Name: establishment of an extracellular acidic ph culture system
Uploaded: 2017-11-19T14:00:00
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Agradecemos os membros da divisão de ciência do genoma e laboratório de sistemas de biologia e medicina, RCAST, a Universidade de Tóquio. Agradecemos especialmente Dr. H. Aburatani, Dr. T. Kodama, (LSBM, RCAST, a Universidade de Tóquio), Dr. K. Tomizuka, Dr. T. Yoshida e Dr. A. Kunisato (Kyowa Hakko Kirin, Ltd.) para suporte e discussões úteis. Este trabalho foi parcialmente suportado pelo subsídio para jovem cientista (A) (26710005, T.O.), subsídio para a investigação científica em áreas inovadoras (26116711 e 16 H 01567, T.O.) e subsídio para desafiador Pesquisa exploratória (16K 14605, T.O.) do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia do Japão, a Fundação de ciência Takeda (T.O.), Fundação de pesquisa do câncer (T.O.) Kobayashi e o projeto para pesquisa do câncer e Evolução terapêutica (P-criar) e a pesquisa de prática de controle do câncer inovadoras da Agência Japonesa para a pesquisa médica e desenvolvimento, AMED (T.O.).

1. preparação do meio de cultura de ácido
<ol><li>
Preparação do controle (pH 7,4) e o meio de cultura de baixo pH (pH 6,8)
	<ol>
<li>Dissolva 4,75 g de pó DMEM sem L-glutamina em 500 mL de água.</li>
		<li>Prepare a solução de 0,33 M NaHCO3 em uma garrafa de pressão-apertado. Atenção: É importante que utilize uma garrafa de pressão apertado NaHCO3 emite CO2 gás quando aquecido e decomposto termicamente.</li>
		<li>Autoclave a médio e a solução. Per...

<ol>
	<li>Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cancer+cell+metabolism.">Regulation of cancer cell metabolism.</a> Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).</li><li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression.">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li><li>Hsu, P. P., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+metabolism:+Warburg+and+beyond.">Cancer cell metabolism: Warburg and beyond.</a> Cell. 134 (5), 703-707 (2008).</li><li>Gerweck, L. E., Seetharaman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pH+gradient+in+tumor+versus+normal+tissue:+potential+exploitation+for+the+treatment+of+cancer.">Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer.</a> Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).</li><li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+pH:+a+perfect+storm+for+cancer+progression.">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).</li><li>Gatenby, R. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+do+cancers+have+high+aerobic+glycolysis?.">Why do cancers have high aerobic glycolysis?.</a> Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).</li><li>McBrian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+regulates+intracellular+pH.">Histone acetylation regulates intracellular pH.</a> Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).</li><li>Damaghi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+acidosis+in+the+tumour+microenvironment+selects+for+overexpression+of+LAMP2+in+the+plasma+membrane.">Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane.</a> Nat Commun. 6, 8752 (2015).</li><li>Corbet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidosis+Drives+the+Reprogramming+of+Fatty+Acid+Metabolism+in+Cancer+Cells+through+Changes+in+Mitochondrial+and+Histone+Acetylation.">Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation.</a> Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).</li><li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+analysis+of+lactic+acidosis+and+acidosis+response+in+human+cancers.">The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers.</a> PLoS genetics. 4 (12), e1000293 (2008).</li><li>Kondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Acidic+pH+Activates+the+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein+2+to+Promote+Tumor+Progression.">Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression.</a> Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).</li></ol>

Aqui, descrevemos um sistema de cultura simples pH ácido e seu processo de avaliação. A combinação de três métodos de acidificação média, ou seja, concentração de bicarbonato reduzido, adição de lactato e adição de HCl, permitiu-nos investigar o mecanismo de pH-resposta completamente e comparar a resposta celular a outro tumor Microenvironmental condições tais como a fome de hipóxia ou nutriente.
A chave deste método é para determinar as concentrações adequadas ...

O microambiente do tumor tem um papel crítico na progressão do tumor e câncer célula metabolismo1,2,3. As células cancerosas são frequentemente expostas a condições tais como hipóxia, privação de nutrientes e ácido pH extracelular (pHe). No entanto, o papel de pHe em progressão do tumor não foi clarificado tão extensivamente como fome de hipóxia ou nutriente. O pHe no tecido do tumor pode se tornar ácida, atingindo aproximadamente pH 6,84,5. O pH ácido surge da excreção glicolítico aeróbia e anaeróbica de prótons (H+) e lactato pela proliferação do câncer células5,6.
Estudos recentes revelaram que ácida induzida pela pHe histona deacetilação, oxidação do ácido graxo e exocitose de lisossomos ácidos para adaptação ao ambiente ácido grave7,8,9,10. No entanto, os mecanismos através do qual acidificação do extracelular afeta o comportamento do câncer e a identidade da chave reguladores no microambiente do tumor de pH ácido não foram totalmente determinados. Além disso, vários relatos descritos vários meios de pH ácido, usando pouco claras concentrações de bicarbonato, tampão Tris, tubulações e HEPES ou lactato e HCl, mas há poucos relatórios para demonstrar a estabilidade do ajustado média nem abrangente comparação de vários meios distintos de cultura ácida7,8,9,10
Para elucidar os reguladores chaves e alterações metabólicas em células cancerosas no contexto da acidificação do extracelular, que estabeleceu um modelo de cultura simples em vitro para manter um pHe ácida e examinou o papel de pHe em células de câncer11. Usando esse método, mantivemos um meio de cultura ácido com um pHe de 6,8 a 37 ° C abaixo dos 5% CO2, com as concentrações de bicarbonato reduzida do meio de cultura. pH 7,4 utilizou-se como normal e controle médio. O pH médio foi mantido pelo menos 24 h e gradualmente diminuiu 72 h durante a cultura de células de câncer pancreático PANC-1 e 1-AsPC. Porque reforçada glicólise acelera a excreção de prótons, não só mas também lactato7,8,9, estabelecemos também um método de cultura imitando acidose induzida por lactato por adição de lactato, em vez de reduzir o concentração de bicarbonato. Além disso, induzida por HCl Ácido pHe no meio nos permite excluir a possibilidade de respostas celulares ao meio de cultura de pH ácido não são devido a uma concentração reduzida de bicarbonato. Além disso, usando vários meios de comunicação com um pH de 6,4 a 7,4 com concentração diferente de bicarbonato, podemos avaliar a extensão dos efeitos de pHe em respostas celulares.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium&#8220;Nissui&#8221; 2</td>
			<td>Nissui</td>
			<td>05919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>10438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>09367-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>32778-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5%-Trypan Blue Stain Solution</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>29853-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactic acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>18091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green PCR Master Mix&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td>4368702&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AsPC-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMS-6</td>
			<td>JCRB Cell Bank</td>
			<td>JCRB0432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIG</td>
			<td>JCRB Cell Bank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC9</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 5 Real-Time PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>CRL-1682</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of an extracellular acidic ph culture system

Condições do microambiente do tumor, como hipóxia ou inanição nutriente, desempenham um papel crítico na progressão do câncer e malignidade. No entanto, o papel do pH extracelular ácido na agressividade do tumor e seu mecanismo subjacente não foi extensivamente estudado em comparação com as condições de inanição hipóxica ou nutrientes. Além disso, um método de cultura bem definidos para imitar o microambiente do tumor extracelular ácidas não totalmente relatou.
Aqui nós apresentamos um método de cultura simples em vitro para manter o pH extracelular ácido usando reduzido bicarbonato e lactato aumentado ou concentrações de HCl em meio de cultura. O pH médio foi mantido pelo menos 24 h e gradualmente diminuiu de 72 h após a cultura de células de câncer pancreático PANC-1 e 1-AsPC. Três condições distintas mídia ácida neste estudo altamente upregulated pH-responsivo genes tais como MSMO1, INSIG1e IDI1 em comparação com hipoxia ou inanição nutriente. O upregulation destes genes pode ser usado como um marcador de pH ácido. Estas técnicas simples são benéficas para elucidar os mecanismos subjacentes de malignidade do tumor sob o microambiente do tumor ácidas. Portanto, nosso sistema de cultura de pH ácido extracelular permite a descoberta de respostas celulares pH ácido não só nas células cancerosas, mas também em células primárias, tais como células tubulares renais, em relação as outros ácidos distúrbios incluindo, cetoacidose diabética, acidose láctica, acidose tubular renal e acidose respiratória.

Para determinar a concentração de bicarbonato apropriado, estamos preparados DMEM no intervalo de 0 - 8 mM NaHCO3 (concentração final do meio de cultura) e teve sucesso na preparação de meios de cultura com pH variando de 6,4-7,4 (Figura 1). Estamos preparados DMEM com 8mm NaHCO3 (pH 7,4) como um meio de controle e 2mm NaHCO3 (pH 6,8) como um meio com pH ácido de acordo com um relatório anterior, afirmando que o pH ext...

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Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

O microambiente do tumor ácido tem um papel crítico na progressão do tumor. Para avaliar os efeitos do pH extracelular ácido sobre câncer células in vitro, estabelecemos sistemas simples cultura ácidas.

Estabelecimento de um pH extracelular ácido sistema de cultura

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Medição Usina Extensão parede celular (Creep) induzida pelo pH ácido e por Alpha-Expansin

Growing plant cell walls characteristically exhibit a property known as 'acid growth', by which we mean they are more extensible at low pH (&lt; 5) 1. The ...

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