Name: establishment of an extracellular acidic ph culture system
Uploaded: 2017-11-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System at JoVE.com

Agradecemos a los miembros de la división de Ciencias de genoma y laboratorio para Biología de sistemas y medicina, RCAST, la Universidad de Tokio. Agradecemos especialmente al Dr. H. Aburatani, Dr. T. Kodama, (LSBM, RCAST, la Universidad de Tokio), Dr. K. Tomizuka, Dr. T. Yoshida y Dr. A. Kunisato (Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.) para discusiones útiles y apoyo. Este trabajo fue financiado en parte por subvenciones para joven científico (A) (26710005, T.O.), subvenciones para la investigación científica en áreas innovadoras (26116711 y 16 H 01567, T.O.) y subvenciones para difíciles Investigación exploratoria (16K 14605, T.O.) desde el Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología de Japón, la Fundación de ciencia de Takeda (T.O.), la Fundación de Kobayashi de investigación del cáncer (T.O.) y el proyecto de investigación del cáncer y Evolución terapéutica (P-crear) y la investigación práctica para el Control del cáncer innovadoras de Japón Agencia de investigación médica y desarrollo, AMED (T.O.).

1. preparación de medio de cultivo ácidos
<ol><li>
Preparación de control (pH 7.4) y de medio de cultivo de pH bajo (pH 6.8)
	<ol>
<li>Disolver 4,75 g de polvo DMEM sin L-glutamina en 500 mL de agua.</li>
		<li>Preparar 0,33 M NaHCO3 solución en una botella de presión-apretado. PRECAUCIÓN: Es importante utilizar una botella de presión apretado ya que NaHCO3 emite CO2 gas cuando se calienta y se descompone térmicamente.</li>
		<li>Autoclave el medio y la soluc...

<ol>
	<li>Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cancer+cell+metabolism.">Regulation of cancer cell metabolism.</a> Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).</li><li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression.">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li><li>Hsu, P. P., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+metabolism:+Warburg+and+beyond.">Cancer cell metabolism: Warburg and beyond.</a> Cell. 134 (5), 703-707 (2008).</li><li>Gerweck, L. E., Seetharaman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pH+gradient+in+tumor+versus+normal+tissue:+potential+exploitation+for+the+treatment+of+cancer.">Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer.</a> Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).</li><li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+pH:+a+perfect+storm+for+cancer+progression.">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).</li><li>Gatenby, R. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+do+cancers+have+high+aerobic+glycolysis?.">Why do cancers have high aerobic glycolysis?.</a> Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).</li><li>McBrian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+regulates+intracellular+pH.">Histone acetylation regulates intracellular pH.</a> Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).</li><li>Damaghi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+acidosis+in+the+tumour+microenvironment+selects+for+overexpression+of+LAMP2+in+the+plasma+membrane.">Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane.</a> Nat Commun. 6, 8752 (2015).</li><li>Corbet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidosis+Drives+the+Reprogramming+of+Fatty+Acid+Metabolism+in+Cancer+Cells+through+Changes+in+Mitochondrial+and+Histone+Acetylation.">Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation.</a> Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).</li><li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+analysis+of+lactic+acidosis+and+acidosis+response+in+human+cancers.">The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers.</a> PLoS genetics. 4 (12), e1000293 (2008).</li><li>Kondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Acidic+pH+Activates+the+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein+2+to+Promote+Tumor+Progression.">Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression.</a> Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).</li></ol>

Aquí, describimos un sistema de cultivo simple pH ácido y su proceso de evaluación. La combinación de tres métodos de acidificación del medio, es decir, concentración de bicarbonato menor, adición de lactato y adición de HCl, nos permitió investigar el mecanismo de respuesta de pH fondo y comparar la respuesta celular a otro tumor microambiental condiciones como hipoxia o alimento del hambre.
La clave de este método es determinar las concentraciones apropiadas de ácido clo...

El microambiente tumoral juega un papel crítico en la progresión del tumor y cáncer de la célula metabolismo1,2,3. Las células cancerosas a menudo se exponen a condiciones como hipoxia, la privación de nutrientes y pH extracelular ácido (pHe). Sin embargo, el papel de pHe en la progresión tumoral no ha aclarado tan extensivamente como en hambre hipoxia o nutrientes. El pHe en el tejido del tumor puede ser ácida, llegando a aproximadamente pH 6.84,5. El pH ácido se presenta de aeróbica y anaeróbica glicolítica excreción de protones (H+) y lactato por la proliferación del cáncer las células5,6.
Estudios recientes revelaron que histona ácida inducida por pHe desacetilación y oxidación del ácido graso exocitosis de lisosomas ácidas para la adaptación al ambiente ácido fuerte7,8,9,10. Sin embargo, los mecanismos a través de la cual acidificación extracelular afecta comportamiento de cáncer y la identidad de clave de los reguladores en el microambiente tumoral de pH ácido no han sido completamente determinados. Además, varios informes describen varios medios de pH ácido, usando claro concentraciones de bicarbonato, tampón Tris, tubos y HEPES o lactato y ácido clorhídrico, pero hay pocos informes para demostrar la estabilidad de la ajustada media ni integral comparación de varios medios de cultivo ácidos distintos7,8,9,10
Para aclarar los principales reguladores y cambios metabólicos en las células cancerosas en el contexto de acidificación extracelular, estableció un modelo de cultura simple en vitro para mantener un pHe ácido y examinó el papel de pHe en células de cáncer11. Usando este método, mantuvimos un ácido medio de cultivo con un pHe de 6,8 a 37 ° C debajo del 5% CO2, usando las concentraciones de bicarbonato menor en el medio de cultivo. pH 7.4 se utilizó como normal y medio de control. El pH del medio fue sostenido durante al menos 24 h y poco a poco disminuyó en 72 h en cultivo de células de cáncer de páncreas 1 PANC y AsPC-1. Porque glicólisis mejorada acelera la excreción de protones, pero también lactato7,8,9, también estableció un método de cultura mímico acidosis inducida de lactato por la adición de lactato en lugar de reducir la concentración de bicarbonato. Además, inducida por el ácido clorhídrico ácido pHe en el medio nos permite excluir la posibilidad de que las respuestas celulares a pH ácido medio de cultivo no son debido a una disminución de la concentración de bicarbonato. Por otra parte, utilizando distintos medios con un pH de 6.4 a 7.4 con concentración diferente de bicarbonato, podemos evaluar la extensión de efectos de pHe en respuestas celulares.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium&#8220;Nissui&#8221; 2</td>
			<td>Nissui</td>
			<td>05919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>10438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>09367-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>32778-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5%-Trypan Blue Stain Solution</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>29853-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactic acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>18091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green PCR Master Mix&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td>4368702&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AsPC-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMS-6</td>
			<td>JCRB Cell Bank</td>
			<td>JCRB0432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIG</td>
			<td>JCRB Cell Bank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC9</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 5 Real-Time PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>CRL-1682</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of an extracellular acidic ph culture system

Condiciones del microambiente tumoral, tales como hipoxia o nutrientes hambre, juegan un papel crítico en la progresión del cáncer y la malignidad. Sin embargo, el papel del pH extracelular ácido en la agresividad del tumor y su mecanismo subyacente no ha sido extensivamente estudiado en comparación con las condiciones de hambre hipóxico o nutrientes. Además, un método de cultivo bien definidas para imitar el microambiente tumoral extracelular ácido no se ha completamente divulgado.
Aquí presentamos un método de cultivo simple en vitro para mantener el pH extracelular ácido utilizando reducción bicarbonato y lactato aumento o concentración de HCl en el medio de cultivo. El pH del medio fue sostenido durante al menos 24 h y poco a poco disminuyó en 72 h después de cultivo de células de cáncer de páncreas 1 PANC y AsPC-1. Tres condiciones de distintos medios ácidos en este estudio muy upregulated genes pH-sensibles tales como MSMO1, INSIG1y IDI1 compararon con hipoxia o hambre de nutrientes. La regulación al alza de estos genes puede utilizarse como marcador de pH ácido. Estas técnicas sencillas son beneficiosas para dilucidar los mecanismos subyacentes de la malignidad del tumor en el microambiente tumoral ácidos. Por lo tanto, nuestro sistema de cultura extracelular pH ácido permite descubrimiento de respuestas celulares de pH ácido en las células cancerosas, pero también en células primarias, como las células tubulares renales, en relación con los otros ácidos trastornos incluyendo, cetoacidosis diabética, acidosis láctica, la acidosis tubular renal y acidosis respiratoria.

Para determinar la concentración adecuada de bicarbonato, preparamos DMEM en el rango de 0 - 8 mM NaHCO3 (concentración final en el medio de cultivo) y tuvo éxito en la preparación de medios de cultivo con pH entre 6.4-7.4 (figura 1). Preparamos DMEM con 8 mM NaHCO3 (pH 7.4) como medio de control y 2 mM NaHCO3 (pH 6.8) como un medio con pH ácido, según un informe anterior indicando que el pH extracelular llegue a pH 6.8 ...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System at JoVE.com

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

El microambiente tumoral ácida juega un papel crítico en la progresión tumoral. Para evaluar los efectos del pH extracelular ácido en las células de cáncer in vitro, hemos establecido sistemas de cultivo ácidos simples.

Establecimiento de un pH extracelular ácido sistema de cultivo

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Celda de medición Planta de Extensión de la pared (creep) inducida por el pH ácido y por Alfa-expansina

Growing plant cell walls characteristically exhibit a property known as 'acid growth', by which we mean they are more extensible at low pH (&lt; 5) 1. The ...

Investigación

Biología

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Un Ex-ovo</emPollo> Embrión de cultivo apropiado para aplicaciones de imagen y sistema de Microcirugía

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

El método de cultivo de embriones de roedores enteros utilizando el sistema de tipo de botella rotador Cultura

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Embriones de ratón con el desarrollo en todo un sistema de cultivo de embriones sin suero

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sistema de Cultura para estudiar el desarrollo de la tiroides

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

Desarrollo de un Sistema de inserción Co-cultivo de dos tipos celulares en ausencia de la célula-célula Contacto

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Sistema de cultivo de órganos de grasa corporal en Aedes Aegypti, Vector del Virus Zika

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

Establecimiento de una cultura clónica de algas unicelulares de conjugación

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...

A Triple Culture Cell System Modeling the Human Blood-Brain Barrier

Un sistema celular de triple cultivo que modela la barrera hematoencefálica humana

The delivery of drugs to the brain remains a challenge due to the blood-brain barrier's (BBB) highly specific and restrictive properties, which controls ...

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

Sistema de cultivo tridimensional sin suero para células madre de la glándula lagrimal

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture ...