Name: isolation and cultivation of adult rat cardiomyocytes
Uploaded: 2017-10-19T15:00:00
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Os autores graças a Nadine Woitasky e Peter Volk para assistência técnica. Além disso, os autores graças a Sra. Claudia Lorenz (médico escritor, ACCEDIS) por sua ajuda na preparação do manuscrito. Este manuscrito foi apoiado financeiramente pelo DFG (Schlu 324/7-1).

a investigação é conduzida de acordo com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório publicado por nos National Institute of Health (NIH publicação n º 85-23, revista em 1996). Em geral, ratos wistar machos com 3 a 4 meses de idade e com um peso médio de 250-350 g são utilizados para este protocolo. Um coração de rato é suficiente para 20 pratos de cultura (1 mL por prato; diâmetro interno: 35 mm) com uma densidade celular aproximada de 1,5 x 10 4 células/1000 mm 2.
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O comportamento do adulto cardiomyocytes na vivo é influenciado por muitas interações com outras células (por exemplo, os neurônios, células endoteliais, fibroblastos, células inflamatórias) e o sincício elétrico que formam1. Portanto, estudar a adaptação de estresse de adultos cardiomyocytes exclusivamente requer o isolamento e cultivo da ARVC. Os principais efeitos de isolar e cultivar ARVC são: 1) desconectá-los de matriz extracelular e contatos do celular; 2) de...

Cardiomyocytes adulto na vivo funciona como um sincício elétrico baseado em contatos de celular entre myocytes. Além disso, eles são influenciados por células adjacentes como cardíacos fibroblastos, células endoteliais, neurônios e células inflamatórias1. Para estudar a capacidade dos cardiomyocytes para adaptar sua organização intracelular para alterou as condições de carga, como visto durante a hipertrofia cardíaca, que é um passo inicial levando a insuficiência cardíaca, o isolamento e cultivo de adulto rato ventricular cardiomyocytes (ARVC) é necessário2,3,4. Historicamente, cardiomyocytes primeiro foram isoladas de garota embrionárias corações5,6. Alguns anos mais tarde, o primeiro isolamento de cardiomyocytes terminalmente diferenciada foi descrito por meio de depleção de cálcio7. No entanto, esses adultos cardiomyocytes não eram tolerantes de cálcio e, portanto, não podiam ser utilizados para os ensaios funcionais. Finalmente, em 1976, um novo protocolo habilitado Powell e torcer para investigar adulto cardiomyocytes ventricular sob condições fisiológicas8. Como primeiro passo, isolaram cardiomyocytes adulto sob concentrações baixas de cálcio e cálcio posteriormente aumentado para concentrações fisiológicas em um processo gradual. Hoje, a maioria dos protocolos para isolamento e cultivo de adultos cardiomyocytes trabalharcom com este protocolo de cálcio e usam colagenase para a digestão enzimática da célula-célula densa contatos1.
Para um cultivo bem sucedido, é necessário soro fetal bezerro (FCS) ou oncostatin M (OSM). ARVC executar um de - e re - differentiation extensas alterações estruturais, incluindo o sarcômero desmontagem e reforma9,10,11,12. Este processo é acompanhado por uma re-expressão de genes fetais-tipo, como β-miosina de cadeia pesada (MHC-β), como conhecido de hipertrofia e uma formação de pseudópodos-como estruturas, também chamado de espalhamento4,11, 13. Além disso, swiprosin-1 (EFHD2), uma proteína recém identificada, desempenha um papel importante no processo de re-diferenciação de cultivada ARVC11. Como resultado, ARVC na cultura transformar-se em células generalizadas, polimórficas, que mostram espontaneamente contrações após duas a três semanas em cultura2,4,14.
Descobertas recentes têm revelado que cardíaca differentiation re e de como ocorre em condições de cultura imita possui visto na vivo durante cardíaca remodelação10,15. Remodelação cardíaca é um processo chave durante doenças cardíacas16. Como doenças cardíacas ainda são a principal causa de morte nas sociedades industrializadas, uma melhor compreensão da biologia da cardiomyocytes adulto é importante (quem; 2015). Isolamento e cultivo da ARVC podem ajudar a desenvolver novas estratégias e medicamentos para o tratamento de doenças cardíacas. Com este manuscrito, é fornecido um protocolo para o isolamento e cultivo da ARVC. Além disso, algumas partes críticas deste método são destacadas na seção de discussão.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Langendorff perfusion system</td>
			<td>inhouse construction</td>
			<td></td>
			<td>double-walled with a water 
			based heating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue chopper Mc Ilwain</td>
			<td>Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aortic Cannula, OD 1,8 mm</td>
			<td>inhouse construction</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abdominal shears</td>
			<td>Aeskulap</td>
			<td>BC772R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capsule forceps</td>
			<td>Eickemeyer</td>
			<td>171307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissor large</td>
			<td>Aeskulap</td>
			<td>BC562R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissor small</td>
			<td>Aeskulap</td>
			<td>BC163R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mash with Polyamid</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>4-1413</td>
			<td>mash size 200 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic disc</td>
			<td>Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Typ II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and cultivation of adult rat cardiomyocytes

Em um coração intacto, células adjacentes influenciam cardiomyocytes adulto. Com o método de isolamento e cultivo de adultos cardiomyocytes, uma investigação precisa do comportamento dessas células sob ambientes e tratamentos específicos é possível. Este manuscrito apresenta um protocolo para a bem sucedido isolamento e cultivo de rato adulto cardiomyocytes ventricular (ARVC).
O rato é sacrificado por deslocamento cervical sob anestesia profunda. Então, é extraído o coração e a aorta é descoberta. Posteriormente, a perfusão do sistema de perfusão de Langendorff com depleção de cálcio e tratamento de colagenase é executada. Depois, tecido ventricular Obtém picado recirculado e filtrado, seguido por três etapas de centrifugação com adição gradual de CaCl2 até que seja alcançada a concentração de cálcio fisiológica. ARVC são banhados em pratos de cultura de células. Após atualizar o meio de cultura celular, ARVC pode ser cultivada por até seis dias sem alterar o meio de cultura contendo soro. Isolamento da ARVC é um processo sensível de cálcio. Pequenas alterações da concentração de cálcio intracelular causar uma diminuição na qualidade e viabilidade das células isoladas.
Recentemente isolado ARVC são em forma de haste. Nos primeiros dias de cultivo, eles perdem os bacilares morfologia e forma pseudópodos estruturas (espalhar). Durante esta formação morfológica ARVC inicialmente degradar seus elementos contráteis, seguidos por uma reforma através de fibras de estresse de actina e sarcomerogenesis de novo . Após uma semana de cultivo, a maioria ARVC mostrar uma aparência generalizada com uma faixa transversal claramente detectável. Este processo é sensível à concentração de cálcio intracelular, como tratamento com ionomycin atenua a propagação. Marcadores chaves neste processo de - e re - differentiation são cadeia pesada de miosina-β (β-MHC), oncostatin M (OSM) e swiprosin-1 (EFHD2). Estudos recentes têm sugerido que cardíaca re e de differentiation ocorrendo em condições de cultura imita características visto na vivo durante a remodelação cardíaca. Portanto, isolamento e cultivo da ARVC desempenham um papel chave na compreensão da biologia dos cardiomyocytes.

Adulto cardiomyocytes na cultura: A Figura 1 mostra uma visão geral dos cardiomyocytes adultos recentemente isolado 2 h após a última lavagem. Aproximadamente 75% de todos os cardiomyocytes tinha uma morfologia de forma cilíndrica. Os restantes 25% mostrou uma aparência incomum com uma morfologia redonda e não detectável membrana celular intacta (Figura 1). No final do cultivo (dia 6), até 15% de todos os...

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Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento e cultivo de rato adulto cardiomyocytes ventricular (ARVC). ARVC isolado pode ser usado para o cultivo de curto e longo prazo. O isolamento e cultivo da ARVC podem desempenhar um papel chave no desenvolvimento de novos esquemas de tratamento para doenças cardíacas.

Isolamento e cultivo de rato adulto Cardiomyocytes

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Isolamento e caracterização funcional de Ventricular Humano cardiomiócitos a partir de amostras cirúrgicas frescos

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Medicina

Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

Isolamento dos Cardiomyocytes Atrial de um modelo do rato de metabólicas relacionadas com síndrome de insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of ...

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

Um método eficiente de crivagem para isolar intactos glomérulos do rim de rato adulto

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

Isolamento de miócitos atriais de camundongos adultos

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Modelo de infarto do miocárdio murino usando ligadura permanente da artéria coronária descendente anterior esquerda

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Isolação adulta preliminar ultra-som-aumentada do fibroblasto

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

Avaliação in vitro da função cardíaca usando cardiomócitos esfolados

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Isolation and Cultivation of Mandibular Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats

Isolamento e Cultivo de Células-Tronco Mesenquimais de Medula Óssea Mandibular em Ratos

Here we present an efficient method for isolating and culturing mandibular bone marrow mesenchymal stem cells (mBMSCs) in vitro to rapidly obtain numerous ...

Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.

Encurtamento sarcomere de Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes usando Proteínas Sarcomere marcadas por fluorescentes.

Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) can be produced from both embryonic and induced pluripotent stem (ES/iPS) cells. These cells ...

Modifications of the Langendorff Method for Simultaneous Isolation of Atrial and Ventricular Myocytes from Adult Mice

Modificações do Método Langendorff para Isolamento Simultâneo de Miócitos Atrial e Ventricular de Camundongos Adultos

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction ...