Name: spatial and temporal control of t cell activation using a photoactivatable agonist
Uploaded: 2018-04-25T13:00:00
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Agradecemos a membros do laboratório Huse para aconselhamento e assistência. Suportados pelos institutos nacionais de saúde (R01-AI087644 para MH) e P30-CA008748 ao Memorial Sloan-Kettering Cancer Center dos Estados Unidos.

1. preparação de superfícies de vidro estimulatórios
<ol><li>Casaco oito poços septada lamela com biotinilado poli-L-lisina (Bio-PLL) diluído em água destilada, deionizada (ddH2O) 1: 500. Incube durante 30 min à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Lavar com H2O.</li>
	<li>Seco por 2h em RT.</li>
	<li>Bloco Bio-PLL revestido de superfícies com tampão de bloqueio (HEPES salino [10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl], com 2% de BSA) durante 30 min à RT<ol>
<li>Dissolva 5 mg de poli-L-lysine hyd...

<ol>
	<li>Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+structure+and+function+of+the+immunological+synapse.">Understanding the structure and function of the immunological synapse.</a> Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311 (2010).</li><li>Liu, X., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+Synapse+Formation:+Cell+Polarity+During+T+Cell-APC+Interaction.">Immunological Synapse Formation: Cell Polarity During T Cell-APC Interaction.</a> Cell Polarity 1. , 247-275 (2015).</li><li>Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+actin+polymerization+drives+T+cell+receptor-induced+spreading:+A+role+for+the+signal+transduction+adaptor+LAT.">Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: A role for the signal transduction adaptor LAT.</a> Immunity. 14, 315-329 (2001).</li><li>Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+Function+of+the+Immunological+Synapse+from+Studies+with+Supported+Planar+Bilayers.">Insights into Function of the Immunological Synapse from Studies with Supported Planar Bilayers.</a> Current topics in microbiology and immunology. 340, (2010).</li><li>Chauveau, A., Le Floc'h, A., Bantilan, N. S., Koretzky, G. a., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diacylglycerol+kinase+&#945;+establishes+T+cell+polarity+by+shaping+diacylglycerol+accumulation+at+the+immunological+synapse.">Diacylglycerol kinase &#945; establishes T cell polarity by shaping diacylglycerol accumulation at the immunological synapse.</a> Sci. Signal. 7, ra82 (2014).</li><li>Huse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+Temporal+Dynamics+of+T+Cell+Receptor+Signaling+with+a+Photoactivatable+Agonist.">Spatial and Temporal Dynamics of T Cell Receptor Signaling with a Photoactivatable Agonist.</a> Immunity. 27, 76-88 (2007).</li><li>Quann, E. J., Merino, E., Furuta, T., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+diacylglycerol+drives+the+polarization+of+the+microtubule-organizing+center+in+T+cells.">Localized diacylglycerol drives the polarization of the microtubule-organizing center in T cells.</a> Nat Immunol. 10, 627-635 (2009).</li><li>Basu, R., Chen, Y., Quann, E. J., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+variable+hinge+region+of+novel+PKCs+determines+localization+to+distinct+regions+of+the+immunological+synapse.">The variable hinge region of novel PKCs determines localization to distinct regions of the immunological synapse.</a> PLoS One. 9, 1-8 (2014).</li><li>Liu, X., Kapoor, T. M., Chen, J. K., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diacylglycerol+promotes+centrosome+polarization+in+T+cells+via+reciprocal+localization+of+dynein+and+myosin+II.">Diacylglycerol promotes centrosome polarization in T cells via reciprocal localization of dynein and myosin II.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 11976-11981 (2013).</li><li>Quann, E. J., Liu, X., Altan-Bonnet, G., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cascade+of+protein+kinase+C+isozymes+promotes+cytoskeletal+polarization+in+T+cells.">A cascade of protein kinase C isozymes promotes cytoskeletal polarization in T cells.</a> Nat. Immunol. 12, 647-654 (2011).</li><li>Boniface, J. J., Reich, Z., Lyons, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+of+T+cell+receptor+binding+to+peptide-MHC:+evidence+for+a+general+mechanism+of+molecular+scanning.">Thermodynamics of T cell receptor binding to peptide-MHC: evidence for a general mechanism of molecular scanning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 11446-11451 (1999).</li><li>Garboczi, D. N., Hung, D. T., Wiley, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-A2-peptide+complexes:+refolding+and+crystallization+of+molecules+expressed+in+Escherichia+coli+and+complexed+with+single+antigenic+peptides.">HLA-A2-peptide complexes: refolding and crystallization of molecules expressed in Escherichia coli and complexed with single antigenic peptides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 3429-3433 (1992).</li><li>Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+use+two+directionally+distinct+pathways+for+cytokine+secretion.">T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion.</a> Nat. Immunol. 7, 247-255 (2006).</li><li>Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+signaling+blocks+activating+receptor+clustering+and+induces+cytoskeletal+retraction+in+natural+killer+cells.">Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells.</a> J. Cell Biol. 192, 675-690 (2011).</li><li>Nguyen Duc, T., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Generalizable+Platform+for+the+Photoactivation+of+Cell+Surface+Receptors.">A Generalizable Platform for the Photoactivation of Cell Surface Receptors.</a> ACS Chem. Biol. 10, 2435-2440 (2015).</li><li>Airan, R. D., Thompson, K. R., Fenno, L. E., Bernstein, H., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+precise+in+vivo+control+of+intracellular+signalling.">Temporally precise in vivo control of intracellular signalling.</a> Nature. 458, 1025-1029 (2009).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+chemokine+receptor+signal+and+T-cell+migration.">Optogenetic control of chemokine receptor signal and T-cell migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 6371-6376 (2014).</li><li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction.">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461, 997-1001 (2009).</li><li>Guntas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+an+improved+light-induced+dimer+(iLID)+for+controlling+the+localization+and+activity+of+signaling+proteins.">Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 112-117 (2015).</li><li>Wu, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells.">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461, 104-108 (2009).</li><li>Pathak, G. P., Vrana, J. D., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+cell+function+using+engineered+photoreceptors.">Optogenetic control of cell function using engineered photoreceptors.</a> Biol. cell/under auspices Eur. Cell Biol. Organ. 105, 59-72 (2014).</li><li>Grusch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporally+precise+activation+of+engineered+receptor+tyrosine+kinases+by+light.">Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light.</a> EMBO J. 33, 1713-1726 (2014).</li><li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+repositioning+in+T+cells+is+biphasic+and+driven+by+microtubule+end-on+capture-shrinkage.">Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage.</a> J. Cell Biol. 202, 779-792 (2013).</li></ol>

Nos últimos anos, a luz tem emergido como uma excelente ferramenta para activação spatiotemporally controlada dos processos celulares. Várias metodologias têm sido desenvolvidos, cada um com as desvantagens e vantagens associadas. O sistema descrito aqui, que se baseia o decaging de ligantes extracelulares, imobilizados, é ideal para a análise das respostas de sinalização rápidas, subcellular, polarizadas. Esta abordagem tem sido aplicada para examinar a formação é em células T conforme descrito acima. Adic...

Linfócitos T (células T) desempenham um papel central na imunidade celular, reconhecendo peptídeos antigênicos exibidos no contexto da superfície de células MHC. Reconhecimento do antígeno, que é mediado pelo TCR, dirige a diferenciação de células T de ingênuo e promove a entrega de respostas citolíticas e comunicativas por populações efetoras. Noivado de TCR também induz mudanças dramáticas na arquitetura celular. Em poucos minutos, as células T cisma no lado da célula apresentadora de antígeno (APC), formando uma interface polarizada conhecida como sinapse imunológica (IS)1,2. A IS potencializa respostas de células T efetoras, permitindo o lançamento direcional de citocinas ou, no caso dos linfócitos T citotóxicos (CTLs), proteínas líticas que destruir o APC.
Noivado de TCR por pMHC induz a rápida fosforilação de várias moléculas de adaptador a jusante, incluindo o vinculador para as células de ativação de T (LAT), que, finalmente, promove a remodelação robusto do citoesqueleto sináptica2. Actina filamentosa cortical (F-Actina) conduz a célula T, espalhando sobre a superfície da APC e então resolve em uma estrutura anular caracterizada pelo acúmulo de F-Actina na periferia IS e depleção do centro. Formação de anel F-Actina é rigidamente acoplada a reorientação do centro organizador de microtúbulos (MTOC, também chamado a centrossoma em células T) para uma posição abaixo do centro da interface. Ambos os eventos ocorrem em poucos minutos de reconhecimento inicial do antígeno e estabelecer o contexto arquitetônico em que eventos de ativação subsequente e efetoras respostas ocorrem.
Para estudar a formação de IS, vários laboratórios desenvolveram abordagens em que o APC é substituído por uma superfície de vidro que contém ligantes TCR imobilizados ou suporta uma bicapa lipídica que em si contém o ligantes3,4. Células T formam IS-como contatos nestas superfícies que pode ser fotografada por microscópio de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) ou microscopia confocal, permitindo estudos de alta resolução do início da ativação de células T e formação de IS.
Embora essas abordagens têm permitido para excelente visualização do IS totalmente montado, grande parte da sinalização da seguinte ligadura TCR:pMHC ocorre em segundos, complicando os esforços para determinar a sequência de eventos após a ativação de TCR com precisão . Para contornar esse problema, uma abordagem de fotoativação foi desenvolvida, em que photoactivatable pMHC é usado para obter um controlo spatiotemporal de TCR ativação5,6,7. Neste sistema, as células T estão conectadas em superfícies de vidro contendo photoactivatable pMHC que é não-estimulatório de TCR até irradiadas com luz ultravioleta (UV). Irradiação UV de uma região de mícron de tamanho da superfície abaixo da célula T remove o photocage criando uma zona estimulatório que pode ser reconhecida pela célula T. Sinalização de eventos subsequentes e remodelação do citoesqueleto são então monitorados usando repórteres fluorescentes geneticamente codificados. Duas versões de photoactivatable de peptídeos antigênicos, traça citocromo c88-103 (MCC) e no257-264 ovalbumina (OVA), que são apresentados no contexto da classe II MHC-eu... Ek e classe de MHC H2-Kb, respectivamente, foram desenvolvido (Figura 1). Isto permite a análise de ambos CD4+ T células específicas para MCC-l-Ok (expressando o 5 C. C7, 2B4, ou e TCRs) e CD8+ T células específicas para óvulos-H2-Kb (expressando o TCR OT1).
Na última década, a abordagem de fotoativação e imagem latente de TCR tem sido utilizada para estabelecer a cinética precisa de TCR primeiros passos de sinalização e também para identificar as vias moleculares que regem a remodelação do citoesqueleto polarizada5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10. por exemplo, o ensaio foi fundamental na determinação que centrossoma reorientação em direção a APC é mediada por um gradiente localizado do lipídios segundo mensageiro diacilglicerol centrado no IS. Prevê-se que esta metodologia continuará a ser valioso para aplicações que exigem análise de imagens de alta resolução da função da célula T.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1152">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td>
			<td style="width:211px;">Thermofischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">155361</td>
			<td style="width:443px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2636</td>
			<td>Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link NHS-Biotin</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td align="right">20217</td>
			<td>Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin</td>
			<td style="width:211px;">Thermofischer Scientific</td>
			<td align="right">434301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit</td>
			<td>Avidity</td>
			<td>BirA500</td>
			<td>Will be used to biotinylate proteins</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated Hb I-EK&#160;</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated NPE-MCC I-EK&#160;</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated &#945;H2-Kk antibody</td>
			<td style="width:211px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">553591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated NPE-OVA H2-Kb</td>
			<td style="width:211px;">Anaspec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated KAVY H2-Db&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Anaspec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotinylated ICAM1&#160;</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Hand held UV lamp</td>
			<td style="width:211px;">UVP</td>
			<td style="width:119px;">UVGL-25</td>
			<td>Lamp is held &#60; 1 cm from the sample.&#160; 30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Olympus IX-81 OMAC TIRF system.</td>
			<td style="width:211px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Additional information about the imaging system can be found in Figure 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Mosaic digital diaphragm</td>
			<td style="width:211px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:379px;">Slidebook software</td>
			<td style="width:211px;">Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatial and temporal control of t cell activation using a photoactivatable agonist

Linfócitos T envolver-se na rápida, polarizado sinalização, ocorrendo dentro de minutos após a ativação do TCR. Isto induz a formação de sinapse imunológica, uma junção de célula-célula estereotipadas que regula a ativação de células T e metas direcionalmente respostas efetoras. Para estudar estes processos efetivamente, é necessária uma abordagem de imagem que é adaptada para a captura de respostas rápidas, polarizadas. Este protocolo descreve um sistema, que é baseado em um photoactivatable do peptide-major formando um complexo (pMHC) que é não-estimulatórios até que ele é exposto à luz ultravioleta. Decaging alvo estes reagentes durante experimentos de tele-microscopia permite controle spatiotemporal preciso da ativação do TCR e monitoramento de alta resolução de respostas celulares subsequentes por reflexão interna total (TIRF) de imagem. Essa abordagem também é compatível com estratégias de perturbação genética e farmacológicas. Isso permite que o conjunto das vias moleculares bem definidos que link TCR sinalização para a formação das estruturas do citoesqueleto polarizadas que fundamentam a sinapse imunológica.

A abordagem de fotoativação e de imagem permite a observação e facile quantificação das respostas de sinalização rápidas, polarizadas. Para ilustrar suas capacidades, reproduzidas aqui, é um experimento examinando a spatiotemporal correlação entre acumulação de DAG TCR-induzida e de reorientação centrossoma. 5 C. Explosões de célula C7 T retrovirally foram transfectadas com dois repórteres fluorescentes: um biossensor DAG que contém os domínios de C1 em tandem da prot...

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Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

Controle espacial e Temporal da ativação de células T usando um agonista Photoactivatable

Este protocolo descreve um método baseado em imagem para ativar os linfócitos T usando photoactivatable peptídeo-MHC, permitindo um controle preciso da ativação de células T spatiotemporal.

T lymphocytes engage in rapid, polarized signaling, occurring within minutes following TCR activation. This induces formation of the immunological ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Transdução retroviral de receptor de células T no rato células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Imunologia e Infecção

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Indução de enxerto-versus-hospedeiro de Doenças e<em&gt; Em Vivo</em&gt; Monitoramento celular T Usando um modelo murino de MHC de correspondência

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Antígeno Artificial célula apresentadora de ativação mediada (AAPC) e expansão de células T Natural Killer

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Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

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In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Na Vivo Ensaio para detecção de células T antígeno-específicas função citolítica usando um modelo de vacinação

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