Name: establishment of an extracellular acidic ph culture system
Uploaded: 2017-11-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System at JoVE.com

Vi takke medlemmerne af Division af genom videnskab og laboratorium for Systembiologi og medicin, RCAST, The University of Tokyo. Vi især takke Dr. H. Aburatani, Dr. T. Kodama, (LSBM, RCAST, The University of Tokyo), Dr. K. Tomizuka, Dr. T. Yoshida, og Dr. A. Kunisato (Carstens Hakko Kirin Co, Ltd) til nyttige diskussioner og støtte. Dette arbejde blev delvist støttet af licensbetaling for unge videnskabsmand (A) (26710005, T.O.), licensbetaling for videnskabelig forskning på Innovative områder (26116711 og 16 H 01567, T.O.) og licensbetaling for udfordrende Sonderende forskning (16. K 14605, T.O.) fra ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi i Japan, Takeda Science Foundation (T.O.), Kobayashi grundlaget for kræftforskning (T.O.) og projekt for kræftforskning, og Terapeutiske Evolution (P-skabe) og den praktiske forskning for Innovative kræft kontrol fra Japan Agency for medicinsk forskning og udvikling, AMED (T.O.).

1. forberedelse af sure næringssubstratet
<ol><li>
Forberedelse af kontrol (pH 7,4) og lav-pH (pH 6,8) næringssubstratet
	<ol>
<li>4,75 g DMEM pulver uden L-glutamin i 500 mL vand opløses.</li>
		<li>Forberede 0,33 M NaHCO3 løsning i en tryktæt flaske. OBS: Det er vigtigt at bruge en pres stramme flaske da NaHCO3 udsender CO2 gas når opvarmet og termisk nedbrydes.</li>
		<li>Autoklave medium og løsning. Tillade disse buffere til afkøles til 25 ° C.</li>
		<l...

<ol>
	<li>Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cancer+cell+metabolism.">Regulation of cancer cell metabolism.</a> Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).</li><li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression.">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li><li>Hsu, P. P., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+metabolism:+Warburg+and+beyond.">Cancer cell metabolism: Warburg and beyond.</a> Cell. 134 (5), 703-707 (2008).</li><li>Gerweck, L. E., Seetharaman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pH+gradient+in+tumor+versus+normal+tissue:+potential+exploitation+for+the+treatment+of+cancer.">Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer.</a> Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).</li><li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+pH:+a+perfect+storm+for+cancer+progression.">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).</li><li>Gatenby, R. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+do+cancers+have+high+aerobic+glycolysis?.">Why do cancers have high aerobic glycolysis?.</a> Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).</li><li>McBrian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+regulates+intracellular+pH.">Histone acetylation regulates intracellular pH.</a> Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).</li><li>Damaghi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+acidosis+in+the+tumour+microenvironment+selects+for+overexpression+of+LAMP2+in+the+plasma+membrane.">Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane.</a> Nat Commun. 6, 8752 (2015).</li><li>Corbet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidosis+Drives+the+Reprogramming+of+Fatty+Acid+Metabolism+in+Cancer+Cells+through+Changes+in+Mitochondrial+and+Histone+Acetylation.">Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation.</a> Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).</li><li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+analysis+of+lactic+acidosis+and+acidosis+response+in+human+cancers.">The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers.</a> PLoS genetics. 4 (12), e1000293 (2008).</li><li>Kondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Acidic+pH+Activates+the+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein+2+to+Promote+Tumor+Progression.">Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression.</a> Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).</li></ol>

Her, beskrev vi en simpel sure pH kultur system og dets evalueringsprocessen. Kombinationen af tre metoder til medium forsuring, dvs, reduceret bikarbonat koncentration, laktat tilsætning og HCl tilsætning, gjort det muligt at efterforske mekanismen, pH-svar grundigt og sammenligne den cellulære reaktion på andre tumor microenvironmental betingelser såsom hypoksi eller næringsstof sult.
Nøglen til denne metode er at fastslå de relevante koncentrationer af bikarbonat, laktat og...

Tumor mikromiljø spiller vigtige roller i tumor progression og kræft celle metabolisme1,2,3. Kræftceller er ofte udsat for betingelser såsom hypoxi, næringsrige afsavn og sure ekstracellulære pH (pHe). Dog rollen som pHe i tumor progression ikke blevet afklaret så udførligt som hypoxi eller næringsstof sult. PHe i tumor væv kan blive sure, nåede ca pH 6,84,5. Sure pH-værdi udspringer af aerobe og anaerobe glycolytic udskillelse af protoner (H+) og laktat af prolifererende kræft celler5,6.
Nylige undersøgelser afslørede, at sure pHe-induceret Histon deacetylation, fedtsyre oxidation og exocytose af sure lysosomer for tilpasning til den alvorlige sure miljø7,8,9,10. Men mekanismer gennem hvilke ekstracellulære forsuring påvirker kræft adfærd og identiteten af nøglen lovgivere i sure pH tumor mikromiljø ikke har fastlagt fuldt ud. Desuden flere rapporter beskrevet forskellige sure pH medier ved hjælp af uklare koncentrationer af bikarbonat, Tris, rør og HEPES buffer eller laktat og HCl, men der er få rapporter at demonstrere stabilitet af den justerede medium eller omfattende sammenligning af flere forskellige sure dyrkningsmedier7,8,9,10
For at belyse centrale regulatorer og metaboliske ændringer i kræftceller i forbindelse med ekstracellulære forsuring, vi etableret en simpel i vitro kultur model for at bevare en sure pHe og undersøgt rollen af pHe i kræft celler11. Du bruger denne metode, vi opretholdt en sure næringssubstratet med en pHe af 6,8 ved 37 ° C under 5% CO2, ved hjælp af reducerede bikarbonat koncentrationer i dyrkningsmediet. pH 7,4 blev brugt som normalt og styre medium. Medium pH blev opretholdt i mindst 24 timer og gradvist faldt 72 h i kultur af PANC-1 og AsPC-1 bugspytkirtelkræftceller. Fordi øget glykolyse accelererer udskillelsen af protoner, men også laktat7,8,9, vi også etableret en kultur metode efterligne laktat-induceret acidose ved tilføjelse af laktat i stedet for at reducere den bikarbonat koncentration. Derudover HCl-induceret sure pHe i mediet giver os mulighed at udelukke muligheden for, at cellulære svar til sure pH næringssubstratet ikke er på grund af en nedsat koncentration af bikarbonat. Desuden kan ved hjælp af forskellige medier med en pH på 6,4 til 7.4 med forskellige bikarbonat koncentration, vi vurdere omfanget af pHe effekter på cellulære svar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium&#8220;Nissui&#8221; 2</td>
			<td>Nissui</td>
			<td>05919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>10438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>09367-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>32778-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5%-Trypan Blue Stain Solution</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>29853-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactic acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>18091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green PCR Master Mix&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td>4368702&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AsPC-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMS-6</td>
			<td>JCRB Cell Bank</td>
			<td>JCRB0432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIG</td>
			<td>JCRB Cell Bank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC9</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 5 Real-Time PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>CRL-1682</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of an extracellular acidic ph culture system

Betingelserne for tumor mikromiljø hypoxi f.eks næringsstof sult, spiller en kritisk rolle i kræft progression og malignitet. Men rollen som sure ekstracellulære pH i tumor aggressivitet og dens underliggende mekanisme har ikke blevet grundigt undersøgt i forhold til hypoksiske eller næringsstof sult betingelser. Derudover er en veldefineret kultur metode til at efterligne den sure ekstracellulære tumor mikromiljø ikke blevet fuldt rapporteret.
Her præsenterer vi en simpel i vitro kultur metode for at opretholde sure ekstracellulære pH bruge reduceret bikarbonat og øget laktat eller HCl-koncentrationer i dyrkningsmediet. Medium pH blev opretholdt i mindst 24 timer og gradvist faldt med 72 h efter kultur af PANC-1 og AsPC-1 bugspytkirtelkræftceller. Tre særskilte sure media betingelser i denne undersøgelse meget upregulated pH-responderende gener såsom MSMO1, INSIG1og IDI1 sammenlignet med hypoxi eller næringsstof sult. Opregulering af disse gener kan bruges som markør af sure pH-værdi. Disse enkle teknikker er gavnligt at belyse underliggende mekanismer af tumor malignitet under sure tumor mikromiljø. Derfor vores ekstracellulære sure pH kultur system giver mulighed for opdagelsen af cellulære sure pH svar ikke kun i kræftceller, men også i primærelementer, såsom renal tubulær celler, i forhold til de andre sure lidelser herunder, diabetisk Ketoacidose, mælkesyre acidose, renal tubulær acidose og respiratorisk acidose.

For at bestemme den passende bikarbonat koncentration, vi forberedte DMEM på vifte af 0 - 8 mM NaHCO3 (endelig koncentration i dyrkningsmediet) og lykkedes at forberede kultur medier med pH spænder fra 6,4-7.4 (figur 1). Vi forberedte DMEM med 8 mM NaHCO3 (pH 7,4) som kontrol medium og 2 mM NaHCO3 (pH 6,8) som et medium med sure pH-værdi ifølge en tidligere rapport med angivelse af at den ekstracellulære pH når pH 6,8 fo...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System at JoVE.com

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Sure tumor mikromiljø spiller vigtige roller i tumor progression. For at vurdere virkningerne af sure ekstracellulære pH på kræft celler in vitro etableret vi enkle sure kultur systemer.

Etablering af en ekstracellulære sure pH kultur System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Growing plant cell walls characteristically exhibit a property known as 'acid growth', by which we mean they are more extensible at low pH (&lt; 5) 1. The ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mus embryonale udvikling i et serum-frit Hele Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur System til Studieinformationen Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

Udvikling af en Insert Co-kultur System af to Cellular typer i fravær af celle-celle-Kontakt

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Fedt kroppen organsystem kultur i Aedes Aegypti, en vektor af Zika Virus

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

Etablering af en klonal kultur af encellede de tråddannende alger

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...

A Triple Culture Cell System Modeling the Human Blood-Brain Barrier

Et tredobbelt kulturcellesystem, der modellerer den menneskelige blod-hjerne-barriere

The delivery of drugs to the brain remains a challenge due to the blood-brain barrier's (BBB) highly specific and restrictive properties, which controls ...

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

Tredimensionelt, serumfrit kultursystem til stamceller fra lacrimalkirtlen

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture ...