Name: establishment of an extracellular acidic ph culture system
Uploaded: 2017-11-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System at JoVE.com

Vi takker medlemmene av delingen av genomet vitenskap og laboratorium for systemer biologi og medisin, RCAST, The University of Tokyo. Vi spesielt takke Dr. H. Aburatani, Dr. T. Kodama, (LSBM, RCAST, The University of Tokyo), Dr. K. Tomizuka, Dr. T. Yoshida og Dr. A. Kunisato (Kyowa Hakko Kirin co, Ltd) for nyttig diskusjoner og støtte. Dette arbeidet ble delvis støttet av Grant-in-Aid for unge vitenskapsmannen (A) (26710005, to), Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning på nyskapende områder (26116711 og 16 H 01567, to), og Grant-in-Aid for utfordrende Utforskende forskning (16K 14605, to) fra Kunnskapsdepartementet, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan, Takeda Science Foundation (to), Kobayashi grunnlaget for kreftforskning (to) og prosjektet for kreftforskning og Terapeutiske evolusjon (P-opprette) og praktisk forskning for nyskapende Cancer Control fra Japan byrå for medisinsk forskning og utvikling, AMED (to).

1. utarbeidelse av Sure kultur Medium
<ol><li>
Utarbeidelsen av kontroll (pH 7.4) og lav-pH (pH 6.8) kultur medium
	<ol>
<li>Oppløse 4.75 g DMEM vaskemiddel uten L-glutamin i 500 mL vann.</li>
		<li>Forberede 0,33 M NaHCO3 -løsning i en presset stramme flaske. Advarsel: Det er viktig å bruke en trykket tett flaske siden NaHCO3 avgir CO2 gass når oppvarmet og termisk nedbrutt.</li>
		<li>Autoclave mediet og løsning. Tillate buffere til å avkjøles til 25 ° C.</...

<ol>
	<li>Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cancer+cell+metabolism.">Regulation of cancer cell metabolism.</a> Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).</li><li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression.">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li><li>Hsu, P. P., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+metabolism:+Warburg+and+beyond.">Cancer cell metabolism: Warburg and beyond.</a> Cell. 134 (5), 703-707 (2008).</li><li>Gerweck, L. E., Seetharaman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pH+gradient+in+tumor+versus+normal+tissue:+potential+exploitation+for+the+treatment+of+cancer.">Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer.</a> Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).</li><li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+pH:+a+perfect+storm+for+cancer+progression.">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).</li><li>Gatenby, R. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+do+cancers+have+high+aerobic+glycolysis?.">Why do cancers have high aerobic glycolysis?.</a> Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).</li><li>McBrian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+regulates+intracellular+pH.">Histone acetylation regulates intracellular pH.</a> Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).</li><li>Damaghi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+acidosis+in+the+tumour+microenvironment+selects+for+overexpression+of+LAMP2+in+the+plasma+membrane.">Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane.</a> Nat Commun. 6, 8752 (2015).</li><li>Corbet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidosis+Drives+the+Reprogramming+of+Fatty+Acid+Metabolism+in+Cancer+Cells+through+Changes+in+Mitochondrial+and+Histone+Acetylation.">Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation.</a> Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).</li><li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+analysis+of+lactic+acidosis+and+acidosis+response+in+human+cancers.">The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers.</a> PLoS genetics. 4 (12), e1000293 (2008).</li><li>Kondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Acidic+pH+Activates+the+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein+2+to+Promote+Tumor+Progression.">Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression.</a> Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).</li></ol>

Her beskrev vi en enkel surt pH kultur-systemet og vurdering prosessen. Kombinasjonen av tre metoder for middels forsuring, dvs, redusert bikarbonat konsentrasjon, laktat tillegg og HCl tillegg mulig for oss å undersøke pH-svar-mekanisme grundig og sammenligne cellulær respons på andre svulst microenvironmental forhold som hypoksi eller næringsstoff sult.
Nøkkelen til denne metoden er å finne de riktige konsentrasjonene av bikarbonat, laktat og HCl i kultur medium. Måle middel...

Svulst-microenvironment spiller viktige roller i svulst progresjon og kreft celle metabolisme1,2,3. Kreftceller er ofte utsatt for forhold som hypoksi, Nærings deprivasjon og surt ekstracellulære pH (pHe). Men rollen pHe i svulst progresjon er ikke avklart så mye som hypoksi eller næringsstoff sult. PHe i tumor vev kan bli syreholdig, nå ca pH 6.84,5. Surt pH oppstår fra aerob og anaerob glycolytic utskillelse av protoner (H+) og laktat av voksende kreft celler5,6.
Studier viste at syrlig pHe-indusert histone deacetylation og fettsyrer oksidasjon exocytosis surt lysosomer for tilpasning til alvorlig syreholdig miljø7,8,9,10. Imidlertid påvirker mekanismer gjennom hvilke ekstracellulære forsuring kreft atferd og identiteten til nøkkelen regulatorer i surt pH svulst microenvironment ikke er fullstendig klarert. Videre flere rapporter beskrives ulike surt pH medier bruker uklart konsentrasjoner av bikarbonat, Tris, rør og HEPES buffer eller laktat og HCl, men det er noen rapporter å vise stabiliteten til de mellomstore eller omfattende sammenligning av flere forskjellige surt kultur medier7,8,9,10
For å belyse sentrale regulatorer og metabolske forandringer i kreftceller i sammenheng med ekstracellulære forsuring, vi etablert en enkel i vitro kultur modell for å opprettholde en syrlig pHe og undersøkt rollen pHe i kreft celler11. På denne måten, vi holdt et surt kultur medium med en pHe av 6,8 på 37 ° C under 5% CO2, med redusert bikarbonat konsentrasjoner i kultur medium. pH 7.4 ble brukt som normalt og kontrollere medium. Middels pH var vedvarende minst 24 timer og gradvis redusert med 72 h under kultur av PANC-1 og AsPC-1 kreft i bukspyttkjertelen celler. Fordi forbedret Glykolysen akselererer utskillelse av ikke bare protoner, men også laktat7,8,9, vi også etablert en kultur metode mimicking laktat-indusert acidose ved å legge til laktat i stedet for å redusere den bikarbonat konsentrasjon. I tillegg tillater HCl-indusert surt pHe i medium oss å utelukke muligheten for at mobilnettet Svar å surt pH kultur medium ikke er grunn til en redusert konsentrasjon av bikarbonat. Videre kan bruker ulike medier med en pH på 6.4 til 7.4 med forskjellige bikarbonat konsentrasjon, vi vurdere omfanget av pHe effekter på mobilnettet svar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium&#8220;Nissui&#8221; 2</td>
			<td>Nissui</td>
			<td>05919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>10438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>09367-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>32778-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5%-Trypan Blue Stain Solution</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>29853-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactic acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>18091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green PCR Master Mix&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td>4368702&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AsPC-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMS-6</td>
			<td>JCRB Cell Bank</td>
			<td>JCRB0432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIG</td>
			<td>JCRB Cell Bank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC9</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 5 Real-Time PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>CRL-1682</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of an extracellular acidic ph culture system

For svulst microenvironment, som hypoksi eller næringsstoffer sult, spiller viktige roller i kreft progresjon og kreft. Men er rollen surt ekstracellulære pH i tumor aggressivitet og dens underliggende mekanismen ikke mye studert sammenlignet med hypoxic eller næringsstoffer sult forhold. I tillegg har en veldefinert kultur metode å etterligne den sure ekstracellulære svulst microenvironment ikke fullt rapportert.
Her presenterer vi en enkel i vitro kultur metode for å opprettholde surt ekstracellulære pH bruker redusert bikarbonat og økt laktat eller HCl konsentrasjoner i kultur medium. Middels pH var vedvarende minst 24 timer og gradvis redusert med 72 h etter kultur av PANC-1 og AsPC-1 kreft i bukspyttkjertelen celler. Tre distinkte surt media betingelser i denne studien svært upregulated pH-responsive gener som MSMO1, INSIG1og IDI1 forhold til hypoksi eller næringsstoffer sult. Oppregulering av disse genene kan brukes som en markør for surt pH. Disse enkle teknikker er gunstig å belyse underliggende mekanismene svulst malignitet under Sure svulst microenvironment. Derfor gjør våre ekstracellulære surt pH kultur-systemet oppdagelsen av mobilnettet surt pH svar ikke bare i kreftceller, men også i primære celler, for eksempel nyre rørformede celler, i forhold til de andre syrlig lidelser inkludert, diabetisk ketoacidose, melkesyreacidose, nedsatt tubulær acidose og respiratoriske acidose.

For å bestemme riktig bikarbonat konsentrasjonen, vi forberedt DMEM på rekke 0 - 8 mM NaHCO3 (siste konsentrasjon i kultur medium) og lyktes i å forberede kultur medier med pH fra 6.4-7.4 (figur 1). Vi forberedt DMEM med 8 mM NaHCO3 (pH 7.4) som kontroll medium og 2 mM NaHCO3 (pH 6.8) som et medium med surt pH i en tidligere rapport sier at ekstracellulære pH når pH 6.8 for solide svulster4,</...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System at JoVE.com

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Sure svulst microenvironment spiller avgjørende roller i svulst progresjon. For å vurdere effekten av surt ekstracellulære pH på kreft celler i vitro, etablerte vi enkel surt kultur systemer.

Etablering av en ekstracellulære surt pH kultur-systemet

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Growing plant cell walls characteristically exhibit a property known as 'acid growth', by which we mean they are more extensible at low pH (&lt; 5) 1. The ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mus embryoutvikling i en Serum-fri Whole Embryo Kultur System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur system for å studere Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

Utvikling av et innlegg Co-kultur System of Two Cellular Typer i fravær av Cell-Cell Kontakt

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Fett kroppen Organ kultur-systemet i Aedes Aegypti, en vektor av Zika Virus

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

Av en klonal kultur av encellede bøye alger

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...

A Triple Culture Cell System Modeling the Human Blood-Brain Barrier

Et trippelkulturcellesystem som modellerer den menneskelige blod-hjernebarrieren

The delivery of drugs to the brain remains a challenge due to the blood-brain barrier's (BBB) highly specific and restrictive properties, which controls ...

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

Tredimensjonalt, serumfritt kultursystem for stamceller med lacrimal kjertel

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture ...