Name: establishment of an extracellular acidic ph culture system
Uploaded: 2017-11-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System at JoVE.com

Vi tackar medlemmarna av avdelningen av genomet teknik och laboratorium för systembiologi och medicin, RCAST, The University of Tokyo. Vi särskilt tacka Dr H. Aburatani, Dr. T. Kodama, (LSBM, RCAST, The University of Tokyo), Dr K. Tomizuka, Dr. T. Yoshida och Dr A. Kunisato (Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.) för bra diskussioner och stöd. Detta arbete var delvis stöds av bidrag för unga forskare (A) (26710005, T.O.), bidrag för vetenskaplig forskning på innovativa områden (26116711 och 16 H 01567, T.O.) och bidrag för utmanande Grundforskning (16K 14605, T.O.) från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknologi av Japan, Stiftelsen Takeda vetenskap (T.O.), Kobayashi grunden för cancerforskning (T.O.) och projektet för cancerforskning och Terapeutiska Evolution (P-skapa) och praktisk forskning för innovativa cancerkontroll från Japan byrån för medicinsk forskning och utveckling, AMED (T.O.).

1. beredning av sura odlingsmedium
<ol><li>
Beredning av kontroll (pH 7,4) och låg-pH (pH 6,8) odlingsmedium
	<ol>
<li>Lös 4,75 g DMEM pulver utan L-glutamin i 500 mL vatten.</li>
		<li>Förbereda 0,33 M NaHCO3 lösning i en trycktäta flaska. Varning: Det är viktigt att använda en trycket snäva flaska eftersom NaHCO3 avger CO2 gas när uppvärmd och termiskt nedbrutet.</li>
		<li>Autoklav medium och lösning. Tillåt dessa buffertar svalna till 25 ° C.</li>
		...

<ol>
	<li>Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cancer+cell+metabolism.">Regulation of cancer cell metabolism.</a> Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).</li><li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression.">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li><li>Hsu, P. P., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+metabolism:+Warburg+and+beyond.">Cancer cell metabolism: Warburg and beyond.</a> Cell. 134 (5), 703-707 (2008).</li><li>Gerweck, L. E., Seetharaman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pH+gradient+in+tumor+versus+normal+tissue:+potential+exploitation+for+the+treatment+of+cancer.">Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer.</a> Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).</li><li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+pH:+a+perfect+storm+for+cancer+progression.">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).</li><li>Gatenby, R. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+do+cancers+have+high+aerobic+glycolysis?.">Why do cancers have high aerobic glycolysis?.</a> Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).</li><li>McBrian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+regulates+intracellular+pH.">Histone acetylation regulates intracellular pH.</a> Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).</li><li>Damaghi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+acidosis+in+the+tumour+microenvironment+selects+for+overexpression+of+LAMP2+in+the+plasma+membrane.">Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane.</a> Nat Commun. 6, 8752 (2015).</li><li>Corbet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidosis+Drives+the+Reprogramming+of+Fatty+Acid+Metabolism+in+Cancer+Cells+through+Changes+in+Mitochondrial+and+Histone+Acetylation.">Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation.</a> Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).</li><li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+analysis+of+lactic+acidosis+and+acidosis+response+in+human+cancers.">The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers.</a> PLoS genetics. 4 (12), e1000293 (2008).</li><li>Kondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Acidic+pH+Activates+the+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein+2+to+Promote+Tumor+Progression.">Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression.</a> Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).</li></ol>

Här beskrivs vi ett enkelt sura pH kultur system och dess utvärderingsprocessen. Kombinationen av tre metoder för medelstora försurning, dvs, minskad bikarbonat koncentration, laktat tillägg och HCl dessutom möjliggjort att grundligt utreda den pH-svarsmekanism och jämföra den cellulära svaren på andra tumör microenvironmental villkor såsom hypoxi eller näringsämne svält.
Nyckeln till denna metod är att fastställa de lämpliga koncentrationerna av bikarbonat, laktat o...

Den tumör mikromiljö spelar avgörande roller i tumör progression och cancer cell metabolism1,2,3. Cancercellerna utsätts ofta för villkor som hypoxi, näringsämne deprivation och sura extracellulära pH (pHe). Dock rollen som pHe i tumör progression inte har klargjorts så stor utsträckning som i hypoxi eller näringsämne svält. PHe i tumörvävnad kan bli sura, når cirka pH 6,84,5. Sura pH-värde uppstår från aerob och anaerob glycolytic utsöndring av protons (H+) och laktat av prolifererande cancer celler5,6.
Senare studier visade att sura pHe-inducerad Histon deacetylering, fettsyra oxidation och exocytos av sura lysosomer för anpassning till den svåra sura miljö7,8,9,10. Mekanismerna genom vilka extracellulära försurning påverkas emellertid cancercellers beteende och identitet nyckel tillsynsmyndigheter i den sura pH tumör närmiljön inte har fastställts fullständigt. Dessutom flera rapporter beskrivs olika sura pH media med oklart koncentrationer av bikarbonat, Tris, rör och HEPES buffert eller laktat och HCl, men det finns några rapporter om att demonstrera stabiliteten i den justerade medium eller heltäckande jämförelse av flera distinkta sura kultur media7,8,9,10
För att belysa de viktigaste regulatorer och metabola förändringar i cancerceller i samband med extracellulära försurning, vi etablerade en enkel i vitro kultur modell för att upprätthålla en sura pHe och undersökte pHe i cancer celler11roll. Med den här metoden vi upprätthållit en sura odlingsmedium med en pHe på 6,8 vid 37 ° C under 5% CO2, med minskad bikarbonat koncentrationer i odlingssubstratet. pH 7,4 användes som vanligt och styra medium. Medelstora pH var kvarstod under minst 24 h och gradvis minskade med 72 h under kultur PANC-1 och AsPC-1 pankreascancer celler. Eftersom ökad glykolys påskyndar utsöndringen av inte bara protoner men också laktat7,8,9, vi också etablerat en kultur metod härma laktat-inducerad acidos genom att lägga till laktat i stället för att minska den bikarbonat koncentration. Dessutom, tillåter HCl-inducerad sura pHe på medellång oss att utesluta möjligheten att cellulära svar till sura pH odlingssubstratet inte är på grund av en minskad koncentration av bikarbonat. Dessutom kan använder olika medier med ett pH på 6,4-7.4 med olika bikarbonat koncentration, vi bedöma omfattningen av pHe effekter på cellulära svar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium&#8220;Nissui&#8221; 2</td>
			<td>Nissui</td>
			<td>05919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>10438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>09367-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>32778-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5%-Trypan Blue Stain Solution</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>29853-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactic acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>18091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green PCR Master Mix&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td>4368702&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AsPC-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMS-6</td>
			<td>JCRB Cell Bank</td>
			<td>JCRB0432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIG</td>
			<td>JCRB Cell Bank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC9</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 5 Real-Time PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>CRL-1682</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of an extracellular acidic ph culture system

Villkoren för den tumör närmiljön, såsom hypoxi eller näringsämnen svält, spela avgörande roller i cancer progression och malignitet. Dock har rollen som sura extracellulära pH i tumör aggressivitet och dess underliggande mekanismen inte studerats jämfört med hypoxisk eller näringsämnen svält villkor. Dessutom har en väl definierade kultur metod att efterlikna den sura extracellulära tumör närmiljön inte fullt rapporterats.
Här presenterar vi en enkel i vitro kultur metod för att bibehålla sura extracellulära pH med nedsatt bikarbonat och ökad laktat eller HCl koncentrationer i odlingssubstratet. Medelstora pH var kvarstod under minst 24 h och gradvis minskade med 72 h efter kultur PANC-1 och AsPC-1 pankreascancer celler. Tre distinkta sura media villkor i denna studie högt uppreglerad pH-lyhörd gener såsom MSMO1, INSIG1och IDI1 jämfört med hypoxi eller näringsämnen svält. Uppreglering av dessa gener kan användas som markör för surt pH. Dessa enkla tekniker är nyttiga att belysa underliggande mekanismer av tumör malignitet under sura tumör mikromiljö. Därför gör vårt extracellulära sura pH kultur system upptäckten av cellulära sura pH svaren inte bara i cancerceller utan också i primära celler, renal tubulär celler, i förhållande till de andra sura sjukdomar inklusive, diabetisk ketoacidos, laktacidos, renal tubulär acidos och respiratorisk acidos.

För att avgöra lämpliga bikarbonat koncentrationen, vi förberett DMEM på rad 0 - 8 mM NaHCO3 (slutlig koncentration i odlingsmediet) och lyckats förbereda kultur media med pH alltifrån 6,4-7,4 (figur 1). Vi förberett DMEM med 8 mM NaHCO3 (pH 7,4) som en kontroll medium, och 2 mM NaHCO3 (pH 6,8) som medium med sura pH enligt en tidigare rapport anger att extracellulära pH når pH 6,8 för solida tumörer<sup class="xre...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System at JoVE.com

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Den sura tumör mikromiljö spelar avgörande roller i tumör progression. För att bedöma effekterna av surt extracellulära pH på cancer celler in vitro etablerade vi enkla sura kultur system.

Inrättandet av en extracellulär sura pH kultur System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Mätning Plant Cell Wall Extension (Creep) induceras av surt pH-värde och Alpha-Expansin

Growing plant cell walls characteristically exhibit a property known as 'acid growth', by which we mean they are more extensible at low pH (&lt; 5) 1. The ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

En Ex-ovo Kyckling Embryo Culture lämpligt för bildbehandling och mikrokirurgi Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Metoden för Gnagare Hela Embryo Culture med Rotator-typ System Bottle Kultur

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mouse embryonala utveckling i ett serumfritt Hela Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

Ett<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur systemet studerar Thyroid Utveckling

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

Utveckling av en in Co-kultur system av två Cellular typer i frånvaro av cell-cellkontakt

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Fett kroppen kultur organsystem i Aedes Aegypti, en vektor av zikaviruset

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

Inrättandet av en klonal kultur av encelliga konjugera alger

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...

A Triple Culture Cell System Modeling the Human Blood-Brain Barrier

Ett trippelodlingscellsystem som modellerar den mänskliga blod-hjärnbarriären

The delivery of drugs to the brain remains a challenge due to the blood-brain barrier's (BBB) highly specific and restrictive properties, which controls ...

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

Tredimensionellt, serumfritt odlingssystem för lacrimalkörtelstamceller

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture ...