi en protokoll for isolasjon og dyrking av voksen rotte ventrikulær cardiomyocytes (ARVC). Isolerte ARVC kan brukes for kort og lang sikt dyrking. Isolasjon og dyrking av ARVC kan spille en nøkkelrolle i utviklingen av nye behandlingsregimer for hjerte sykdommer.

Isolasjon og dyrking av voksen rotte Cardiomyocytes

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Isolasjon og Funksjonell karakterisering av menneskelig Ventrikulær Cardiomyocytes fra Fresh Kirurgiske Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

Isolering av Atrial Cardiomyocytes fra en rotte modell av Metabolsk syndrom-relaterte hjertesvikt med bevarte utstøting brøk

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of ...

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

Effektiv Sieving metode å isolere intakt Glomeruli fra voksen rotte nyre

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

Isolering av atrieflimmer myocytter fra voksen mus

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Murine hjerteinfarkt modell bruker permanent ligation av venstre fremre synkende koronar

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Ultralyd-utvidet primær voksen Fibroblast Isolation

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In Vitro vurdering av hjertefunksjon ved hjelp av skinned kardiomyocytter

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Isolation and Cultivation of Mandibular Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats

Isolasjon og dyrking av mandibulær benmarg Mesenchymale stamceller hos rotter

Here we present an efficient method for isolating and culturing mandibular bone marrow mesenchymal stem cells (mBMSCs) in vitro to rapidly obtain numerous ...

Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.

Sarcomere Forkortelse av Pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter ved hjelp av fluorescerende taggede sarcomere-proteiner.

Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) can be produced from both embryonic and induced pluripotent stem (ES/iPS) cells. These cells ...

Modifications of the Langendorff Method for Simultaneous Isolation of Atrial and Ventricular Myocytes from Adult Mice

Modifikasjoner av Langendorff-metoden for samtidig isolasjon av atrie- og ventrikulære myocytter fra voksne mus

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction ...