Name: establishment of an extracellular acidic ph culture system
Uploaded: 2017-11-19T14:00:00
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Nous remercions les membres de la Division des sciences du génome et le laboratoire de biologie des systèmes et la médecine, RCAST, l’Université de Tokyo. Nous remercions tout particulièrement m. H. Aburatani, Dr T. Kodama, (LSBM, RCAST, l’Université de Tokyo), Dr K. Tomizuka, Dr A. et Dr T. Yoshida Kunisato (Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.) pour des discussions utiles et soutien. Ce travail a été partiellement soutenu par la subvention pour scientifique (A) (26710005, T.O.), Young subvention pour la recherche scientifique sur les domaines innovants (26116711 et 16 H 01567, T.O.) et subvention pour défier Recherche exploratoire (16K 14605, T.O.) depuis le ministère de l’éducation, Culture, Sports, Science et technologie du Japon, le FNS Takeda (T.O.), la Fondation Kobayashi de recherche sur le Cancer (T.O.) et le projet de recherche sur le Cancer et Evolution thérapeutique (P-créer) et la pratique en recherche pour la lutte contre le Cancer innovateur de la Japan Agency for Medical Research and Development, AMED (T.O.).

1. préparation du milieu de Culture acide
<ol><li>
Préparation du contrôle (pH 7,4) et le milieu de culture de faible pH (pH 6,8)
	<ol>
<li>Dissoudre 4,75 g de poudre DMEM sans L-glutamine dans 500 mL d’eau.</li>
		<li>Préparer 0,33 M NaHCO3 solution dans un flacon étanche à la pression. ATTENTION : Il est important d’utiliser une bouteille étanche pression émet de NaHCO3 CO2 gaz lorsqu’il est chauffé et thermiquement décomposée.</li>
		<li>Stérili...

<ol>
	<li>Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cancer+cell+metabolism.">Regulation of cancer cell metabolism.</a> Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).</li><li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression.">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li><li>Hsu, P. P., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+metabolism:+Warburg+and+beyond.">Cancer cell metabolism: Warburg and beyond.</a> Cell. 134 (5), 703-707 (2008).</li><li>Gerweck, L. E., Seetharaman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pH+gradient+in+tumor+versus+normal+tissue:+potential+exploitation+for+the+treatment+of+cancer.">Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer.</a> Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).</li><li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+pH:+a+perfect+storm+for+cancer+progression.">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).</li><li>Gatenby, R. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+do+cancers+have+high+aerobic+glycolysis?.">Why do cancers have high aerobic glycolysis?.</a> Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).</li><li>McBrian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+regulates+intracellular+pH.">Histone acetylation regulates intracellular pH.</a> Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).</li><li>Damaghi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+acidosis+in+the+tumour+microenvironment+selects+for+overexpression+of+LAMP2+in+the+plasma+membrane.">Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane.</a> Nat Commun. 6, 8752 (2015).</li><li>Corbet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidosis+Drives+the+Reprogramming+of+Fatty+Acid+Metabolism+in+Cancer+Cells+through+Changes+in+Mitochondrial+and+Histone+Acetylation.">Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation.</a> Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).</li><li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+analysis+of+lactic+acidosis+and+acidosis+response+in+human+cancers.">The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers.</a> PLoS genetics. 4 (12), e1000293 (2008).</li><li>Kondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Acidic+pH+Activates+the+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein+2+to+Promote+Tumor+Progression.">Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression.</a> Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).</li></ol>

Ici, nous avons décrit un système simple de pH acide de la culture et de son processus d’évaluation. La combinaison des trois méthodes d’acidification moyenne, c'est-à-dire, concentration de bicarbonate réduit, ajout de lactate et addition de HCl, nous a permis d’étudier le mécanisme de pH-réponse soigneusement et de comparer la réponse cellulaire à l’autre tumeur conditions micro-environnementales telles que l’hypoxie ou nutriment famine.
La clé de cette méthod...

Le microenvironnement tumoral joue un rôle crucial dans la progression tumorale et cancer cell metabolism1,2,3. Cellules cancéreuses sont souvent exposés à des conditions telles que l’hypoxie, appauvrissement nutritif et acide pH extracellulaire (pHe). Cependant, le rôle de pHe dans la progression tumorale n’a pas été précisé aussi largement comme la famine d’hypoxie ou d’éléments nutritifs. La pHe dans le tissu de la tumeur peut devenir acide, atteignant environ pH 6,84,5. Le pH acide résulte de l’excrétion de glycolyse aérobie et anaérobie des protons (H+) et lactate par la prolifération du cancer cellules5,6.
Des études récentes ont révélé que histone pHe induite par l’acide désacétylation, oxydation des acides gras et exocytose des lysosomes acides pour l’adaptation à l’environnement acide sévère7,8,9,10. Cependant, les mécanismes par lequel l’acidification extracellulaire affecte comportement du cancer et l’identité de la clé dans le microenvironnement tumoral de pH acide, les organismes de réglementation n’ont pas été entièrement établis. En outre, plusieurs rapports décrivent divers milieux de pH acide en utilisant des concentrations peu claires de bicarbonate, de tampon HEPES, Tris et tuyaux ou de lactate et de HCl, mais il y a peu de rapports pour démontrer la stabilité de l’ajusté moyenne ni complète Comparaison de plusieurs milieux de culture acides distincts7,8,9,10
Afin d’élucider les régulateurs clés et des changements métaboliques dans les cellules cancéreuses dans le contexte de l’acidification extracellulaire, nous avons établi un modèle de culture simple in vitro afin de maintenir un acide pHe et a examiné le rôle de pHe dans le cancer des cellules11. En utilisant cette méthode, nous avons maintenu un milieu de culture acide avec un pHe de 6,8 à 37 ° C moins de 5 % CO2, en utilisant des concentrations réduites de bicarbonate dans le milieu de culture. pH 7,4 a été utilisé comme d’habitude et moyen de contrôle. Le pH du milieu a été maintenu pendant au moins 24 h et progressivement diminué après 72 h au cours de la culture de cellules de cancer du pancréas PANC-1 et CNPA-1. Parce que la glycolyse améliorée accélère l’excrétion de non seulement des protons, mais aussi des lactate7,8,9, nous avons aussi établi une méthode de culture imitant acidose induite par le lactate par ajout de lactate, plutôt que de réduire la concentration de bicarbonate. En outre, induite par l’HCl acide pHe dans le milieu nous permet d’exclure la possibilité que des réponses cellulaires à pH acide milieu de culture ne sont pas en raison d’une diminution de la concentration de bicarbonate. En outre, à l’aide de différents médias avec un pH de 6,4 à 7,4 avec concentration de bicarbonate différents, nous pouvons évaluer l’étendue des effets de pHe sur les réponses cellulaires.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium&#8220;Nissui&#8221; 2</td>
			<td>Nissui</td>
			<td>05919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>10438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>09367-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>32778-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5%-Trypan Blue Stain Solution</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>29853-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactic acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>18091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green PCR Master Mix&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td>4368702&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AsPC-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMS-6</td>
			<td>JCRB Cell Bank</td>
			<td>JCRB0432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIG</td>
			<td>JCRB Cell Bank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC9</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 5 Real-Time PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>CRL-1682</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of an extracellular acidic ph culture system

Conditions du microenvironnement tumoral, telles que l’hypoxie ou à la famine en éléments nutritifs, jouent un rôle crucial dans la progression du cancer et des tumeurs malignes. Cependant, le rôle des acides pH extracellulaire à l’agressivité de la tumeur et son mécanisme sous-jacent n'a pas été étudié par rapport à des conditions de famine hypoxique ou en éléments nutritifs. En outre, une méthode de culture bien définie pour imiter le microenvironnement de la tumeur extracellulaire acide n’a été entièrement signalée.
Nous présentons ici une méthode de culture simple in vitro afin de maintenir à l’aide de l’acide pH extracellulaire réduit de bicarbonate et une augmentation de lactate ou HCl concentration dans le milieu de culture. Le pH du milieu a été maintenu pendant au moins 24 h et progressivement diminué de 72 h après culture des cellules de cancer du pancréas PANC-1 et CNPA-1. Trois conditions de milieu acide distincts dans cette étude hautement surexprimés des gènes sensibles aux pH tels que MSMO1, INSIG1et IDI1 comparativement à l’hypoxie ou à la famine en nutriments. La stimulation de l’expression de ces gènes peut servir comme indicateur de pH acide. Ces techniques simples sont bénéfiques pour élucider les mécanismes sous-jacents de la malignité de la tumeur sous microenvironnement tumoral acides. Notre système de culture extracellulaire acide pH permet donc, découverte des réponses cellulaires acides pH non seulement dans les cellules cancéreuses, mais aussi dans les cellules primaires, telles que les cellules tubulaires rénales, en ce qui concerne les autres acides troubles notamment, acidocétose diabétique, l’acidose lactique, l’acidose tubulaire rénale et une acidose respiratoire.

Pour déterminer la concentration de bicarbonate approprié, nous avons préparé DMEM à distance de 0 - 8 mM NaHCO3 (concentration finale dans le milieu de culture) et succède à la préparation de milieux de culture avec un pH allant de 6,4 à 7,4 (Figure 1). Nous avons préparé DMEM avec 8 mM NaHCO3 (pH 7,4) comme un moyen de contrôle et de 2 millimètres NaHCO3 (pH 6,8) comme un moyen avec un pH acide selon un précéd...

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Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Le microenvironnement tumoral acide joue un rôle crucial dans la progression tumorale. Afin d’évaluer les effets des acides pH extracellulaire sur le cancer des cellules in vitro, nous avons établi des systèmes de culture acides simples.

Mise en place d’un pH extracellulaire acide système de Culture

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

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