Name: contractility measurements of human uterine smooth muscle to aid drug development
Uploaded: 2018-01-26T14:00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Contractility Measurements of Human Uterine Smooth Muscle to Aid Drug Development at JoVE.com

Denne forskningen har blitt støttet av østerrikske Science Fund (FWF) gjennom prosjektet I3243 og europeiske Research Council (ERC) under EUs horisonten 2020 forskning og innovasjonsprogram (gi avtalen uten 714366). CWG har blitt støttet av en australsk Research Council (ARC) fremtid fellesskap (FT140100730) og MM en bue Discovery tidlig karriere forsker (DECRA) fellesskapet (DE150100784). SA støttes av et Harris-velvære tidlig fødsel sentrum forskningsstipend administrert av velvære for kvinner, UK.

Aktuelle institusjonelle, etisk gjennomgang styret og sikkerhet godkjenning for eksperimenter med menneskelig vev må på plass før du arbeider med noen menneskelig vev. Alt arbeidet beskrevet heri mottatt godkjenning fra den lokale forskning etikk (Liverpool øst, REC Ref 10/H1002/49) og institusjonelle gjennomgang styrene i forskning og utvikling avdeling, Liverpool kvinners sykehuset og Universitetet i Liverpool.
Merk: Alle biopsier beskrevet i denne protokollen ble innhentet fra kvinner under pre arbeidskraft valgfag CS levering på Liverpool Women's Hospital og hver kvinne ga skriftlig samtykke til å delta.
1. løsninger
<ol><li>Forberede endret Krebs fysiologisk saltløsning (PSS) med følgende sammensetning: 154 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 1.2 mM MgSO4, 7,8 mM glukose, 10.9 mM HEPES og 2.0 mM CaCl2. Merk: Volumet skal utføres bestemmes av antall vev bad i drift, flow rate av systemet (1 mL/min), og beregnet lengde av eksperimentet inkludert balanse og bleke.</li>
	<li>Justere pH 7,4 bruker 4 M NaOH.</li>
</ol>2. vev bad sette opp
<ol><li>Forvarm vev bad system reservoaret ~ 45 ° c med en resirkulerende vannbad satt på 55-60 ° C. Merk: Vann reservoaret i bunnen av apparatet varmes opp til ~ 45 ° C, som etter slik at varmen utveksling med PSS peristaltiske slangen gjennom, sikrer PSS i vev badekaret på 37 ° C. Noen justering sette temperaturer kan være nødvendig å sikre temperaturen av PSS i vev badekaret når 37 ° C. Dette vil variere avhengig av apparatet brukes og angi strømningshastigheter.</li>
	<li>Manuelt slå på annet nødvendig utstyr inkludert forsterker, datainnsamling og innspillingssystem og sug pumper.</li>
	<li>Plasser hver peristaltiske materen rør (en tube per bad) rundt rullene peristaltiske pumpe hodet. Sikker med beholde stopper og stramme komprimering cams og låse tastene rundt rør. Plasser de ledige endene på peristaltiske materen rør i en 1 L beholder av PSS og starte pumpen å tillate PSS for å kontinuerlig perfuse i bad vev.</li>
	<li>Sikre sugekraft pumper fungerer riktig og at nivået av løsning i badekaret er konstant slik at frekvensen av flyt i badekaret er lik frekvensen av fjerning. Nivået av PSS i vev badekaret kan justeres ved å manipulere dybden av inntaks rør i badekaret med den modeler leire.</li>
	<li>Kalibrere kraft transdusere ved å plassere en kjent vekt (tilsvarer 1 millinewton (mN, enhet force)) på svinger kroken og opptak nedbøyning gjenkjent av programvaren og oppkjøp. Merk: Verdier kan justeres i programvaren, slik at verdiene konverteres automatisk til mN benektende behovet for å utføre eventuelle ytterligere konverteringer under analyse. Kalibrering av kraft transdusere må utføres før vev montering.</li>
</ol>3. vev forberedelse og Disseksjon av strimler
<ol><li>Innhente biopsies av gravid menneskelig myometrium (1-2 cm3) i CS etter levering av baby og morkaken. Få (typisk) tykkhet biopsier der både perimetrium (ytre serosa laget av livmor) og decidua (innerste laget i livmoren) er til stede. Bruk bare myometrial vev (sentrale muskel lag). Se figur 1A-B.<ol>
<li>Fjern (viktig) decidua og noen tilhenger fosterets membraner (hvis tilgjengelig) som disse vev er kjent for å produsere stoffer som kan endre myometrial contractility. Merk: I kirurgi, prøver er plassert i Hanks balansert Salt løsning (HBSS) eller frisk PSS og lagret på 4 ° C. Ideelt bør vev brukes innen 12-16 timer kirurgi, men studier har vist ingen skade contractility etter 18 h av samlingen med lagring på 4 ° C51. Egnede kontroller må utføres for å bekrefte vev levedyktighet og funksjon etter langvarig lagring på 4 ° C. Prøvene her er tatt fra øvre kant av lavere livmor segmentet snitt området og ikke fra den øvre delen. De nedre og øvre segmentene av livmoren har vist kontrakt tilsvarende48, derfor anses lavere segmentet biopsier å være en god gjenspeiling av øvre segmentet myometrial aktivitet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forberede disseksjon området og nødvendige instrumenter inkludert: store disseksjon saks, små Vannas dissecting saks, to dissecting tang, disseksjon pinner og aluminium vev klipp, rundt en disseksjon mikroskop med både fast og zoom forstørrelse.</li>
	<li>Sted biopsi prøven på en klar silastic-baserte disseksjon rett (se Tabell for materiale) fylt med puss og nøye orientere biopsy slik at serosa og decidua kantene identifiseres figur 1B.</li>
	<li>Bruk pinner for å sikre biopsy til bunnen av parabolen. Sikre vevet forblir hydrert med PSS gjennom disseksjon prosessen.</li>
	<li>Manuelt slå på mikroskopet lyskilden og inspisere vevet under mikroskopet på 10 x forstørrelse til å identifisere områder av myometrium gratis fra arrvev, serosa, decidua og noen tilhenger fosterets membraner hvis den finnes.</li>
