Name: establishment of an extracellular acidic ph culture system
Uploaded: 2017-11-19T14:00:00
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東京大学先端研、医学システム生物学、ゲノム科学部門と研究室のメンバーに感謝します我々 は特に感謝博士 h. 油谷、小玉徹博士、(LSBM、東大先端研、東京大学)、A 博士、博士・吉田先生・ k ・富塚 有用な議論とサポートの國里 (協和発酵キリン株式会社)。この作品は一部文部の若い科学者 (A) (26710005、ティー ・ オーエンタテインメント)、革新的な領域 (H 01567、ティー ・ オーエンタテインメントの 26116711 と 16) 科学研究費補助金・挑戦 文部科学省がん研究事業がん研究 (ティー ・ オーエンタテインメント)、小林財団、武田科学振興財団 (ティー ・ オーエンタテインメント) 日本の技術からの探索的研究 (16 K 14605、ティー ・ オーエンタテインメント) と(P 作成) 治療の進化とアメッド (ティー ・ オーエンタテインメント) 総合医療研究機構から革新的ながん対策の実践的研究。

1. 酸性の培地の準備
<ol><li>
コントロール (pH 7.4) の作製と低 pH (ペーハー 6.8) 培
	<ol>
<li>500 mL の水に L-グルタミンなし DMEM 粉末 4.75 g を溶解します。</li>
		<li>耐圧ボトルで 0.33 M NaHCO3ソリューションを準備します。 注意: NaHCO3 CO2ガスを加熱すると熱分解を発するので圧力のタイトなボトルを使用することが重要です。</li>
		<li>オートクレーブ媒体および...

<ol>
	<li>Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cancer+cell+metabolism.">Regulation of cancer cell metabolism.</a> Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).</li><li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression.">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li><li>Hsu, P. P., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+metabolism:+Warburg+and+beyond.">Cancer cell metabolism: Warburg and beyond.</a> Cell. 134 (5), 703-707 (2008).</li><li>Gerweck, L. E., Seetharaman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pH+gradient+in+tumor+versus+normal+tissue:+potential+exploitation+for+the+treatment+of+cancer.">Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer.</a> Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).</li><li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+pH:+a+perfect+storm+for+cancer+progression.">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).</li><li>Gatenby, R. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+do+cancers+have+high+aerobic+glycolysis?.">Why do cancers have high aerobic glycolysis?.</a> Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).</li><li>McBrian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+regulates+intracellular+pH.">Histone acetylation regulates intracellular pH.</a> Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).</li><li>Damaghi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+acidosis+in+the+tumour+microenvironment+selects+for+overexpression+of+LAMP2+in+the+plasma+membrane.">Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane.</a> Nat Commun. 6, 8752 (2015).</li><li>Corbet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidosis+Drives+the+Reprogramming+of+Fatty+Acid+Metabolism+in+Cancer+Cells+through+Changes+in+Mitochondrial+and+Histone+Acetylation.">Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation.</a> Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).</li><li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+analysis+of+lactic+acidosis+and+acidosis+response+in+human+cancers.">The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers.</a> PLoS genetics. 4 (12), e1000293 (2008).</li><li>Kondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Acidic+pH+Activates+the+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein+2+to+Promote+Tumor+Progression.">Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression.</a> Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).</li></ol>

ここでは、簡単な酸性 pH 文化システムとその評価プロセスについて説明しました。中程度の酸性化、すなわち、減らされた重炭酸濃度、乳酸添加と HCl 添加の 3 つの方法の組み合わせでは、pH 応答メカニズムを徹底的に調査し、他の腫瘍に対する細胞の反応を比較できました。低酸素や栄養飢餓などアイソレータケージ条件。
このメソッドのキーは、培養液中の?...

腫瘍微小環境は、腫瘍の進行と癌細胞代謝1,2,3で重要な役割を果たしています。がん細胞が低酸素血症、栄養不足、酸性細胞外 pH (pHe) など条件にさらされること。ただし、腫瘍の進行の pHe の役割は明らかにされていないとして広く低酸素や栄養飢餓のように。腫瘍組織内 pHe を酸性、およそ pH 6.84,5に到達になることができます。酸性の pH はプロトン (H+) の好気性と嫌気性解糖系の排泄から発生し、増殖癌による乳酸細胞5,6.
最近の研究で明らかに酸性 pHe 誘起ヒストン脱アセチル化、脂肪酸酸化、酸性リソソーム酸性厳しい7,8,9,10への適応のための放出。しかし、どの細胞の酸性化を通じたメカニズム、がん行動と酸性 pH 腫瘍微小環境における規制当局が完全に決定されていないキーの id。さらに、いくつかのレポートの重炭酸塩、トリス、パイプ、および HEPES バッファーまたは乳酸と HCl、不明瞭な濃度を使用して様々 な酸性 pH メディアが中も包括的な調整後の安定性を示す報告は少ないいくつかの異なる酸性培地7,8,9,10の比較
主調整装置と細胞の酸性化のコンテキストでがん細胞の代謝変化を解明するには、酸性 pHe を維持するために単純な体外培養モデルを設立しを癌細胞11pHe の役割を検討しました。37 ° C 未満 5%、6.8 の pHe と酸性培を維持してこのメソッドを使用すると、CO2培養液の減少の重炭酸濃度を使用しています。pH 7.4 は、通常どおりに使用され、媒体を制御します。培地の pH は、少なくとも 24 時間持続され、72 h PANC-1 および AsPC 1 膵臓癌細胞の培養中に徐々 に減少します。削減するのではなく、乳酸を追加することによって乳酸性アシドーシスを模倣文化方法を確立した解糖系が乳酸7,8,9では、陽子だけでなく排泄を加速するため、重炭酸塩の濃度。さらに、中で HCl による酸性 pHe は酸性 pH 培養培地への細胞は重炭酸塩の集中力の低下の原因ではない可能性を除外することが出来ます。また、6.4 〜 7.4 異なる重炭酸塩濃度の pH で様々 なメディアを使用して、我々 は、細胞応答 pHe 影響の程度を評価できます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium&#8220;Nissui&#8221; 2</td>
			<td>Nissui</td>
			<td>05919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>10438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>09367-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>32778-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5%-Trypan Blue Stain Solution</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>29853-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactic acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>18091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green PCR Master Mix&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td>4368702&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AsPC-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMS-6</td>
			<td>JCRB Cell Bank</td>
			<td>JCRB0432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIG</td>
			<td>JCRB Cell Bank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC9</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 5 Real-Time PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>CRL-1682</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of an extracellular acidic ph culture system

腫瘍微小環境、低酸素や栄養飢餓などの条件は、癌の進行や悪性腫瘍で重要な役割を果たします。ただし、腫瘍の積極性とそのメカニズムの解明に酸性細胞外 pH の役割は検討されていない広く低酸素や栄養飢餓状態と比較しています。さらに、酸性細胞外腫瘍微小環境を模倣するように明確に定義された培養法は完全に報告されていません。
重炭酸塩や増加の乳酸培養液中で HCl 濃度酸性細胞外 pH による削減を維持するために単純な体外培養法をご紹介します。培地の pH は少なくとも 24 時間持続され、72 h PANC-1 および AsPC 1 膵臓癌細胞の文化を次によって徐々 に減少します。本研究では 3 つの異なる酸性メディア条件高い pH 応答性遺伝子MSMO1 INSIG1、 IDI1などと比較して低酸素や栄養飢餓.これらの遺伝子の発現は、酸性 pH のマーカーとして使用できます。これらの簡単なテクニックは、酸性腫瘍微小環境下で腫瘍の悪性度の基になるメカニズムを解明するために有益です。したがって、細胞の酸性 pH 文化体制によりがん細胞のみならず、その他酸性障害など糖尿病性ケトアシドーシスに関連して、腎の尿細管細胞など、細胞の細胞の酸性 pH 応答の発見乳酸アシドーシス、腎の尿細管性アシドーシス、呼吸性アシドーシス。

適切な重炭酸濃度を決定するには、0 - 8 mM NaHCO3 (培養液に最終濃度) の範囲で DMEM を作製し、pH 6.4 7.4 (図 1) に至ると培地を準備することに成功しました。固形腫瘍4,5pH 6.8 を細胞外 pH に達することを示す以前のレポートによると 8 mm NaHCO3 (pH 7.4) 制御媒体と 2 mM NaHCO3 (Ph6.8) 媒体と...

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Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

酸性腫瘍微小環境は、腫瘍の進行に重要な役割を果たしています。がん細胞のin vitro での酸性細胞外 pH の効果を評価するためには、単純な酸性文化体制を確立しました。

酸性細胞外 pH 培養系の確立

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

Research

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