	<li>Utføre sløv disseksjon bruker store disseksjon saks til å skille to tilstøtende vev lag, avslører to fly eller ark av muskelen. Merk: Det er ofte lettere å finne en liten lomme mellom vev lag å begynne separasjon, men må være forsiktig å unngå små båter ved biopsi som de kan forveksles med "lommer".</li>
	<li>Sted dissekere pinnene på hvert hjørne av vev for å sikre den. Inspisere ark med muskel leter regioner muskler med fiber kjører parallelt. Merk: Regionen identifikasjon kan bli hjulpet av etter retning av små kapillærene perfusing gjennom vev. Mild trekke ytterst vev kan også bidra til å identifisere retning der fibrene reiser.</li>
	<li>Klippe bort strimler av vev ~ 2 mm bredt x 8 mm lang x 1 mm tykk langs den langsgående aksen innretta med retningen av muskelfibre med små disseksjon saks. Merk: Omsorg må tas bare holde vev av første klippekanten å unngå skader.</li>
	<li>Gjenta prosessen å dissekere ut antall nødvendige strimler for eksperimentet.</li>
	<li>Feste hver stripe i begge ender rett og sikre på maten, ta vare ikke å over strekningen vevet.</li>
	<li>Feste aluminium vev klipp i hver ende slik at vevet mellom dem er ~ 5 mm lange og nøye klippe bort alle overflødig vev (figur 1 c).</li>
	<li>Overføre til et rent fat fylt med puss klar for montering.</li>
</ol>4. montering vev i bad
<ol><li>Overføre strimler til eksperimentelle vev bad. Montere strimler horisontalt i stedet for loddrett (som tradisjonelle orgel bad) (figur 2B).</li>
	<li>Fest en ende av hver stripe av klippet til force svingeren, som måler vev sammentrekning, og den andre til en fast koble begge innenfor vev kammeret. Merk: Kapasiteten på vev badekaret er ~ 1 mL som er stor nok til å sikre strimler er fullstendig neddykket i badekaret.</li>
	<li>Kontroller strimler er på bunnen av hver krok i badekaret.</li>
	<li>Åpne innspillingen programvare ved å dobbeltklikke på ikonet programvare.</li>
	<li>Justere opptaket for hver kanal slik at den vises i vinduet kanal.</li>
	<li>Justere akseskala Y å lese mellom 0-10 V (tilsvarer 0-10 mN innlegget kalibrering) av rett klikker på Y-aksen, velge "skala", og endre minimum og maksimal verdiene 0 og 10, henholdsvis. Velg "OK". Gjenta for hver kanal innspilling.</li>
	<li>Trykk "record" i programvaren for å begynne liveopptak. Merk: Hvis strimler ikke er sikret til bunnen av hver krok, de kunne slippe under sammentrekning som vises som et "hakk" på opptaket. Sett spenningen endres og derfor sammentrekninger etter forsinkelse kan variere.</li>
	<li>Strekke vev i hvert bad ved manuelt å slå micromanipulators knyttet til hver svinger. Følg den oppadgående vev bevegelsen fra grunnlinjen på skjermen og fortsette å slå micromanipulators til den opprinnelige spenningen når 0.2 g (~ 2 mN). Merk: Vevet vil umiddelbart begynne å slappe (bemerket av en nedgang i planlagte spenning), vanligvis når en jevn spenning av mellom 0,5-1 mN. Denne definerte spenningen er optimalisert for vev strimler av denne størrelsen i vår eksperimentelle forhold. Hvis andre størrelse vev brukes, er det viktig at riktig lengde-spenning relasjon undersøkelser utføres for å optimalisere hvile styrken skal brukes.</li>
	<li>Tillate vev å equilibrate for ~ 2T til spontan riene oppstår. Merk: en liten høyde i planlagte spenning er vanligvis observert og er en god indikasjon på vev levedyktighet og at det vil være kontraktile.</li>
</ol>5. utfordrende vevet med 40 mM kalium (høy K+)
<ol><li>Hvis ingen spontan riene oppstår etter 2 timer med montering, utfordre strimler med en høyt kalium salt løsning der kalium er opphøyet til 40 mM ved isosmotic substitusjon av NaCl for KCl. For høy K+, legger du til følgende (i mM): 119,6 NaCl, 40 KCl, 1,2 MgSO4, 7,8 glukose, 10,9 HEPES og 2.0 CaCl2. Merk: I glatt muskel som myometrium forårsaker anvendelse av høy K+ sammentrekning av indirekte åpne spenning drives kalsium kanaler fører til maksimal tilstrømningen av Ca2 + inn i vev celler. Høy K+ kan derfor brukes som mål for å teste de generelle indeksen vev integriteten, samt oppnå et mål på maksimal vev respons.<ol>
<li>Sett mater røret for bad som inneholder stripen å bli utfordret i en glassflaske for laboratoriet som inneholder høy K+ i 1-2 min.</li>
		<li>Tilbake mater røret til av PSS.</li>
		<li>Der svar på høy K+ er oppnådd, kan du fortsette å overvåking strip en ytterligere 1t. Hvis der 's ingen kontraktile respons til høy K+ eller ingen spontan aktivitet elicited legge høy K+ respons, forkaste stripen. Merk: Eksperimentator må også være klar over død plass (tid tatt for å komme vev badet) mater slangen før vurdere svaret høy K+. Dette kan ta 2-3 minutter avhengig av flyt.</li>
		<li>For å sikre fullstendig utvasking i høy k+ fra bad og materen rør, som kan påvirke påfølgende manøvrer, vente til spontan sammentrekninger tilbake til pre høy K+ amplitude før du fortsetter videre med eksperimentet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. testing av kjente og romanen forbindelser i Myometrial sammentrekning
Merk: Eksperimenter for å teste effekten av romanen narkotika og reagenser på myometrial funksjonen kan utføres på spontan (figur 3A) eller agonist-stimulert sammentrekninger (figur 3B-C). For Agonistiske stimulert sammentrekninger, OT eller arginine vasopressin (VP) legges til PSS for å gi en konsentrasjon på 0,5 nM og brukes i hele eksperimentet (figur 3B-C). Konsentrasjonen av OT er optimalisert for denne analysen som gir sammentrekninger som er phasic i natur40,52. Konsentrasjoner av agonister større enn dette kan føre til langvarige, vedvarende (tonic) sammentrekninger (se Ref41,44 eksempler) under effekten av ulike agenter er vanskelig å vurdere og eksperimentelle tidsramme må være sterkt utvidet til økt varighet personlige sammentrekninger og reduksjon i frekvensen. I denne eksempel eksperimentet, OT eller VP legges til stimulere sammentrekninger så at antagonisme av kjente OTR og V1aR antagonister, atosiban og SR49059, eller ved våre roman sammensatt [D-Arg8]-inotocin ([D-Arg8] INT), kan vurderes.
<ol><li>Forberede konsentrasjoner av test compound(s) i PSS (med eller uten 0,5 nM OT/VP) utvannet på minst 1/1000 fortynning, en rekke konsentrasjoner er inkludert som de som ikke elicit svar til konsentrasjoner som overskrider maksimale svar.</li>
	<li>Forberede et tilsvarende sett med fortynninger involverer like volum av kjøretøy (f.eks, dimethyl sulfoxide, acetonitrile eller destillert vann). Merk: Det er ofte enklest å forberede den høyeste konsentrasjonen, dvs, 10-6 M (fra et lager av 10-3 M) og deretter utføre føljetong fortynninger langs en logaritmisk skala (f.eks10-6-10-10 M). Volumet være forberedt avhenger på tidspunktet for søknaden, flow rate på det apparater, og antall strimler undersøkes, f.eksfor en 25 min anvendelse av reagens og en strømningshastighet på 1 mL/min, minst 25 mL av hver konsentrasjon per vev bad kreves Ed.</li>
	<li>Bruke første konsentrasjonen av sammensatte til vev ved å plassere mater slangen for bad vev i en glassflaske for laboratoriet som inneholder reagensen i ønsket konsentrasjonen. Merk: Dette bør gjøres når en jevn plan av spontane eller OT/VP-stimulert sammentrekninger er oppnådd.</li>
	<li>Bruke tilsvarende redskap kontroll løsningen på samme måte til andre bad.</li>
	<li>Registrere tidspunktet for søknaden (dvs.når materen slangen ble endret).</li>
	<li>Gjenta prosessen for hver konsentrasjon av sekvensielt plassere mater slangen i laboratoriet glassflaske med neste konsentrasjonen i serien og gjenta til alle konsentrasjoner er brukt. Anvendelsen av hver konsentrasjon kan være mellom 15 og 30 min, men bør være konsekvent for hver konsentrasjon brukt og mellom eksperimenter. Omfatter OT eller VP-stimulert sammentrekninger pleier å kreve lengre program periodene (f.eks, 25 min) til kontoen for reduksjon i sammentrekning frekvens observert under stimulering. Foreløpig eksperimenter for å bestemme optimale programmet tiden skal utføres på forhånd med noen nye reagensen testes.</li>
	<li>Tilbake mater røret til PSS (med eller uten OT/VP) bleke.</li>
	<li>Velg "stopp" for å avslutte live opptak. Umiddelbart lagre dataene i en passende mappe og eksportere en versjon som en ".mat" fil.</li>
</ol>7. dataanalyse
Merk: Data-fangst og analyse kan utføres av en kommersielt tilgjengelig data oppkjøpet programvarepakker. Se Tabellen for materiale for detaljer om programvaren som brukes i denne protokollen. For en nøyaktig vurdering av kontraktile aktivitet, parameterne for sammentrekninger skal måles inkluderer: i) amplituden til sammentrekning, ii) frekvens kontraksjon, iii) varigheten av sammentrekning og iv) betyr kraft integrert (Figur 4). Betyr kraft integrert tilsvarende området under kurven sammentrekning og er derfor en indeks for det totale arbeidet gjort av vev stripen i gangen. Noen eller alle parameterne kan analyseres. Som et minimum anbefales det at mener integrert makt og amplituden av sammentrekning er analysert53. Eksperimenter beskrevet her målt vi endringer i amplituden av sammentrekning og området under kurven.
<ol><li>Importerer the.mat filen til analyseprogramvare.</li>
	<li>Justere kolonnen svarer til X-aksen gjenspeiler eksperimentelle tiden, tar hensyn til intervall samplingfrekvens. Eksperimenter registreres vanligvis ved 10 Hz tilsvarer 10 prøver/s eller 600 prøver/min.</li>
	<li>Tegne inn dataene som en X-Y koordinere diagrammet bruker "Plot | Linje"-funksjonen.</li>
	<li>Null grunnlinje sammentrekning ved hjelp av funksjonen "oversette loddrett" på programvare.</li>
	<li>Velg en passende kontrollperioden. Merk: Dette er tidsperioden forut for anvendelse av første konsentrasjonen av regent men lik varigheten for reagens (figur 4A). For eksempel, hvis bruk av stoffet X for 25 min, bruk 25 min foran den første anvendelsen av stoffet X som kontrollen.</li>
	<li>Les av Y-aksen, registrere amplituden (styrke) av sammentrekning på maks toppen av hver sammentrekning forekommer i tidsrammen som er valgt, og beregne en middelverdien.</li>
	<li>Måler varigheten av sammentrekning 50% av denne maksimal topp ved lesing av X-aksen på starten og slutten av hver sammentrekning og registrere en middelverdien.</li>
	<li>Telle antall sammentrekninger forekommer i tidsrammen generere en verdi for frekvens.</li>
	<li>Bruk funksjonen "integrering" beregne AUC (i vilkårlig enheter, a.u.) for perioden med valgte. Merk: For å registrere AUC nøyaktig, er det viktig at grunnlinje riene settes til null på Y-aksen.</li>
	<li>Sekvensielt gå gjennom hver av konsentrasjonen og registrere ulike parametere av sammentrekning.</li>
	<li>Angi kontrolldataene som 100% og uttrykke verdiene innhentet under hver konsentrasjon av reagens som en prosent av dette kontroll dvs, stimulering bør inneholde > 100% mens avslapning skal < 100%. Merk: Normalisere dataene på denne måten skal tillate brukeren å sammenligne resultatene på tvers av strimler og farmakologiske behandlinger.</li>
	<li>Gjenta for hvert eksperiment og overføre dataene til en grafisk pakke.</li>
</ol>

Forfatterne ikke avsløre.

Mens de fleste narkotika utvikling er ment for behandling av menneskelige lidelser, er primært mest grunnleggende forskning utført i dyr vev. Her beskriver vi metoder for å undersøke ex vivo sammentrekninger av menneskelig myometrium fra kirurgi som kan brukes til en rekke viktige spørsmål knyttet til livmor fysiologi og patologi, samt å validere funksjonelle svar til kjent og romanen farmakologiske agenter å hjelpe narkotika utvikling. Spesielt markere vi bruk av denne analysen å undersøke antagonistiske respons av en kjent OTR og V1aR konkurransedyktig antagonist, atosiban på OT-indusert gravid myometrial sammentrekninger, samt å finne svaret og reseptor selektivitet av en nyutviklet selektiv V1aR antagonist, [D-Arg8] INT. Vi viser at viktige farmakokinetiske parametere som EF50 og IC50 kan beregnes som justeres med datatypen cellebasert farmakologi.
Bruke flere strimler samtidig tillater direkte sammenligning av flere agent effekter, konkurranse eksperimenter med antagonister og riktig tid og bilen kontroller. Som strimler er ofte forberedt i grupper på 2, 4 eller 8, gir denne teknikken moderat gjennomstrømning, aktivere testing av 2-4 forbindelser i 6-8 (kumulative) konsentrasjoner (per biopsi). Denne metoden gir også sanntidsdata slik at effektene kan vurderes raskt og protokoller kan justeres. Dessuten, denne teknikken kan brukes til å teste alle sammensatte interesse og har vært brukt med hell av en rekke forskningsgrupper fokusert på myometrial fysiologi og i stoffet funnet. Foruten analysere ren forbindelser som beskrevet i dette dokumentet, livmor contractility modellen har også vært og kan brukes med hell til skjermen for romanen uterotonic forbindelser fra blandinger, som urtepreparater tradisjonell medisin7 , 55 , 56.
Selv om denne modellen er teknisk robust og viser god reproduserbarhet, den har noen begrensninger: disseksjon kan være vanskelig for dem ukjent med vev eller bruk disseksjon, derav nye brukere vil kreve litt tid å optimalisere vev forberedelse og protokoller. Det bør også bemerkes at menneskelige myometrium varierer betraktelig i utseende til andre modeller som rotte og mus. De fleste gnager uteri består av to rør-liknende livmor horn, hver med en eggstokk i den ene enden og sluttet på livmorhalsen. Hver horn har klart definert langsgående og sirkulære muskelgrupper lag, som lett kan deles ved disseksjon mens hvilke ulike fiber i menneskelig myometrium ofte henger sammen danner et "nett". I tillegg er sammentrekning profiler av menneskelig myometrium veldig forskjellige gnagere. Mest spesielt, er sammentrekninger i menneskelig myometrium sjeldnere men lengre varighet. Eksperimentell tidsrammer for å arbeide med menneskelig myometrium er derfor ofte mye lengre enn gnager modeller. Forskjeller i reseptor uttrykk mellom artene kan også bidra til ganske store forskjeller i svar på agonister og dette skal bæres i bakhodet hvis ekstrapolere resultater på tvers av arter.
Det er også mange tiltak som må å maksimere produksjonen fra dette systemet. Kritisk trinnene omfatter bevaring av vev levedyktighet som omsorg ved håndtering av vev for å unngå unødvendig skade under disseksjon eller ved montering. Det kreves en dyktig øye å dissekere fine strimler av livmor muskler, retningen til muskelfibre er i lengderetningen og etter flyet av vev, så vel som unngå arr vev, decidua og små båter. For å hjelpe retning formål når prøven er i laboratoriet, er det mulig å legge til en kode (for eksempel små kirurgiske maske) ved samlingen til en side av biopsy å avgrense serosal kanten fra decidual kanten.
Vev bør holdes på en jevn 36-37 ° C i løpet av eksperimentering funksjon er underlagt temperatursvingninger. Dette kan oppnås med en robust klimaanlegg i laboratoriet. Konstant perfusjon av varmet PSS sikrer temperaturen vedlikeholdes og skylle ut avfallsstoffer fra sammentrekning. Temperaturen i orgel bad kan endres ved å endre infusjonshastigheten eller justere bad temperaturen direkte. Små bad størrelsen sammenlignet med tradisjonelle 5-50 mL bad sikrer en relativt rask omsetning av PSS og bleke reagenser. Miniatyriserte orgel badet reduserer som beskrevet her, også volumet av PSS og reagenser rundt nødvendig, således minimere kostnader og spare dyrebar, nyutviklet kjemikalier. I tillegg liten bad størrelsen og bruker en HEPES-baserte buffer, krever dette systemet ikke oksygenering f.eksav bobler PSS med carbogen. Standardisering av spenning på strimler er også viktig. Strimler av denne størrelsen (5 mm x 2 x 1 mm), bør dette være ca 2 mN (tilsvarer ~0.2 g). Alternative metoder omfatter anvendelse av en høyt kalium løsning å indusere maksimal sammentrekning og strekker seg til halvparten av denne maksimal sammentrekning. Det må bemerkes imidlertid at spenning anvendes i vivo kan variere.
Hovedutfordringene inkluderer å vev fra mennesker, men selv om beskatte, menneskelig vev tydelig representerer de fysiologisk relevante (og givende) modell for å studere livmor-kontraksjon i menneskelig sykdom og narkotika funnet. Isolert vevet strimler imidlertid ikke nødvendigvis likestille til vev i vivo som de er fritatt for eksempel av hormonelle og nervøs inngang som, selv om ikke avgjørende for sammentrekning, vil modulerer sammentrekninger i vivo. Denne analysen men gir mulighet til å analysere myometrial sammentrekninger på en kontrollert måte, atskilt fra slik påvirkning. Det kan også effekten av faktorer som hormonelle kontroll av sammentrekning (f.eksvia OT, VP, prostaglandiner, etc.) undersøkes, gir ledetråder til regulering av myometrial-funksjonen. Som vev er Hentet fra forskjellige kvinner, er det naturlig noe variasjon i spontan kontraktile profiler mellom eksemplarer. Derfor er det ofte nødvendig å utføre eksperimenter på mange (~ n = 10) å minimere variasjonen i noen datasett53. Dette er det viktigste når man sammenligner kontraktile aktivitet mellom ulike pasienten grupper. Normalisere svar agonister og motstanderne for å kontrollere aktivitet (dvs.uttrykke som en prosentandel av kontroll aktivitet eller høy K+) reduserer noen av denne varianten. Redusere mellom stripe variasjon, kan i tillegg dataene normaliseres for å fjerne kryss seksjon området ved å måle deres lengde og vekt innlegget eksperimentering41. Dette er spesielt nyttig når du sammenligner sammentrekning mønstre mellom ulike pasienten grupper.
Begrensninger av denne teknikken også tilgang til friskt vev som krever gode arbeidsforbindelser med Sykehusets personale, spesielt teater personalet og de som er involvert i godkjenningsprosessen. Etiske tillatelser fra det lokale forskning etikk og Institute eller sykehus gjennomgang styret må også være på plass. Samling av menneskelig myometrium er mest sannsynlig utføres under CS levering, når giveren gjennomgår kirurgi. Biopsy er tatt fra samme livmor snitt nettsted laget for levere babyen og derfor pasienten trenger ikke å gjennomgå noen ytterligere flere prosedyrer. Teater ansatte og kirurgen utfører biopsy må gjøres oppmerksom på påfølgende bruk av vev, og at de ikke skal plasseres i etappe, den stabiliserende løsninger slik som for sender til en patologi avdeling. Lenge eksperimentelle tidsrammen er en annen betraktning. Eksperimenter med menneskelig vev tar mange timer (vanligvis > 6 h) (i motsetning til 2-3 h for et lignende eksperiment i rotte eller mus livmor), på grunn av lavere frekvensen av sammentrekning og 2-3 h forsinkelse mellom vev montering og etablering av spontane sammentrekninger. Men som vi har vist, menneskelig vev sammentrekninger er robust, og når etablert kan kontrakt i mange timer uten betydelige tretthet40.
Dette systemet gjør også andre utfordringer i vivo arbeid overvinnes inkludert muligheten til å teste farmasøytiske reagenser på gravid vev. Denne teknikken kan være lett ekstrapoleres til andre arter inkludert musen der resultatene kan bekreftes før du fortsetter videre i hele dyrestudier. Kontrollert endringer i temperatur, sammensetning av superfusate (PSS) og pH kan gjøres enkelt å etterligne ulike scenarier i vivo og analysere effekten av disse endringene på sammensatte atferd. De grunnleggende prinsippene for måling isometrisk spenning i myometrial strimler kan også utvides til måle samtidige endringer i intracellulær kalsium konsentrasjon eller pH ved bruk av fluorescerende Ca eller pH (H+) indikatorer og utstyr for å oppdage og registrere fluorescens57,58,59,60.
Total, det menneskelige myometrium representerer en robust og fysiologisk relevante modell karakterisere og validere romanen terapeutiske forbindelser i stoffet funnet-både ren forbindelser og blandinger. Vi har gitt eksempler på bruk i stoffet funnet forhold til OT/VP systemet og fokusert på OTR og V1enR antagonister å vise hvordan denne modellen kan brukes til å fastslå sammensatte effekt og styrken på definerte mål og validere ligand selektivitet. Men skal det bæres i bakhodet at denne teknikken kan brukes til å studere noe mål av interesse eller sti fører til myometrial sammentrekning (eller avslapning), samt å hjelpe narkotika oppdagelsen av nye mål og stier, og fremme vår forståelse av myometrial fysiologi og patofysiologi.

Målet med medisiner er roman, potent, og svært selektive ligander som genererer et terapeutisk svar ved å hemme mobilnettet signalveier. Dette krever en passende analysen systemet i å teste bly forbindelser med pålitelig, solid og relevante resultater1. Farmakologiske teknikker som ligand-reseptor bindende og funksjonelle analyser ansette ofte heterologous celle-baserte systemer, utviklet til overexpress reseptorer som ellers ikke ville være tilstede2. Mens disse teknikkene gi verdifull innsikt for reseptor farmakologi og tidlig narkotika utvikling, kan dataene innhentet ikke gjenspeile et sant i vivo scenario. Det er derfor viktig at farmakologiske data fra cellen-basert analyser også valideres i fysiologisk relevante modeller.
Livmor glatt muskel (myometrium) utgjør muskel laget av livmoren som er ansvarlig for sammentrekninger under arbeid som utslette dilate livmorhalsen og leverer fosteret3. Sammentrekning av myometrium er spontan; det krever ikke hormonelle eller nervøs innspill til kontrakt4. Sammentrekninger er forårsaket av spontan depolarization i cellemembranen myometrial som fører til åpningen av spenning-opererte Ca2 +-kanaler (L-Type kanaler) og tilstrømningen av Ca2 + i cellen5. Kalsium komplekser med calmodulin og aktiverer myosin lys kjeden kinase som igjen phosphorylates myosin muliggjør kryss broen syklus formasjon med utgangen og sammentrekning. Avslapning er vanligvis formidlet av de fosforylering myosin av myosin fosfatase og en reduksjon i konsentrasjonen av Ca2 + via sin ekstrudering fra cellen og/eller fått inn sarcoplasmic retikulum (SR)5,6 ,7.
Flere metoder har blitt utviklet for å studere myometrial funksjon og dysfunksjon, i vivo interne og eksterne tocography og intrauterine press katetre, til generasjon av transformert eller udødeliggjort celler myometrial opprinnelse8 ,9,10,11,12. Mens celle kultur systemer kan oppdage om et stoff som kan fungere på cellenivå, kan strimler av vev i orgel bad brukes som verktøy til å måle funksjonelle svar av hele vev å farmakologiske reagenser. Tradisjonelle orgel badekaret er vanligvis et stort oppvarmet glass kammer som kan holde mellom 5 og 50 mL av fysiologiske saline (PSS). Strimler i disse store kamre krever vanligvis lufting med oksygen og store mengder PSS. Strimler av vev er dissekert og suspendert i bading kammeret og knyttet til en force svinger som måler endringer i spenning, som under en sammentrekning. Strimler av myometrium fra både mennesker og dyr inkludert marsvin13, musen14, rotte15, kanin16og andre17,18, har vært brukt av en rekke forskningsgrupper undersøke mange spørsmål knyttet til myometrial fysiologi og patologi, inklusiv premature og dysfunksjonelle arbeide. For eksempel myometrial strimler har blitt brukt til å identifisere faktorene som regulerer og endre myogenic aktivitet19,20,21, bestemme organelle funksjon som SR-22, samt undersøker modulatorer av ion kanaler23,24,25,26, pumper og vekslere27 for å finne sin rolle i myometrial fysiologi.
Denne ex vivo teknikken tillater for vurdering av vev sammentrekning ytelse og den direkte effekten av forskjellige agenter på parametrene i sammentrekning skal måles inkludert, sammentrekning kraft (styrke), hyppighet og varighet, samt integrering av disse verdiene, generere et stikkordregister for det totale arbeidet gjort (mener integrert makt eller området under kurven, HiA). Som isolert vev stripe utarbeidelse utgjør en modell av mer enn én celle type, kan fysiologiske svaret av hele vev måles. Orgel badekaret og isolert vev stripen er derfor nyttig verktøy i å gi broen mellom celle kultur arbeid og hele dyr / ivivo . Derfor, i feltet i stoffet funnet, effekten av romanen agenter i deres eksitatoriske (dvs., stimulerende) eller hemmende (dvs., avslapning) potensielle i vivo kan bli mer nøye vurdert. Denne teknikken ble brukt i utviklingen av oxytocin- og V1a-reseptor (OTR og V1aR) antagonist atosiban som en tocolytic agent hemmer premature arbeidskraft sammentrekninger og forsinke tidlig fødsel. In vitro testing av atosiban på myometrial strimler funnet antagonist kunne redusere oksytosin (OT)-indusert sammentrekninger28,29,30. Viktigere disse studiene hjalp for å validere translasjonsforskning verdien av atosiban og generert proof-of-concept dataene nødvendig for å ta den frem til kliniske studier31,32,33,34 . Atosiban er nå mye brukt som legemiddel forsinke arbeid i Europa. Lignende proof-of-concept studier ble utført for oksytosin analoge carbetocin å vise sitt terapeutiske potensial i å forebygge post-partum blødning35,36,37. Andre bly forbindelser er under utvikling med denne analysen inkluderer retosiban (GSK221149A)38 og nolasiban (data upublisert). Disse metodene har også blitt brukt med hell å sammenligne mellom pasientorganisasjoner39,40,41,42,43,44, 45,46,47 og undersøke for intra-arter forskjeller.
Her beskriver vi bruk isolert ex vivo vev strimler fra gravid menneskelige myometrium i små (1 mL) skreddersydd orgel bad å illustrere hvordan denne metoden kan brukes til å utfylle og validere farmakologiske data fra cellen-basert analyser . Biopsier Hentet stort sett fra kvinner som gjennomgår pre Ap. valgfag keisersnitt (CS) levering som de planlagte kirurgi og dermed er lettere å planlegge biopsi samling, enkel tilgang til myometrium, og vev ikke ville ha vært utsatt for noen uterotonic stoffer eller lempelse før kirurgi. Imidlertid kan biopsies også fås fra kvinner under planlagte (beredskap) CS levering i arbeid gir er tilstrekkelig tid til fullt samtykke pasienten. De fleste biopsier hentes under operasjonen fra lavere livmor segmentet på stedet av kirurgiske snitt, men det er også mulig å få prøver fra øvre segmentet48,49. I noen tilfeller etter vaginal fødsel, har slag biopsier fra placental sengen også blitt innhentet50. Men dette er ikke de fleste konvensjonelle ruten og mengden myometrial vev Hentet er liten. Ikke-gravide myometrium kan fås fra pre- eller stolpe-menopausal kvinner gjennomgår hysterektomi godartet gynekologisk vilkår. En tykkhet biopsi er samplet etter patologi undersøkelse, fra lavere corpus fra livmorhalsen, og myometrium er tatt fra midten av livmor veggen unngå serosal og endometrial overflater.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Origin software</td>
			<td>Origin Lab</td>
			<td></td>
			<td>2015 version</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labscribe Software</td>
			<td>WPI</td>
			<td></td>
			<td>Formally Datatrax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism graphical software</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td>PRISM 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabTrax 4-Channel Data Acquisition</td>
			<td>WPI</td>
			<td>LAB-TRAX-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transbridge Transducer Amplifier</td>
			<td>WPI</td>
			<td>SYS-TBM4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Force-displacement Transducer</td>
			<td>WPI</td>
			<td>FORT10g</td>
			<td>10 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC to BNC Cable</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Clamp stand</td>
			<td>WPI</td>
			<td>M10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrometer</td>
			<td>Reconditioned from microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>MINIPULS3</td>
			<td>R4 Standard pump head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction pumps</td>
			<td>Various</td>
			<td>AP2 air pump</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulating Water bath</td>
			<td>Grant Instruments</td>
			<td>TC120</td>
			<td>5L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perspex Tissue Bath</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water reservoir container</td>
			<td>the reallyusefulbox</td>
			<td></td>
			<td>7L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Hooks (fixed)</td>
			<td>Hand made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic tubing</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F117948</td>
			<td>PVC 2.79 mm internal diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>various diameters</td>
			<td>R-3603</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium clips</td>
			<td>Laser services, USA</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Zoom binocular microscope</td>
			<td>WPI</td>
			<td>PZMIV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Fiber-optic Light Source</td>
			<td>WPI</td>
			<td>PHOTONIC PL 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Dishes</td>
			<td>Handmade with Sylgard</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard Silicone Elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td>Sylgard 170 Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>50086</td>
			<td>8.5 cm, straight edge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>15914</td>
			<td>10 cm, straight edge (serrated)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14393</td>
			<td>10 cm, straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting pins</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>Z192341</td>
			<td>B-D precision guide syringe needle 30G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H9269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiological Salt Solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>various</td>
			<td>PSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxytocin acetate salt</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>O6379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Arg8]-vasopressin acetate salt</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>V9879</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contractility measurements of human uterine smooth muscle to aid drug development

Funn og karakterisering av romanen farmasøytiske forbindelser eller biokjemiske sonder bruker robust og fysiologisk relevante analysen systemer. Vi beskriver metoder for å måle ex vivo myometrium contractility. Denne analysen kan brukes til å undersøke faktorer og molekyler involvert i modulering i myometrial sammentrekning og bestemme deres eksitatoriske eller hemmende handlinger, og dermed deres terapeutiske potensielle i vivo. Biopsier hentes fra kvinner under keisersnitt levering med samtykke. Fine strimler av myometrium er dissekert, klippet og knyttet til en force svinger i 1 mL orgel bad superfused med fysiologisk saltløsning på 37 ° C. Strimler utvikle spontan sammentrekninger innen 2-3 timer under Angi spenning og forbli stabil i mange timer (> 6 h). Strimler kan også stimulere kontrakt som av endogene hormoner, oxytocin og vasopressin, som forårsake konsentrasjon-avhengige modulering av sammentrekning frekvens, kraft og varighet, mer ligner sammentrekninger i arbeid. Dermed kan effekten av kjente og romanen narkotika kundeemner testes på spontan og agonist-indusert sammentrekninger.
Denne protokollen detaljer spesielt hvordan denne analysen kan brukes til å bestemme styrken på kjent og romanen agenter ved å måle deres effekter på ulike parametere av menneskelig myometrial sammentrekning. Vi bruker oxytocin- og V1a reseptor antagonister, atosiban og SR49059 som eksempler på kjente forbindelser som hemmer oxytocin og vasopressin-indusert sammentrekninger, og viser hvordan denne metoden kan brukes til å utfylle og validere farmakologiske data fra cellen-basert analyser å hjelpe narkotika utvikling. Effekten av romanen agonister sammenlignet oxytocin og vasopressin kan også være preget. Mens vi bruker eksempel på oksytosin / vasopressin systemet, denne metoden kan også brukes til å studere andre reseptorer og ionekanaler som spiller en rolle i livmor Sammentrekningen og avslappingen å fremme forståelsen av menneskelige livmor fysiologi og patofysiologi.

Bruker denne modellen, kan respons på ulike agonister og antagonister av sammentrekning og romanen agenter kjente eller ukjente funksjonen undersøkes og kvantifisert. Farmakologiske standardparametere som EF50 og IC50 verdiene kan beregnes når reagenser brukes i en rekke konsentrasjoner, f.eks, 10-5– 10-9 M og lagt i økende konsentrasjoner langs en logaritmisk skala.
Oksytosin reseptor Antagonist konsentrasjon svar eksperimenter I dette eksperimentet, sammenkoblede strimler av menneskelig myometrium var kuttet som beskrevet ovenfor og vist i figur 1, montert i vev bad avbildet i figur 2, og kunne equilibrate for å produsere stabil sammentrekninger av lik amplituden og frekvens. Strimler ble deretter utsatt for den endogene OTR Agonistiske, OT (0,5 nM) å stimulere sammentrekninger. Etter en periode med stabil aktivitet under OT (vanligvis 45 min), ble atosiban brukt på en stripe i økende konsentrasjoner langs en logaritmisk skala (10-9– 10-6 M). Den andre stripen var alene i OT som tid-kontroll. Et eksempel på respons på atosiban kan sees i figur 5A. Tar riene forut for første konsentrasjonen av atosiban som kontroll (100%), ble amplitude og AUC for hver konsentrasjon brukt beregnet som vist i Figur 4. For tiden-kontroll eksperimenter, ble tid-tilsvarende eksperimentelle manøvrer målt. Dataene ble deretter plottet og kurver utstyrt funksjonen ikke-lineær regresjon i en grafisk programvarepakke (figur 5B-C). Når det gjelder beregning hemmende effekt, beregnet den relative styrken på atosiban ved å måle IC50 som konsentrasjon forårsaker halv maksimal (50%) hemmende svaret. Det samme kan gjøres for agonister eller stimulators kontraksjon. I dette tilfellet beregnes styrken på sammensatt fra EF50 (konsentrasjonen forårsaker halv maksimal stimulerende svar).
Undersøke svaret for romanen forbindelser og teste deres reseptor selektivitet Vi brukte denne fysiologisk relevante modellen av ex vivo menneskelige myometrial sammentrekninger for å se antagonistiske et nylig syntetisk stoff, [D-Arg8]-inotocin ([D-Arg8] INT) på sammentrekninger stimulert med enten innfødt V1a R Agonistiske, VP eller den opprinnelige OTR Agonistiske, OT. Vi brukte denne analysen til å validere reseptor selektivitet av [D-Arg8] heltall, som hadde vært tidligere bestemt av farmakologiske cellebasert metoder skal opptrer på V1aR men ikke OTR54.
I dette eksperimentet, ble menneskelige myometrial strimler utsatt for 0,5 nM VP eller 0,5 nM OT rundt 1t å stimulere sammentrekninger som vist i Figur 3, før du legger vår roman sammensatt [D-Arg8] heltall i økende konsentrasjoner (figur 6A og figur 6 C). Dette ble deretter sammenlignet kommersielt tilgjengelig, kjent V1aR antagonist, SR49059 (figur 6B). Figur 6A illustrerer konsentrasjon avhengige nedgang i VP-stimulert menneskelige myometrial sammentrekninger med økende konsentrasjoner av [D-Arg8] INT. Dataene for amplituden av sammentrekning og AUC for hver konsentrasjon oppsummeres i figur 6Aii-iii. Effekten er lik som vises for økende konsentrasjoner av den kjente V1aR inhibitor, SR49059, vist i figur 6Bi-iii. Selektivitet av [D-Arg8] heltall mot V1aR men ikke mot OTR er demonstrert ved at [D-Arg8] heltall ikke ikke redusere menneskelig myometrial sammentrekninger som har blitt stimulert med OT (figur 6C) som amplitude og AUC stabil (figur 6Cii-iii).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56639/56639fig1.jpg"> Figur 1: Human myometrial biopsi disseksjon. (A) A diagram av menneskelig livmoren viser tre vev som utgjør livmor veggen. Det innerste laget er endometrium (decidua i svangerskapet, røde pilen), det midterste laget er myometrium (muskuløs lag, svart pil) som genererer sammentrekninger, og det ytterste laget er perimetrium (eller serosal membran, blå pil) hvilke skjemaer en beskyttende lag rundt livmor. Regionen rundt for biopsi prøvetaking er avbildet av svarte rektangelet. Et eksempel biopsi fra en gravid kvinne tatt under keisersnitt vises i (B) med den decidua og myometrial lag uthevede (serosa ikke synlig). Det er viktig at de ulike vev lag identifiseres slik at strimler av myometrium er riktig dissekert for eksperimentering. Et eksempel stripe av myometrium som har blitt dissekert og klippet vises i (C). Vanligvis er 2 – 6 strimler kuttet og kuttet som vist. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56639/56639fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56639/56639fig2.jpg"> Figur 2: flere organ bad eksperimentelle sett opp brukes til å måle sammentrekninger av menneskelig myometrium. (A) strimler av myometrium er plassert i små (1 mL) orgel bad kamre plasseres over en oppvarmet reservoaret (i) og er superfused med fysiologisk saltløsning (PSS) som en peristaltiske pumpe (ii). Reservoaret er opprettholdt på tildekket som en sirkulerende vannbad (iii). Hver tegneseriestripe er festet til en force transducer (iv), som registrerer endringer i spenning under sammentrekning. Dette er forsterket av en transbridge forsterker (v) og omgjort til et digitalt signal (vi), som er spilt inn på en maskin (vii) kjører tilknyttede oppkjøpet programvare. (B) forstørret bilde av et organ bad kammer med en stripe av menneskelig myometrium i situ (rød pil), badet i PSS ene enden knyttet til en force svinger og den andre til en fast krok. ()C) skjematisk oversikt over oppsettet. Vev kammer fylt med puss er kontinuerlig parfyme med varmet PSS på 37 ° C som er via varmen utveksling med et oppvarmet vannreservoar under bad (holdt på 45 ° C) og en sirkulerende vannpumpe satt til 55 ° C. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56639/56639fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56639/56639fig3.jpg"> Figur 3: spontan og agonist-stimulert sammentrekninger av menneskelig myometrium i vitro. I agonist-gratis forhold, spontane sammentrekninger forbli stabile over 3 h opptak uten betydelige tap av amplituden eller området-under-the-kurven (AUC) (alle, Aiii) demonstrere robustheten av denne modellen for å undersøke den anvendelse av ulike kontorer på spontan sammentrekning. Etter etablering stabil, spontane sammentrekninger, ble 0,5 nM oksytosin (B, OT) eller vasopressin (C, VP) lagt til fysiologisk saltløsning (PSS). Sammentrekninger under stimulering også forbli stabil i mange timer uten betydelige tap av sammentrekning amplituden (Bii, Cii) eller AUC (Biii, Ciii) slik at effekten av ulike kontraktile agenter skal undersøkt i nærvær av myometrial agonister. Dataene presenteres som mener ± standardfeil av gjsnitt (SEM). Notatet for agonist-stimulert sammentrekninger (B, C), tas kontrollperioden (100%) etter den første 45 min for Agonistiske, når riene har stabilisert. I alle tilfeller var strimler superfused med PSS ved 37 ° C, pH 7.4 (Reproduced fra ene et al. 40 med tillatelse fra Reproduktive Sciences og Di Giglio et al. 54 med tillatelse fra Vitenskapelige rapporter under Creative Common Open Access license). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56639/56639fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56639/56639fig4.jpg"> Figur 4: dataanalyse. (A) En passende kontrollperioden vises i rødt ble bestemt ved å velge sammentrekninger forut for anvendelse av testen sammensatte (stoffet X). Denne kontrollperioden er også lik anvendelsen av stoffet X (f.eks40 min i dette eksemplet) i tid. Når målte verdiene for kontrollperioden er satt som 100%. Alle påfølgende mål er blir uttrykt som en prosentandel av kontroll. (B) finnes 4 ulike parametere i sammentrekning som kan måles: (i) amplituden til sammentrekning som måler sammentrekning styrke (force, mN), (ii) frekvensen av sammentrekning som måler frekvensen av sammentrekning, (iii) varigheten av sammentrekning som måles på halv maksimal toppen av sammentrekning og (iv) området under kurven (også kjent som kraft integrert, vilkårlig enheter) som gir et mål på total arbeidet. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56639/56639fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56639/56639fig5.jpg"> Figur 5: innspilling antagonistiske effekten av atosiban på oxytocin-indusert sammentrekninger i menneskelig myometrium. Når spontan sammentrekninger ble etablert, var sammentrekninger stimulert med oksytosin reseptor Agonistiske, oxytocin (OT). Sammentrekninger kunne stabilisere under stimulering for ytterligere 45 min. (A) The V1a og OT reseptor antagonist, atosiban ble så brukt i økende konsentrasjoner langs en logaritmisk skala (10-9-10-5M). Riene i perioden før første konsentrasjonen av atosiban ble målt og tatt som kontroll (100%). Aktiviteten under hver påfølgende konsentrasjon ble målt og uttrykt som en prosentandel av kontroll. Det samme ble utført for strimler utsatt for OT bruke alene tid-tilsvarende eksperimentelle manøvrer. Dataene ble tegnet inn i grafisk programvare: (B, C) Vis konsentrasjon svar kurver for antagonistiske effekten av atosiban (blå) og fortynning av kjøretøy (grå, Tidskontroll) på OT-indusert myometrial sammentrekning amplitude og området under kurven (AUC), henholdsvis. Dataene presenteres som gjennomsnittlig ± standard feil av gjsnitt (SEM) andelen amplitude og AUC kontroll aktivitet (før påføring av atosiban). IC50 verdier ble deretter beregnet som gir konsentrasjonen som halv maksimal hemmende (50%) svaret for amplituden av sammentrekning og force integrert (AUC) er oppnådd (Reproduced fra ene et al. 40 med tillatelse fra Reproduktive Sciences). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56639/56639fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56639/56639fig6.jpg"> Figur 6: Testing effekt og reseptor selektivitet av en roman sammensatt på menneskelige myometrial sammentrekning. Etter spontan sammentrekninger av menneskelig myometrium ble etablert, var sammentrekninger stimulert vasopressin reseptor Agonistiske, vasopressin (VP) (Ai, Bi) eller oksytosin reseptor Agonistiske, oxytocin (OT) (Ci). Effekten av [D-Arg8]-inotocin ([D-Arg8] INT) og kommersielt tilgjengelig V1aR antagonist, SR49059 på sammentrekninger stimulert av VP ble vurdert ved hjelp av økende konsentrasjoner av forbindelser. Typisk svar vises i (Ai, Bi). Den tilknyttede analyserte data for amplitude og området under kurven (AUC) vises i (ii) og (iii), henholdsvis der effekten har vært uttrykt som prosent av kontroll aktivitet (100%). Både [D-Arg8] heltall og kjente V1aR antagonist, SR49059 forårsaket en dose avhengige nedgang i amplitude og AUC, støtte rollen [D-Arg8] heltall som en V1aR reseptor antagonist i menneskelig myometrium. Derimot [D-Arg8] heltall påvirke ikke sammentrekninger stimulert av OT (Ci-iii), derav tilsvarende til våre funn fra cellen basert analyser, [D-Arg8] INT viser også selektivitet mot V1aR i menneskelig myometrium (Data gjengitt fra Di Giglio et al. 54 med tillatelse fra Vitenskapelige rapporter under Creative Common Open Access license). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56639/56639fig6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Contractility Measurements of Human Uterine Smooth Muscle to Aid Drug Development at JoVE.com

Contractility Measurements of Human Uterine Smooth Muscle to Aid Drug Development (Video) | JoVE

Contractility målinger av menneskelig livmor glatt muskel Aid narkotika utvikling

Denne artikkelen beskriver eksperimentelle protokoller for å studere ex vivo sammentrekninger av menneskelig myometrium og deres anvendelse i stoffet funnet. Denne teknikken brukes til å forbedre forståelsen av myometrial fysiologi og patofysiologi samt å validere farmakologiske data fra romanen forskning sonder eller narkotika kundeemner.

Discovery and characterization of novel pharmaceutical compounds or biochemical probes rely on robust and physiologically relevant assay systems. We ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Contractility Measurements of Human Uterine Smooth Muscle to Aid Drug Development

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay (Video) | JoVE

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens (Video) | JoVE


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis (Video) | JoVE

En orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastase

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum (Video) | JoVE

High-throughput Flow Cytometry cellebasert analyse for å påvise antistoffer mot N-metyl-D-aspartat-reseptoren, eller dopamin-2-reseptor i Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology (Video) | JoVE

Blære glatt muskulatur Strip kontraktilitet som en metode for å vurdere de nedre urinveiene Pharmacology

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties ...

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood (Video) | JoVE

Real-time cytotoksisitetsanalyser i humant fullblod

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...

Early Detection of Drug-Induced Renal Hemodynamic Dysfunction Using Sonographic Technology in Rats

Early Detection of Drug-Induced Renal Hemodynamic Dysfunction Using Sonographic Technology in Rats (Video) | JoVE

Tidlig påvisning av Drug-Induced Nedsatt hemodynamisk Dysfunction Bruke sonografiske Technology i rotter

The kidney normally functions to maintain hemodynamic homeostasis and is a major site of damage caused by drug toxicity. Drug-induced nephrotoxicity is ...

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS (Video) | JoVE

Kvantifisering av den immunsuppressive Tacrolimus på tørket blod Spots Bruke LC-MS / MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation

Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation (Video) | JoVE

Forkalkning av vaskulære glatte muskelceller og avbildning av Aorta forkalkninger og betennelser

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world.  Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and ...

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice (Video) | JoVE

Kvantitativ analyse av mobilnettet komposisjon i avansert aterosklerotisk lesjoner av glatt muskel celle avstamning-Tracing mus

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...